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人白细胞介素-18在大肠杆菌中的高效表达
目的在大肠杆菌中实现人IL-18成熟蛋白(mhIL-18)的高效表达.方法采用RT-PCR由人肝脏Kupffer细胞中扩增mhIL-18基因,构建非融合型原核表达质粒petTT/mhIL-18,转化至大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导重组蛋白表达,超声裂解细胞提取包涵体,采用SDS-PAGE及Western blot分析重组蛋白的表达,包涵体蛋白经8 mol/L尿素溶解,透析复性,ELISA检测重组蛋白诱导人外周血单个核细胞(PBMC)产生IFN-γ的能力.结果所扩增的mhIL-18基因与GenBank公布的序列一到.经IPTG诱导,mhIL-18在大肠杆菌中的表达量占菌体蛋白的40%以上,在细胞中以包涵体形式存在,复性的重组蛋白具有诱生IFN-γ的能力.结论 mhIL-18可在大肠杆菌中高效表达.
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从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位
目的建立一种有效的从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA的方法.方法重组基因工程大肠杆菌发酵后,表达的Hp的HspA 包涵体经洗涤、变性、复性,采用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析分离纯化.使用SDS-PAGE和HPLC检测纯度,选用ELISA和动物实验对纯化蛋白的免疫学活性和生物学活性进行鉴定.结果 Hp的HspA 包涵体经洗涤和溶解后,Hp的HspA的纯度>60%.包涵体溶解液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析后纯度超过95%.Hp的HspA 纯品经检测具有良好的免疫学活性和生物学活性.结论本研究建立的分离纯化方法可从包涵体中获得高纯度的重组HspA蛋白,为进一步的动物实验研究奠定了基础.
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人内皮活化相关新基因eola1的原核表达及鉴定
目的获得内皮高表达脂多糖相关因子1(eola1)表达蛋白并对其进行分析鉴定.方法采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法从人ECV-304细胞中扩增出eola1基因开放阅读框,构建重组质粒,测序鉴定后转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,裂解细菌抽提蛋白,目的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western免疫印迹鉴定.结果测序鉴定eola1开放阅读框成功插入PET-46-EK/LIC质粒;重组质粒在大肠杆菌中成功表达人eola1蛋白,主要以包涵体形式存在,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子质量约20×103,Western blot验证出目的蛋白特异表达.结论应用原核表达系统能够成功获得目的蛋白,为下一步制备eola1单克隆抗体及基因功能研究打下基础.
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关于医学微生物学中包涵体滥用问题的历史溯源和分析
随着对包涵体滥用问题的深入分析,在查阅人民卫生出版社出版的旧版《医学微生物学》有关包涵体是否滥用的过程之中,令人惊奇地发现在各种旧版《医学微生物学》里包涵体滥用的问题同样存在,而简单地将所有旧版《医学微生物学》中有关包涵体滥用都定性为错误,这是不可取和不正确的.故以辩证唯物观、历史唯物观为出发点,以事物普遍联系和发展的学说为根本,对问题的形成进行深入的剖析、溯源.只有在充分认识问题的基础上,才能真正解决包涵体滥用后导致的医学微生物学及相应医学学科构筑的矛盾,纠正包涵体滥用形成的不合理观念,从而避免广大医学同仁的误读、误识.
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关于医学微生物学中包涵体滥用问题的探讨
2008年版<医学微生物学>中包涵体的名词在许多内容中都有引用和叙述,如麻疹病毒,呼吸道合胞病毒、沙眼衣原体,鹦鹉热嗜衣原体等.在阅读有关包涵体内容的记载时,也可发现同样包涵体的称谓在其中存在不同的含义,而事实上包涵体在该书中已作了明确的概念界定,并在多方面存在歧意,这说明了2008年版<医学微生物学>里存在着对包涵体滥用的问题.本文就此问题及其形成的原因进行初步的认识和探讨.
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人EGF受体胞外域在大肠杆菌中表达、复性及抗原性鉴定
目的构建人EGF受体(EGFR)胞外域的原核表达载体并在大肠杆菌中表达,制备EGFR特异性抗体,对表达产物进行鉴定.方法以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码胞外结构域L1、S1、L2 (EGFR-LSL)的DNA片段,并在其3'端加入编码His6标签的序列,与pET-3c连接构建EGFR-LSL原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达;同时以纯化的EGFR L2结构域蛋白(EGFR-L2)制备抗血清,以此抗血清鉴定表达产物.结果 EGFR-LSL在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,抗His6抗体免疫印迹分析表明,表达产物全部以包涵体形式存在,通过Ni2+-NTA柱上复性获得纯化的可溶性EGFR-LSL蛋白;免疫印迹分析表明,EGFR-LSL与小鼠抗EGFR-L2抗血清具有高特异性反应.结论从大肠杆菌中获得具有特异抗原性的可溶性EGFR-LSL蛋白.
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重组人B淋巴细胞刺激因子纯化及其生物活性鉴定
目的获得高纯度和高活性的B淋巴细胞刺激因子.方法重组原核表达载体pQE-80L-BLyS112-285在大肠杆菌DH5α中经IPTG诱导表达rhBLyS112-285,超声碎菌,提取包涵体,经Ni2+-NTA亲和层析和Sephare S-200凝胶过滤层析纯化后,选择不同氧化还原条件进行复性,进而检测其生物学活性.结果得到了有较高纯度和较好生物学活性的rhBLyS112-285蛋白.结论优化了BLyS蛋白的纯化和复性的参数,所获结果为进一步研究创造了条件.
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重组人CD40胞外结构域在大肠杆菌中的表达和纯化鉴定
目的构建人CD40胞外结构域(exCD40)的原核表达载体,获得可溶性产物.方法以RT-PCR方法从人白细胞总RNA中扩增编码CD40胞外区的cDNA,构建羧基端融合His6标签的exCD40的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对表达产物进行复性、纯化和鉴定.结果构建了exCD40的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高表达,M,为23 000,与理论大小相符,表达产物主要存在于包涵体中,经Ni2+-NTA柱上复性和纯化获得纯度达95%的可溶性exCD40蛋白,该蛋白能与细胞上的CD40L结合.结论从大肠杆菌中成功获得具有配基结合活性的可溶性exCD40蛋白.
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抗AIF单链抗体的构建与高效表达
目的获得具有生物活性的抗酸性同功铁蛋白(AIF)单链抗体.方法利用重组噬菌体抗体库技术从杂交瘤细胞4c9中分别克隆小鼠抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,成功构建AIF4c9 scFv基因,并将其亚克隆于原核表达载体pET28a,转化E.coli BL21(DE3),经IPYG诱导表达.表达产物经镍鏊合层析柱复性后,用ELISA和Western blotting检测表达蛋白与AIF的结合特性.结果 AIF4c9 scFv表达蛋白在细胞质中主要以不溶性包涵体形式存在,优化后的柱内复性程序可从高浓度的包涵体变性蛋白中高效复性AIF4c9 scFv表达蛋白,其回收率可达75%左右.AIF4c9 scFv复性蛋白可特异识别AIF抗原,具有良好的AIF抗体活性,其亲和力常数(KDscFv)为7.29×10-8mol/L.表达菌体的功能性AIF4c9 scFv抗体产量约为62 mg/L.结论在大肠杆菌中高效表达的抗AIF Scfv经柱内复性后具有较好的生物学活性.
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用包涵体复性的方法制备重组人白细胞介素-1受体拮抗剂
通过大肠杆菌将IL-1ra表达成包涵体,将包涵体用8 M尿素溶解后,稀释4倍后直接用离子交换柱层析进行复性和纯化,复性后得到的IL-1ra纯度大于95%,生物活性大于1×105 IU/mg,内毒素含量也比较低.Western-Blotting印迹也表明重组蛋白具有IL-1ra的抗原活性.
关键词： 白细胞介素-1受体拮抗剂 复性 包涵体 层析 -
人白细胞介素4的原核表达、复性、纯化及生物学活性鉴定
用PCR方法从pORF-hIL4质粒中扩增重组人白细胞介素4(hIL-4)的基因,构建PQE60原核表达载体并诱导其目的蛋白的表达.对表达的目的蛋白的可溶性进行鉴定,发现hIL-4基因表达产物在大肠杆菌中主要以不溶性包涵体形式存在, 经过超声波破细菌、包涵体提取、洗涤处理后,用5 mol/L盐酸胍变性溶解包涵体沉淀,上清稀释复性后透析,再经镍亲和层析进行纯化.纯化后的hIL-4进行TF-1细胞体外增生实验检测其生物学活性后,可用于人外周血树突状细胞的体外诱导培养.
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血管抑制素和内皮抑制素在大肠杆菌中的融合表达与鉴定
血管抑制素(AS)和内皮抑制素(ES)是两种具有较强活性的内源性血管抑制剂,联合应用具有协同作用.本研究通过大肠杆菌表达AS-ES融合蛋白,观察其对血管生成的抑制作用.首先用RT-PCR方法分别获得AS和ES基因,通过基因拼接获得融合基因,构建了含有该融合基因的原核表达质粒--pET-42(b)/AS-ES.表达菌株经IPTG诱导后目的蛋白以包涵体形式表达,表达量为14%,分子量约65 KD.Western blotting检测表明表达产物可分别与AS和ES抗体产生特异的免疫反应.经复性、肝素亲和层析柱纯化的表达产物对鸡胚尿囊膜血管有明显抑制作用.本研究获得了AS、ES在大肠杆菌中的融合表达,目的蛋白具有特异的免疫反应性和血管抑制活性.
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大肠杆菌表达的人源性抗CTLA4单链抗体三种复性方法比较
比较表达于大肠杆菌中的人源性抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4单链抗体(Anti-CTLA4 scFv)的三种体外复性方法的复性效率.稀释、透析和亲和柱上三种复性方式复性Anti-CTLA4 scFv,采用Bradford法分析蛋白复性得率,采用间接细胞ELISA法检测所得蛋白的活性.透析复性蛋白得率高,稀释复性蛋白得率其次,亲和柱上复性蛋白得率低;透析复性所得蛋白结合活性是稀释复性的1.95倍,是亲和柱上复性所得蛋白活性的4.13倍(无谷胱甘肽氧化还原对GSH/GSSH)及3.63倍(有GSH/GSSH).结论:采用含0.15 mol/L NaCl、1 mmol/L GSSH和3 mmol/L GSH的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液作为Anti-CTLA4 scFv的复性液,4℃下透析复性48 h,可获得较高复性得率和结合活性.
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Chediak-Higashi综合征一例
患儿女,5岁.因发热伴双颈后肿胀5天,抽搐1次入院.平时畏光,日晒后双颊部变黑,头发变灰,有银光.易感冒,患肺炎两次.父母健康,家系中无类似患者.查体:T38.1℃,急性病容,神志恍惚,较烦躁.皮肤偏白,头发、眉毛、睫毛呈灰白色,全身浅表淋巴结肿大,以颈后淋巴结肿大明显,双侧扁桃体肿大,右侧有脓性分泌物,心肺无异常,肝肋下5 cm,脾肋下6 cm,四肢肌张力正常,时有双手震颤.实验室检查:Hb 72 g/L,WBC 3.0×109/L,N 0.74,L 0.24,变异淋巴细胞0.02,PC 32×109/L.骨髓检查:粒系统增生显著,多数细胞浆内见大小不等、从淡紫色到深紫色包涵体,各阶段细胞均有吞噬血细胞现象,淋巴细胞比例正常,胞浆内易查见颗粒状包涵体,单核巨噬细胞内亦见紫色包涵体.POX染色:包涵体成强阳性反应.颈部淋巴结活检示:组织细胞吞噬红细胞及包涵体现象较明显.眼科会诊:双眼虹膜色素不均匀脱落,眼底视网膜色淡,呈青灰.临床 四川省人民医院儿科成都,610072
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重组人干细胞因子/血小板生成素融合蛋白的纯化及复性研究
目的探讨重组人干细胞因子/血小板生成素(SCF-TPO)融合蛋白纯化及复性的佳方法.方法裂解法提取包涵体,在变性条件下利用金属螯和层析获得融合蛋白,经透析及谷胱甘肽氧化还原法对纯化的融合蛋白进行复性.结果获得具有初步生物学活性的SCF-TPO融合蛋白,其纯度高达90%.结论该纯化方法操作简捷,特异性高,纯化效果好,获得率高.
关键词： 人干细胞因子/血小板生成素融合蛋白 包涵体 纯化 复性 -
长效重组人胰岛素原类似物的高密度细胞培养的研究
本文以长效重组人胰岛素原类似物(SⅡA-0801)的大肠埃希菌工程菌为研究对象,针对采用高细胞密度培养技术表达包涵体重组融合蛋白的关键参数,重点研究了诱导培养基成份(包括碳源、氮源、无机盐、微量元素)、种子细胞密度、IPTG诱导剂的加入量及诱导时间,诱导温度等因素与包涵体表达产量的相关性.结果 发现其融合蛋白的佳表达培养基:1.5%蛋白胨,1%酵母粉,0.5%NaCl,0.8%葡萄糖和0.2%磷酸盐缓冲液(22mmol/L KH_2PO_4,40mmol/L K_2HPO_4).佳诱导表达条件为:25%接种量,诱导温度37℃,接种培养1h后添加0.5mmol/L IPTG,继续诱导培养5h,发酵培养的总周期为6h.优化后的培养条件比传统的LB培养基及培养方法,其产量提高了6倍多.该结果为长效重组人胰岛素原类似物(SⅡA-0801)后续的生产工艺研究提供了重要的参考依据.
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结核分枝杆菌包涵体蛋白Rv3480c的克隆、表达与纯化
目的 应用分子生物学技术对结核分枝杆菌重组抗原Rv3480c基因进行克隆、表达和纯化.方法 以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv基因组为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增,克隆Rv3480c基因片段,产物经验证后与载体质粒pET28a连接重组质粒,将验证构建成功的重组质粒转化入表达宿主E.coli BL21(DE3)菌体内,经异丙基半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,溶解包涵体,并通过多次低温冻融、不同浓度尿素复性方法进行包涵体蛋白质的纯化.结果 扩增后基因电泳试验及测序证实成功重组目的基因,用尿素溶液和磷酸盐缓冲液(PBS)透析和纯化重组蛋白,Western-Blot证实成功重组结核分枝杆菌抗原Rv3480c.结论 应用分子生物学技术成功获得结核分枝杆菌Rv3480c蛋白,为其结构和功能的进一步研究奠定了基础,并为包涵体蛋白的纯化提供了新的技术思路.
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急性下呼吸道感染尿包涵体阳性118例临床分析
为了探讨下呼吸道感染中巨细胞病毒(CMV)的感染防治措施,笔者对118例尿包涵体阳性病例进行了分析,现报告如下.
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性病门诊患者使用CC法和QV法检测衣原体的结果比较分析
沙眼衣原体(CT)在性传播疾病(STD)中占非常重要的地位,其中非淋菌性尿道炎(NGU)40～50%由沙眼衣原体引起,检查衣原体的方法有多种:可以对细胞涂片做姬姆萨(Giemsa)染色;也可以做直接免疫荧光检查标本中有无感染衣原体包涵体或原体.
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链亲和素-补体3d(SA-C3d)融合蛋白的制备及其功能检测
目的 原核表达链亲和素-补体3d(SA-C3d)融合蛋白,体外探索蛋白活性.方法 以C3 cDNA为模板扩增出C3d段DNA,使用一步克隆法将C3d段与酶切后的质粒pET-24a-6His-SA-IL15相连,获得SA-C3d原核表达质粒.将测序正确的质粒转化入表达感受态大肠杆菌Rosetta中,诱导蛋白表达.使用镍柱亲和层析及梯度逐级减低的变性剂脲素透析复性的方法获得目的蛋白.通过锚定生物素化的MB49细胞实验反映SA的功能,通过促进Raji细胞生长的实验检测C3d的功能.结果 成功构建SA-C3d原核表达质粒,通过镍柱纯化与透析复性获得高纯度目的蛋白.该蛋白特异性的与生物素化的MB49细胞结合,促进Raji细胞增殖并呈现剂量依赖效应,体现蛋白SA-C3d具有双功能活性.结论 成功制备的SA-C3d融合蛋白可在体外与生物素化的MB49细胞结合并促进Raji细胞增殖.
关键词： 链亲和素-补体3d(SA-C3d) 包涵体 原核表达 MB49细胞
