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突触核蛋白病中α-syn聚集及播散的机制研究
突触核蛋白病(α-synucleinopathy)是一类以大脑中不同类型α-突触核蛋白(α-synuclein,简称α-syn)阳性包涵体为病理特征的神经变性疾病,包括帕金森病、路易体痴呆、多系统萎缩及其他含a-突触核蛋白病理的少见疾病.其中,帕金森病和路易体痴呆的标志是脑干或皮质Lewy小体,而多系统萎缩则表现为少突胶质细胞和神经元的胞浆包涵体[1].
关键词： 突触核蛋白病 a-synuclein 包涵体 聚集 播散 -
多系统萎缩的诊断进展
1960年,Shy和Drager描述了2例全面性自主神经衰竭和其他中枢、外周神经系统表现的病人,命名Shy-Drager综合征(SDS).近来研究显示其与散发性橄榄-桥脑-小脑萎缩(OPCA)、纹状体黑质变性(SND)均为神经变性疾病,病理证实三者有同样的神经组织胞质内包涵体〔1〕,且三者在发展到后期,临床表现有重叠,统称为多系统萎缩(multiple system at rophy MSA).
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S.suis 2溶血素SLY的分子克隆及溶血活性和免疫学特性研究
目的 克隆并表达猪链球菌2型(S.suis 2)溶血素重组蛋白SLY,对其溶血活性及免疫学特性进行研究,为探讨SLY在S.suis 2感染中的致病机理及筛选有效的疫苗预防和控制猪链球菌病奠定基础.方法 对S.suis 2 05ZYH33全基因序列进行生物信息学分析,构建pET32a sly原核表达质粒并诱导表达出S.suis 2重组溶血素SLY蛋白;采用高浓度尿素裂解包涵体和His-Tag亲和层析对重组SLY蛋白进行纯化并复性;免疫保护实验检验SLY的免疫保护作用.结果 SDS-PAGE显示70 kD的SLY蛋白条带;重组SLY蛋白具有溶血活性并受多种因素的影响;SLY对感染S.suis 2的Balb/c小鼠有一定的免疫保护作用.结论 优化原核表达体系可以有效提高SLY蛋白的表达量,经提纯并复性的重组SLY具有较高的溶血价,为进一步纯化及分析SLY蛋白的特性提供了必要的前提.
关键词： 猪链球菌2型(S.suis 2) 溶血素SLY 包涵体 溶血活性 -
促进包涵体蛋白复性的几种有效添加剂
利用大肠杆菌高水平表达重组蛋白时,由于缺乏翻译后加工过程,目的蛋白通常以无活性的包涵体的形式产生.在包涵体蛋白复性过程中,溶解的蛋白质容易相互聚集生成沉淀,成为复性技术中难以克服的问题.目前通常的做法是在复性过程中加入适当的添加剂,使其在佳反应条件下促进蛋白质重折叠为活性形式.本文旨在介绍几种有效的促进复性的添加剂及其佳使用条件,为研究者提供一定的借鉴.
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猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立
表达猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用.将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E0基因分别插入原核表达质粒pGEX4T,pET30,pMAL-p2X中,并分别以BL21和BL21-codonplus(DE3)-RP, BL21(DE3)和BL21-codonplus(DE3)-RP,TB1和BL21-codonplus(DE3)-RP为表达菌株.通过摸索IPTG诱导浓度,诱导温度,菌体收获时间,确定E0基因能在pGEX4T/ BL21-codonplus(DE3)-RP和pMAL-p2X/ BL21-codonplus(DE3)-RP中获得高效表达,表达产量分别占菌体总蛋白的15%和30%,表达的重组蛋白主要为包涵体形式.分别采用B-per试剂和超声波裂解配以曲通尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果.使用分步透析法对变性的包涵体进行复性,将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-E0融合蛋白.以GST-E0融合蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础.
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包涵体-犬传染性肝炎病毒形态发生学的重要特征
用免疫金电镜技术和电镜原位杂交技术观察了犬传染性肝炎病毒感染的犬肾传代细胞中的病毒包涵体,发现这些包涵体具有以下三种基本形态:1.松散均质包涵体;2.副结晶色包涵体;3.致密颗粒包涵体.其中前二种包涵体能被免疫金标记,它们是尚未成病毒粒子的病毒蛋白或是病毒装配后乘余的病毒蛋白,后一种包涵体能被病毒DNA探针标记,是病毒核酸合成过剩而堆积起来形成的产物.此外,本文还描述和讨论了包涵体与细胞及病毒发育成熟的关系.
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触核蛋白--神经变性疾病的共同分子机制
神经变性病是一组中老年期发病的严重疾病,尽管其发病机制尚未完全阐明,但其中许多亚型(如帕金森病、阿尔茨海默病Lawy体变异型、多系统萎缩症等)均有一个共同的特征性病理标志:细胞内球状、细丝性包涵体-Lewy体(LBs)以及变性的轴突-Lewy轴索(LNs).所以,有学者将其统称为Lewy体病(LBD).近年来的研究证实,α-触核蛋白不但构成了不同脑区中LBs的主体,而且还涉及神经元的选择性死亡[1,2].
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上期读片窗答案
手术所见肿块包膜较完整,质地中等,内呈鱼肉样,可见出血坏死,行钝性分离后将肿块切除,并行颈部淋巴结清扫术,后转肿瘤科进一步治疗.病理所见:瘤细胞呈多边形,胞浆丰富,嗜酸性,核大,空泡状,核仁大,部分细胞核偏位,可见胞浆内包涵体,细胞弥漫排列(图5).
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重组人白细胞介素10的融合表达及鉴定
目的研究重组人白细胞介素10 (rhIL-10)载体在大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞中的表达, 为进一步研究IL-10在动脉粥样硬化中的作用机制奠定基础.方法用构建成功的IL-10-PCR○ RT7/NT-TOPO○ R质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞,并通过SDS-PAGE鉴定融合表达蛋白.结果 PCR○ RT7/NT-TOPO○ R质粒载体成功载入rhIL-10基因;在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下表达的蛋白质主要以包涵体形式存在.结论在IPTG诱导下, 重组的IL-10-PCR○ RT7/NT-TOPO○ R质粒载体在大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞内成功表达.
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泛素蛋白水解酶体通路与神经系统变性疾病
神经系统变性疾病的一个共同特征就是细胞内与细胞外突变或损害的蛋白异常聚集,导致选择性神经元变性与丢失.泛素蛋白水解酶体通路(UPP)通过泛素依赖的蛋白质水解,在处理受损害的和有毒性的蛋白质方面发挥着重要的作用.目前,在很多神经系统变性疾病中发现UPP通路受到抑制.
关键词： 泛素蛋白水解酶体通路 神经系统变性疾病 蛋白聚集 包涵体 -
小鼠瘦素基因的原核表达及产物纯化
目的 应用大肠杆菌表达系统进行小鼠瘦素基因的克隆、表达、产物纯化与鉴定.方法应用聚合酶链扩增技术,以含有小鼠瘦素cDNA序列的质粒pMET mouse leptin为模板,扩增后克隆至载体pET-28a(+)构建重组表达载体pET-28a-lep,酶切、测序正确后,转化大肠杆菌E. coli BL21,构建工程菌株BL21-pET-lep.使用0.1mmol/L异丙基-硫代半乳糖苷,在不同的时间段诱导蛋白表达,利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳和Western Blotting检测瘦素蛋白的分子质量以及佳表达时间.使用0.5%十二烷基肌氨酸钠溶解包涵体后通过Ni2+亲和层析柱纯化.结果 正确构建了表达载体pET-28a-lep.0.1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导BL21-pET-lep 6 h具有高蛋白表达量,含量占菌体总蛋白的39.2%.SDS-PAGE以及Western Blotting检测显示所表达的小鼠瘦素为携带组氨酸标签的融合蛋白,分子质量约为22.5 kDa.使用Ni2+层析柱纯化后的蛋白纯度为1.086 g/L.结论 应用大肠杆菌原核表达系统成功进行了小鼠瘦素基因的克隆、表达、产物纯化与鉴定.
关键词： 小鼠疫素 包涵体 Western.Blotting 亲和纯化 -
铜绿假单胞菌超广谱β-内酰胺酶编码基因OXA-1表达产物的纯化及复性分析
目的 纯化、复性铜绿假单胞菌携带的OXA-1基因产物并分析其生物学活性.方法 用并丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导OXA-1基因表达,超声处理法裂解包涵体,经低浓度尿素复性、透析纯化,将经过复性、纯化的蛋白加于水解酪蛋白(Mueller-Hinton,MH)琼脂平板药敏纸片上判断蛋白活性.结果 OXA-编码基因产物有β-内酰胺酶活性.结论 获得OXA-1活性蛋白,为进一步研究应用奠定基础.
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散发性包涵体肌炎二例报告
例1,男,58岁,因进行性四肢无力伴言语不清、声音嘶哑、饮水呛咳15年于2000年10月12日入院.曾按慢性格林-巴利综合征给予激素等治疗无效.
关键词： 肌炎 包涵体 病例报告[文献类型] -
人腺苷激酶在大肠杆菌中的表达与纯化
目的 诱导人腺苷激酶组组蛋自在大肠杆菌中表达,并对表达的重组蛋白进行纯化.方法 将由人腺苷激酶基因开放阅读框与原核表达载体pET30a(+)连接构建的重组蛋白表达载体pET30a(+)/ADK转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞.1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达.离心收集菌体后结合使用溶菌酶、冻融和超声破碎的方法裂解菌体.用含2 mol/L和4 mol/L尿素的结合缓冲液洗涤包涵体去除部分杂蛋白.随后用含8 mol/L尿素的结合缓冲液变性溶解剩余包涵体沉淀.用Ni-NTA柱通过亲和层析纯化重组蛋白,用含8 mol/L尿素的洗脱缓冲液洗脱.收集样品透析复性.结果 成功构建人腺苷激酶原核表达载体且目的 蛋白以包涵体形式表达.经包涵体洗涤、变性溶解,亲和层析及分步透析复性获得纯度达85%以上的重组蛋白.结论 人腺苷激酶表达载体的成功构建以及重组蛋白的纯化.为进一步进行其结构和功能的研究奠定了基础.
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包涵体的纯化、复性及其在寄生虫研究中的应用
多种寄生虫基因已在原核表达系统中高水平表达,但多以包涵体的形式存在.本文介绍了包涵体分离纯化与复性技术的主要进展及其在寄生虫血清学诊断、疫苗及基础研究中的应用.
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蛋白酶体抑制剂诱导大鼠黑质变性伴包涵体形成
目的 观察蛋白酶体抑制剂Lactacystin诱导大鼠黑质变性伴包涵体形成及运动行为学的改变,探讨蛋白酶体功能下降在帕金森病(PDl发病机制中的作用. 方法 24只SD大鼠采用随机数字表法分为kactacystin实验组和生理盐水组.每组12只,Lactacystin实验组将蛋白酶体抑制剂Lactacystin立体定向注射人大鼠左侧黑质致密部(SNc).生理盐水组注射等体积生理盐水;观察大鼠自主行为和阿朴吗啡(APO)诱导的旋转行为的改变;Nissl染色法观察SNc病理改变;免疫组化法观察SNc及纹状体酪氨酸羟化酶(TH)和SNc中α-共核蛋白的表达;透射电镜观察SNc超微结构的改变. 结果 Lactacystin实验组大鼠给药7 d后出现自发性活动减少、动作缓慢、震颤、且症状逐步加重.APO可诱导出向健侧的旋转运动;Nissl染色发现Lactacystin实验组左侧SNc神经元数量减少,尼氏体结构松散;免疫组化结果表明21 d后Lactacystin实验组左侧SNc出现变性,TH免疫阳性神经元数量减少,α-共核蛋白表达增强,纹状体内TH免疫阳性纤维数量减少;电镜观察到蛋白质聚集形成的包涵体. 结论 Lactacystin单侧SNc注射可以诱导大鼠黑质变性伴包涵体形成及大鼠行为改变.蛋白酶体功能下降可能在PD发病机制中起重要作用.
关键词： 帕金森病 lactacystin α-共核蛋白 蛋白酶体 包涵体 -
Lactacystin诱导PC12细胞胞内嗜酸性包涵体动态变化的研究
目的 研究蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导PC12细胞胞浆内嗜酸性包涵体的动态变化过程.方法 PC12细胞中加入不同浓度lactacystin(0、5、10、20μmol/L),孵育24 h后行HE染色及α-synuclein免疫组织化学染色,光镜观察包涵体变化;其中10 μmol/L lactacystin组分别于加入lactacystin后24、36、48、72、96和120 h行上述染色法,光镜观察包涵体变化.结果 lacatacystin作用于PC12细胞24 h后,HE染色显示随着浓度增加.胞浆中嗜伊红包涵体数量逐渐增多.0 μmol/L组胞浆中未看到包涵体,5 μmol/L组胞浆中有少量包涵体出现(3.33%±1.15%),10μmol/L组多数细胞胞浆出现典型球状包涵体(71.33%±4.16%),20μmol/L组几乎每个细胞胞浆中均出现嗜伊红包涵体(90.33%±3.21%),个别包涵体游离于细胞外;10 μmol/L组随着时间延长,包涵体逐渐从胞浆中游离至细胞外,其后胞浆逐渐缺失,在96 h和120 h时仅剩余胞核和球状包涵体.免疫组化染色显示:lactacystin作用24 h时,胞浆中α-synuclein免疫反应阳性物质逐渐由散在颗粒逐渐聚集成球状包涵体;随着浓度的增加和时间延长,α-synuclein染色阳性的球状包涵体游走于细胞外,胞浆逐渐缺失,至96 h和120 h时仅剩余胞核和包涵体.结论 lactacystin作用于PC12细胞后,早期在胞浆中出现散在的嗜酸性和α-synuclein免疫反应阳性的颗粒,随着浓度增加和时间延长,颗粒状物质在核旁聚集,终形成固缩的包涵体,细胞外包涵体可独立存在.这种包涵体的动态变化过程与以人类帕金森病为代表的神经变性疾病中的包涵体非常相似,可以作为研究包涵体相关问题的有力工具.
关键词： 蛋白酶体 帕金森病 PC12细胞 包涵体 α-synuclein -
GLP-2融合蛋白的初步纯化
目的 对包涵体的提取,洗涤等融合蛋白的获取条件进行研究,同时初步探索了融合蛋白的酸水解条件.方法 包涵体用TEMFX洗涤1次,0.5％ Triton洗涤4次,加入25％(v/v)的8mol/L尿素变性溶解包涵体沉淀,再进行乙醇分级沉淀.结果 所得融合蛋白纯度达到77.582％.按6％的比例加入60 mmol/L Hcl,50℃、4.8 h基本水解完全.结论 应用本文方法对GLP融合蛋白初步纯化简便可行,为进一步研究奠定必要的基础.
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可溶性预测模型在包涵体复性中的应用
目的 研究包涵体复性后可溶性的预测方法,区分复性类型,提高复性效率.方法 利用可溶性预测模型对43个疾病相关重组蛋白的表达进行预测,并采用双变性-复性方法对表达形成的包涵体进行复性.结果 预测有可溶性表达倾向的14个蛋白表达的包涵体.复性后均收率高、可溶性好.预测为高不溶性表达倾向的29个蛋白.表达的包涵体复性后高收率与低收率并存,对这两种收率包涵体特性的统计学分析显示理论等电点间存在显著性差异(P<0.05).结论 可溶性预测模型叮以应用于区分包涌体复性类型,预测复性后蛋白可溶性,为提高复性效率提供了新方法.同时提示蛋白的理论等电点在模型应用中有重要作用.
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重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究
目的研究重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的佳条件。方法常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得融合蛋白。结果获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。
