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人PTP1B基因cDNA全长的克隆和原核系统表达
目的 构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因cDNA全长的原核表达质粒(pET-28a(+)-hPTP1B)并在大肠杆菌中高效表达.方法 取2型糖尿病人(BMI＞28 kg·m-2)的淋巴细胞提取总RNA,RT-PCR后的扩增产物回收构建克隆载体pMD-hPTP1B,测序后设计带酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ的引物,PCR后酶切连入pET-28a(+)中,转化DE3,IPTG诱导表达,SDS-PAGE后用Western blot检测其特异表达,并进一步对rhPTP1B诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化.结果 测序证实所得的hPTP1BcDNA序列与其在GenBank中的序列一致,重组质粒pET-28a(+)-hPTP1B的双酶切结果与预期大小完全一致,IPTG诱导后高效表达的蛋白质是其不溶性的包涵体形式.IPTG诱导的佳浓度是0.05 mmol·L-1,时间为5 h,温度为37℃.结论 成功克隆了人PTP1B基因,构建了相应的原核表达载体并对原核体系诱导表达的条件进行了优化,使其能在DE3中高效表达,为筛选高特异的小分子抑制剂和制备相应的单克隆抗体打下坚实的基础.
关键词： 蛋白酪氨酸磷酸酶1B cDNA pET-28a(+) 高效表达 包涵体 -
日本斑点热立克次体近缘株重组OmpB蛋白抗原性研究
目的 探讨关于斑点热立克次体的临床诊断及流行病学调查而进行的诊断方法学研究.方法 构建R.Japonica Anhui 120 strain OmpB原核表达质粒,表达、鉴定并纯化重组蛋白,用其作为抗原建立间接ELISA检测方法,检测120份临床样本中日本斑点热立克次体特异性IgG抗体,并评价方法的敏感性和特异性.结果 获得了高表达、高纯度的OmpB重组蛋白,建立的间接ELISA方法体系与美国食品和药物管理局认可的诊断试剂盒相比有良好的特异性和敏感性,两者的特异性为100％,敏感性为96.7％,符合率为99.2％,Kappa值为0.98.结论 OmpB重组蛋白具有很好的免疫反应性,能特异地检出斑点热立克次体IgG抗体,间接ELISA方法可作为临床诊断的技术储备及流行病调查和科学研究.
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人肝细胞核因子-1β基因cDNA全长的克隆与表达
目的 构建人肝细胞核因子-1β (hHNF-1β)基因cDNA全长的原核表达质粒[pET-28a(+)-hHNF-1β]并在大肠杆菌(E.Coli)中高效表达.方法 提取正常成人肝脏组织的总RNA,RT-PCR后的扩增产物回收,构建克隆载体pMD-HNF-1β,设计带酶切位点BamHⅠ和Hind Ⅲ的引物,PCR后酶切连入pET-28a(+)中,转化DE3,测序后IPTG诱导表达,Western blot检测其特异表达,并对重组hHNF-1β(rhHNF-1β)诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化.结果 测序证实所得的hHNF-1β cDNA序列与其在GenBank中的序列一致,重组质粒pET-28a(+)-hHNF-1β的双酶切结果与预期大小完全一致.IPTG诱导的佳浓度是0.04 mmol/L,时间为6 h,温度为37℃.结论 成功克隆和构建了hHNF-1β基因的原核表达载体并对诱导表达的条件进行了优化,为进一步的功能分析奠定基础.
关键词： 肝细胞核因子-1β pET-28a(+) 高效表达 包涵体 -
衣原体的分型、致病性及检测方法比较
1907年、捷克学者Halbersraeder和Prowazek发现沙眼包涵体[1],1956年我国学者汤飞凡等分离沙眼衣原体成功,引起了全世界对其深入研究的关注.研究表明沙眼衣原体与人类疾病关系密切,已成为许多国家和地区常见的性传播疾病病原体,日益引起人们重视.
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猪狂犬病的确证
目的 了解广东省-猪场发生狂犬病猪只的感染状况.方法 采集疑似狂犬病发病猪的大脑、小脑以及海马回,制成切片,用姬姆沙染色,在光学显微镜下检测狂犬病病毒包涵体.用抗狂犬病病毒N蛋白荧光抗体染色,在荧光显徽镜下检测特异荧光.用蛋白酶K处理病料,抽提核酸,以狂犬病病毒N基因特异引物作RT-PCR检测狂犬病病毒特异性核酸.将病料接种小白鼠接毒,观察小鼠的发病.结果 病理学切片检测病猪脑海马神经细胞中有包涵体;脑组织印片经特异性抗狂犬病病毒核蛋白(NP)单克隆抗体免疫荧光染色后,荧光显微镜下可见大量的针尖状绿色荧光颗粒;狂犬病病毒NP特异性目的 基因RT-PCR得到与预期结果大小一致的扩增产物;小白鼠接毒试验,3日龄以内乳鼠接毒后出现特异性的神经症状.结论该猪场病死猪检测狂犬病病毒感染阳性,确定猪群中发生狂犬病.
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钩端螺旋体鞭毛蛋白B(FlaB)基因flaB在大肠杆菌内的表达
目的在大肠杆菌中高效表达钩端螺旋体内鞭毛蛋白(FlaB)用于钩体病的诊断和预防.方法将目的基因flaB定向克隆至原核表达载体pGEX-5T,构建重组融合表达质粒pGF;Western-blot 鉴定其特异性,ELISA法判定其用于钩体病诊断的可行性.结果 GST-FlaB主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的40%;Western-blot结果显示该蛋白与FlaB抗血清能呈现明显的单一条带;包涵体经Triton X-100及尿素纯化后,纯度可达90%,并且能溶于包被缓冲液中;ELISA检测显示纯化后的GST-FlaB具有较好的特异性.结论钩端螺旋体FlaB可以高效表达并可能用于ELISA检测及钩体病的预防.
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Sj28GST基因克隆和高效表达产物的纯化
目的从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中克隆28kDa 谷胱甘肽-S-转移酶(Sj28GST)基因,获得用于疫苗和T细胞表位研究的高纯度重组融合蛋白28GST-TRX.方法应用引物特异性PCR技术,从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中扩增Sj28GST基因,经琼脂糖凝胶电泳结合碱基序列分析鉴定后,采用定向克隆技术构建Sj28GST-TRX融合蛋白重组表达载体并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)的表达,用Western-blotting测定以融合蛋白方式表达的Sj28GST的免疫原性,通过包涵体纯化结合Ni+柱亲和层析获得高纯度重组融合蛋白.结果 Sj28GST PCR产物为约640bp,其碱基序列(633bp)和推导的氨基酸序列(211aa)与GenBank报道一致;获得了Sj28GST-TRX重组质粒;28GST-TRX融合蛋白在大肠杆菌以包涵体形式高效表达;在分子量为约43kDa处有一能与羊抗Sj28GST抗体产生特异性反应的含28GST融合蛋白条带;包涵体纯化法结合Ni+亲和层析可获得高纯度的重组融合蛋白.结论获得到了日本血吸虫中国大陆株28GST分子的全长基因和高纯度重组28GST-TRX融合蛋白,该融合蛋白具有天然Sj28GST免疫原性.
关键词： 日本血吸虫中国大陆株 28kDa谷胱甘肽-S-转移酶 分子克隆 包涵体 蛋白纯化 -
肺炎衣原体对不同细胞株的敏感性研究
目的肺炎衣原体(Cpn)是继鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体之后鉴定的第三种衣原体.血清学研究表明,大部分人群均感染过Cpn.它还和多种疾病有关,尤其是近人们注意到Cpn与动脉粥样硬化(AS)之间存在密切关系.明确这种病原学关系对更好地明了AS发病机理,及对AS的诊断与治疗的研究至关重要.Cpn的分离和培养比其它衣原体困难,因此,选择一种合适的宿主细胞是关键所在.方法和结果本文选择了HL,Hep-2和McCoy三种细胞作比较;Cpn则选用TW-183和AR-39原型株.经培养后计算包涵体形成单位(IFU),以比较各种细胞敏感性的差别.结论经Student-New-Keul分析,发现Hep-2细胞是适合繁殖Cpn的细胞.
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肺炎衣原体包涵体核酸组分衍化分析法的建立
吖啶橙(AO)染色可以作为肺炎衣原体(Cpn)包涵体的染色方法.它是一种快速检查 Cpn 感染的较好方法,有可能替代荧光单抗染色的功能,克服单抗染色时细胞结构显示不清的缺点,具有简捷、价廉和既能反映衣原体包涵体的形态和成份,又能反映包涵体不同时期 RNA 和 DNA 含量变化的独特优点.
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衣原体III型分泌系统效应蛋白研究进展
衣原体(Chlamydia)是一类进化来源尚未明确、发育周期独特、感染宿主广泛、致病表现复杂、介于细菌和病毒之间的革兰染色阴性微生物.当有传染性无代谢活性的原体（Elementary body,EB)粘附并进入真核宿主细胞后,分化为没有传染性胆有代谢活性的网状体(Reticulate body,RB),在寄生空泡内通过二分裂复制几代后,成为包涵体.
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沙眼衣原体包涵体的检出是男性非淋菌性尿道炎的主要诊断指标
在检测工作中,我们发现男性非淋菌性尿道炎(nongonococcus urethritis,NGU)患者的尿道粘膜柱状上皮细胞内广泛存在衣原体样颗粒,经姬姆萨染色、免疫组化染色、实时荧光定量聚合酶链试验(Real-fime PCR),证明这些衣原体样颗粒是衣原体的始体,原体与包涵体.衣原体感染细胞的百分比,在症状轻重与抗生素治疗前后有显著性差异(P<0.01).提示衣原体是男性NGU的主要致病菌.
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诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率影响的研究
目的 研究诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率的影响,探讨包涵体质量评价体系.方法 在不同时间诱导产生重组羧肽酶原B包涵体,研究其变性和复性、对蛋白酶K的稳定性及在一定浓度盐酸胍溶液中的化学变性,分析诱导时间与包涵体复性率的相关性.结果 诱导时机不同,所得重组羧肽酶原B包涵体复性率及对蛋白酶K的稳定性不同,在一定浓度盐酸胍溶液中的溶解性也不同.复性率越高的包涵体越不易被蛋白酶K酶解,对化学变性剂的稳定性也高.结论 诱导时机影响重组羧肽酶原B包涵体的质量及复性率.
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诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率影响的研究
目的 研究诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率的影响,探讨包涵体质量评价体系.方法 在不同时间诱导产生重组羧肽酶原B包涵体,研究其变性和复性、对蛋白酶K的稳定性及在一定浓度盐酸胍溶液中的化学变性,分析诱导时间与包涵体复性率的相关性.结果 诱导时机不同,所得重组羧肽酶原B包涵体复性率及对蛋白酶K的稳定性不同,在一定浓度盐酸胍溶液中的溶解性也不同.复性率越高的包涵体越不易被蛋白酶K酶解,对化学变性剂的稳定性也高.结论 诱导时机影响重组羧肽酶原B包涵体的质量及复性率.
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重组羧肽酶B及其包涵体溶解性的研究
目的 构建重组羧肽酶B(rCPB)的表达质粒和表达菌株,表达羧肽酶B(CPB),并对表达CPB包涵体的溶解性进行研究.方法 构建CPB重组质粒pET-21a-CPB,将其导入表达菌株BL21(DE3)中,分别在25℃和37℃进行诱导表达;所得包涵体分别用不同浓度尿素添加不同还原剂溶解,以溶液中的蛋白质浓度判定其溶解性,利用非还原SDS-PAGE分析其溶解性提高的原因.结果 诱导后生长温度不同对rCPB包涵体的纯度及后期处理均有影响;rCPB包涵体在10 mol/L尿素溶液中的溶解度比在8 mol/L尿素溶液中提高2～3倍;添加0.75%β-巯基乙醇能显著改善rCPB包涵体的溶解效果.经非还原SDS-PAGE分析,添加β-巯基乙醇后,溶解rCPB聚体的含量减少.结论 成功地表达了rCPB,并通过实验提高了rCPB包涵体的溶解度.
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重组人EC-SOD包涵体的复性
目的将E.coli中表达的人胞外超氧化物歧化酶(hEC-SOD)包涵体进行复性.方法分离包涵体,用8mol/L尿素溶解后进行透析复性.结果包涵体蛋白可以部分复性,比活达到900U/mg protein.结论透析复性法可以复性EC-SOD包涵体.
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大孔吸附树脂在EC—SOD纯化中的作用
目的 本文主要论述了大孔吸附树脂在EC-SOD的分离与纯化中所起的作用.该研究在大孔吸附树脂的应用方面有很大的开创性意义.方法 研究了非极性大孔吸附树脂在蛋白纯化中去除杂蛋白及DNA碎片、色素等成份的效果.结果 研究结果表明在33℃,上样量在30%总吸附量,上样速度在20mL·min-1、Ph值为7时有很好的吸附解吸附效果,蛋白回收率90%以上.结论 非极性大孔吸附树脂对于粗蛋白的纯化去除杂质效果显著,快速方便,成本低,更适于产业化.
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重组人可溶性突变体BAFF蛋白的制备及生物学活性的鉴定
目的 制备高纯度的B细胞活化因子(BAFF)可溶性突变体(smBAFF)蛋白,鉴定其生物学活性.方法 重组原核表达载体pET41a/smBAFF在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达smBAFF蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,超声碎茵,提取包涵体,Ni2+-NTA亲和层析纯化,复性,鉴定其生物学活性.结果 经鉴定表达出相对分子质量为1.7×104的外源蛋白smBAFF,经Ni2+-NTA亲和层析纯化出该重组蛋白,复性后的smBAFF与B细胞具有较高的亲和力,但失去共刺激B细胞增殖的能力,且能竞争性抑制天然sBAFF的作用.结论 成功制备具有B细胞结合活性而失去刺激B细胞增殖活性的smBAFF,为以smBAFF为靶向载体在B细胞恶性增殖性和异常活化性疾病治疗研究奠定基础.
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sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定
目的 采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白.方法 从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长CDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定.通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定.结果 获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29 000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别.经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性.结论 人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性.
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hSCGF-α膜肽的构建及其对hUCMSCs增殖作用的影响
目的:构建hSCGF-α穿膜肽(TAT-SCGF),研究其对人脐带间充质干细胞的增殖作用.方法:采用基因工程技术将hSCGF-α基因重组插人pET-28a(+)质粒DNA,构建TAT-SCGF-28a重组DNA,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功高效表达,包涵体纯化后,通过实验比较hSCGF-α及hSCGF-α穿膜肽(TAT-SCGF)对人脐带间充质干细胞的增殖刺激作用.结果与结论:成功构建TAT-SCGF-28a重组DNA;纯化的蛋白纯度达90%以上;TAT-SCGF较不具有穿膜功能的SCGF对人脐带间充质干细胞有更强的增殖效果.
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Chediak-Higashi综合征误诊2例
例1,男,4岁.4个月前受凉后发热,体温39 ℃,并出现颈淋巴结肿大,咽痛.外院2次诊断为传染性单核细胞增多症,治疗后痊愈.2个月前第3次出现颈淋巴结肿大、发热住我院.查体:体温39 ℃,全身皮肤黑,躯干散在数个点状色素脱失斑.头发呈深灰色.
