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重组人胰激肽原酶复性工艺的研究
目的:研究重组人胰激肽原酶包涵体变性及复性的工艺.方法:对本实验室构建的重组人胰激肽原酶大肠杆菌进行IPTG诱导表达表达成功后,菌体经超声破碎释放包涵体,包涵体经洗涤、变性、稀释和尿素梯度凝胶过滤色谱这两种方法复性后(Sephadex-G75),通过测定酶活检验复性效果.结果:①重组人胰激肽原酶工程菌经过IPTG诱导后能够表达目的蛋白,目的蛋白以包涵体形式存在,将细胞破碎后,包涵体经过3次洗涤,纯度达到71.93％；②变性包涵体经24小时稀释复性后,蛋白浓度达到72.61μg/mL,酶的比活达到13.84 U/mg;③变性包涵体经过2个小时的尿素梯度凝胶过滤复性后,蛋白浓度可达到830.07μg/mL,酶的比活达到48.61U/mg.结论:两种复性方法均可以使包涵体达到一定的浓度和比活,比较发现尿素梯度凝胶过滤色谱具有复性时间短和比活力高等优点,可作为重组人胰激肽原酶复性的一种有效的手段.
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从包涵体中提取干扰素α-2b及其研究进展
干扰素具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫系统等功能,被广泛的应用于病毒引起的疾病、肿瘤和癌症的治疗中.干扰素o-2b是干扰素家族中重要的一员,然而限制干扰素α-2b蛋白产量的主要原因是包涵体蛋白在变复性过程中出现的聚集和错误折叠.本文将对如何有效的减少干扰素α-2b生产过程中产生的聚集和错误折叠及其进展进行综述.
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枕叶萎缩所致的痴呆
人们早已清楚地知道额叶或额颞叶的功能与人类的智能、情感、记忆等精神活动有重要关系.该区神经变性病产生的痴呆,称之为额叶型或额颞叶型痴呆.尽管对其病变性质、蛋白质病理及分子生物学等所见,尚有若干分歧.但额叶或颞叶的神经细胞脱失、胶质细胞增生、神经细胞或胶质细胞内包涵体等病变,可引起痴呆的事实则无可非议.
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重组人白细胞介素-6包涵体精制工艺研究
目的 建立重组人白细胞介素-6(recombinant human interleukin-6,rhIL-6)包涵体精制工艺,获取高纯度的包涵体蛋白.方法 采用超声破碎法和生物酶解法破碎细胞;摸索洗涤缓冲液中尿素的适当浓度,经多次洗涤获取高纯度的包涵体蛋白.结果 成功建立了rhIL-6包涵体蛋白的精制工艺,其中尿素浓度为2.0 mol/L,溶菌酶浓度达到0.8 mg/g菌体.包涵体蛋白洗涤后纯度达到90%以上.结论 建立合理的精制工艺,包涵体蛋白纯度达到90%以上.
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抗苏丹红单链Fab抗体的构建、表达及功能鉴定
从分泌抗苏丹红I单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株SU211中克隆抗体轻链Lc基因和重链Fd基因,将Lc、Fd基因以及Linker克隆到载体pET24a(+)中,构建scFab表达载体并在E.cali BL21(DE3)获得表达,SDsPAGE和western blot分析表明其表达形式为包涵体,相对分子质量约为57 kD,与理论预期值相符.经复性后,ELISA鉴定结果表明复性抗体对苏丹红I具有很高的结合特异性.本研究为新型基因工程抗体的构建以及苏丹红新型免疫检测技术的建立奠定基础.
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重组人Flt3配体在大肠杆菌中的高效表达和生物学活性的鉴定
根据天然的人Flt3配体(Flt3 ligand,FL)基因和遵循适合大肠杆菌BL21(DE3)表达体系表达条件及不改变FL天然蛋白氨基酸序列的原则,对其进行改造,所获得的FL功能片段(FL134)克隆入PET30a表达载体,在C端融合了6个His,继而在大肠杆菌中诱导表达.结果表明重组蛋白rhFL134以包涵体形式在大肠杆菌(BL21)中可得到较高水平的表达.通过蛋白的变性、复性和HiTrapTM亲和层析获得了纯度达92%以上的rhFL134重组蛋白.体外的活性实验显示,重组蛋白rhFL134具有显著的促小鼠骨髓细胞的集落形成和扩增人脐带血中的CD34+细胞的生物学活性.
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重组人癌胚抗原的原核表达及其在质控品中的应用
目的 原核表达人癌胚抗原(CEA),并将重组蛋白作为原材料应用在质控品的开发中.方法 利用基因工程方法构建原核表达载体pColdl-cea,通过大肠埃希菌BL21(DE3)进行原核表达得到重组人癌胚抗原(rhCEA).结果 得到了rhCEA的包涵体,经纯化及透析复性后得到可溶的、具有免疫活性形式的重组蛋白,并将其利用在质控品的研制中.研制出的质控品在Abbott平台上的检测结果为:高值235.35 ng/mL,中值68.04 ng/mL,低值11.97 ng/mL;在Roche平台上的检测结果为:高值32.27 ng/mL,中值7.99 ng/mL,低值1.35 ng/mL;在Wondfo平台上的检测结果为:高值5 ng/mL,中值和低值未能检出.结论 原核表达的rhCEA在不同检测平台上的检测结果相差较大.rhCEA质控品更适用于Abbott平台,而不适合于其他2种平台.
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重组日本血吸虫特异性IgE相关蛋白的纯化及免疫学活性鉴定
目的纯化重组日本血吸虫特异性IgE抗体相关蛋白和鉴定其免疫原性.方法大量表达Sj43B/pGEX-6p-1/BL21重组克隆菌,超声粉碎后离心获得融合表达的重组蛋白包涵体.经TNMFX缓冲液分步洗涤后,将包涵体溶解液经FPLC分离,获得重组融合蛋白组分,再经巯基二硫键转换复性后,用于免疫小鼠获得抗血清,分别用dot ELISA法和Western blotting法对融合蛋白引起的特异性血清抗体同型反应进行鉴定.结果分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分,FPLC分离可获得高纯度重组蛋白.用复性后的重组融合蛋白免疫小鼠,其中目的蛋白可引起特异性IgE抗体反应,而担体蛋白26 kDaGST不引起特异性IgE应答,可引起特异性IgG抗体反应,目的蛋白则否.结论重组质粒Sj43B/pGEX-6p-1表达的融合蛋白,其目的蛋白部分免疫小鼠可产生特异性IgE抗体.
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一种获得高纯度包涵体蛋白的简便方法
以日本血吸虫SjBMP基因部分编码序列构建SjBMP-pET-28a(+)重组原核表达质粒,并转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)进行原核表达.将经过鉴定的目的蛋白rSjBMP以包涵体形式表达的诱导菌样通过Ni2+-NTA Agarose亲和纯化和十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)切胶再纯化.用该纯化蛋白制备免疫血清,用蛋白质印迹(Western blotting)检测其免疫反应性.结果显示,经Ni2+-NTA Agarose亲和纯化和SDS-PAGE切胶再纯化,获得高纯度的目的蛋白,回收率＞11.0％.用该纯化蛋白免疫家兔制备免疫血清,获得的血清效价高于1∶1280; Western blotting检测结果表明,用该免疫血清去识别表达的重组蛋白,出现特异的单一条带,表明该纯化蛋白仍保持其抗原性,可用于免疫学相关实验研究.因此,SDS-PAGE切胶纯化后电渗、透析回收是纯化重组包涵体蛋白有效、简便的方法.
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日本血吸虫重组线粒体相关蛋白免疫学活性鉴定
目的对重组的日本血吸虫(中国大陆株)线粒体相关蛋白(rSj338)进行免疫活性鉴定,预测其作为血吸虫病疫苗候选分子的潜能. 方法阳性克隆进行表达,获得rSj338/日本血吸虫谷胱甘肽转移酶(26GST)融合蛋白,并对其进行纯化.再将粗提包涵体蛋白、复性蛋白及经过分子筛进一步纯化并复性的融合蛋白分别免疫家兔,获得特异性抗体,并用斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA)方法检测血清中抗体滴度,Western blot 反应确定其抗原性.再将粗提包涵体蛋白及经过分子筛进一步纯化并复性的融合蛋白分别免疫Balb/c小鼠后进行攻击感染实验.结果粗提包涵体蛋白、复性蛋白及经过分子筛进一步纯化并复性的融合蛋白均能刺激家兔产生特异性抗体,粗提包涵体蛋白免疫家兔,血清抗体滴度为1∶25 600,复性蛋白及经分子筛纯化的蛋白免疫的家兔血清抗体滴度均为1∶51 200,Western blot结果显示,粗提包涵体蛋白、复性蛋白及经过分子筛进一步纯化并复性的蛋白均能被重感染兔血清和rSj338/26GST特异性免疫兔血清所识别.攻击实验中,粗提包涵体蛋白和经分子筛纯化的蛋白分别可诱导小鼠产生27.8%(P<0.01)和30.4%(P<0.01)的减虫率, 40.4%(P<0.01)和43.5%(P<0.01)肝总减卵率.粗提包涵体蛋白中rSj338和经分子筛纯化的蛋白中rSj338分别可诱导小鼠产生13.9%(P<0.05)和20.0%(P<0.05)的减虫率, 30.0%(P<0.01)和41.7%(P<0.01)肝总减卵率.结论获得的日本血吸虫线粒体相关的重组融合蛋白(rSj338/26GST)具有良好的免疫学活性,重组融合蛋白(rSj338/26GST)及rSj338均可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力.
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包涵体蛋白纯化方法的探讨
目的:探讨包涵体蛋白的表达条件及纯化方法.方法:将PQE30-Cystatin转化大肠杆菌M15,通过IPTG诱导蛋白表达.为了能够获得可溶的且有活性的Cystatin C(Cys C),本文摸索了Cys C包涵体的复性条件及蛋白表达条件.结果:改变缓冲体系pH值及离子强度等多种方法均不能减少蛋白在复性过程中的沉淀;同时,改变蛋白表达的OD600、培养基pH值、表达时间等均未得到可溶性的表达蛋白;而改变诱导蛋白表达所用的IPTG浓度后发现在低浓度(0.005mM)的IPTG诱导条件下,该蛋白有少量的表达,但是表达量明显低于1mM IPTG的诱导条件.结论:对于包涵体蛋白进行方法摸索的过程中,既要对包涵体蛋白本身进行研究,更要对蛋白表达条件进行进一步的优化,以表达可溶的蛋白.
关键词： 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 包涵体 可溶性表达 -
精氨酸脱亚胺酶的克隆表达和纯化
目的 研究人型支原体来源的精氨酸脱亚胺酶(MhADI)在大肠杆菌中的表达及纯化.方法 人工合成密码子优化的人型支原体来源的adi基因片段,定向插入到pET-22b载体的NdeⅠ和Xho Ⅰ位点之间；重组的表达载体pET22b-adi转化大肠杆菌BL21 (DE3),用IPTG诱导表达；表达产物通过透析复性后经DEAE离子交换层析纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果;纯化的重组蛋白用二乙酰一肟-氨基硫脲比色法检测比活.结果 成功诱导表达分子量为48 kDa的重组蛋白,目的产物以包涵体形式表达,表达量约为细胞总蛋白的15％.纯化后蛋白纯度达95％以上,比活为3 IU.结论 本研究方法可制备得到较高纯度活性重组人型支原体ADI蛋白.
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人TNF-α突变体Y87H/A145R的表达及纯化
用大肠杆菌表达人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的突变体Y87H/A145R,并研究其生物学特性.在5 L发酵罐中培养大肠杆菌工程菌,当菌体密度(D<,600>)增长到35时,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目标蛋白表达,包涵体蛋白的终表达水平为2.5 g/L.用High Q Micro-prep凝胶柱纯化包涵体蛋白,然后通过透析复性,蛋白纯度大于99%.用分子排阻色谱分析Y87H/A145R的分子特征.结果表明,Y87H/A145R与TNF-α一样,以三聚体形式存在.而且,Y87H/A145R能明显抑制TNF-α诱导的L929细胞凋亡.小鼠试验表明,突变体Y87H/A145R不但失去了TNF-α的细胞毒性,并且能有效抑制TNF-α引起的急性肝坏死.
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从EDTA处理的重组E.coil中分离纯化重组人SOD包涵体
以金属离子螯合剂乙胺四乙酸(EDTA)代替超声法使重组大肠杆菌菌体释放,并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体,纯度为65%.采用透析法复性包涵体,经凝胶色谱纯化后,目的蛋白纯度约为90%,酶比活力为5400 u/(mg蛋白).
关键词： 重组人超氧化物歧化酶 包涵体 EDTA 破碎 复性 -
TEM-1型β-内酰胺酶基因的克隆、表达及酶的纯化
开发专一性β-内酰胺酶抑制剂,对解决细菌耐药性问题具有重要意义.这项研究需要用到纯度较高的β-内酰胺酶.我们将TEM-1型β-内酰胺酶基因克隆到一个高表达载体中,研究了该酶在大肠杆菌中的高表达条件及分离纯化方法,终获得的酶纯度大于90%.
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组蛋白去乙酰化酶6对帕金森病细胞模型中α-突触核蛋白阳性包涵体的作用
目的 研究帕金森病(PD)细胞模型中组蛋白去乙酰化酶6 (HDAC6)的表达水平及其对α-突触核蛋白阳性包涵体的影响.方法 使用Lipofectamin 2000构建稳定过表达野生型α-突触核蛋白的人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞,并加入蛋白酶体抑制剂lactacystin制作α-突触核蛋白异常聚集的PD模型;采用Western blotting检测HDAC6的表达水平;使用HDAC6特异性抑制剂tubacin处理后,免疫荧光染色检测α-突触核蛋白阳性的包涵体水平.结果 Lactacystin处理细胞的HDAC6表达水平较对照细胞明显升高,且α-突触核蛋白阳性的包涵体增多,而经tubacin处理后包涵体减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在蛋白酶体抑制剂制作的PD细胞模型中,抑制升高的HDAC6可使α-突触核蛋白阳性的包涵体水平降低;其机制可能与HDAC6参与α-突触核蛋白从寡聚体向包涵体形式的转化从而起保护作用有关.
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α-synuclein增加细胞对蛋白酶体抑制剂毒性的易感性
帕金森病(PD)是临床上常见的神经系统变性疾病之一,主要病理特征是黑质多巴胺能神经元变性缺失和细胞内出现特征性包涵体Lewy小体.近年来发现,α-synuclein基因突变可引起家族性PD,而α-synuclein蛋白是Lewy小体的主要成分,因此α-synuclein在PD发病机制中可能起重要作用.α-synuclein的基因突变及结构改变是PD的病因之一,α-synuclein蛋白代谢障碍亦可能与PD的发病密切相关.有研究表明,野生型和突变型α-synuclein均可通过泛素-蛋白酶体途径降解[1],可引起家族性PD的另两个基因Parkin和UCHL 1均与泛素-蛋白酶体系统(UPS)有关[2],在Lewy小体中亦有泛素和一些蛋白酶体成分聚集.
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浆细胞包涵体的名称与形态学特点
多发性骨髓瘤(MM)细胞和浆细胞包涵体的名称和形态学描述尚不一致,给初学者和临床诊断带来一定困难,为此我们结合临床实践及国内外文献对浆细胞包涵体名称和形态学特点作一阐述.1包涵体的形成与名称Kanoh等[1]将包涵体的形成分为4类:(1)来源于免疫球蛋白;(2)属于淀粉样蛋白;(3)由溶酶体颗粒组成;(4)不属于以上3种类型.Tkachuk[2]认为,骨髓瘤细胞或浆细胞胞质中如存在多个小空泡称为Mott细胞;含有的体积大的同质性球状包涵体为Russel小体;胞核中包涵体称为Dutcher小体.
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坏死性肌病
坏死性肌病是一种与炎症性肌病、特别是多发性肌炎(PM)相类似的肌病,其病因大多是肿瘤.主要表现为近端肢体对称性无力、肌肉疼痛;血清肌酶、尤其是肌酸磷酸激酶(CK)升高;病理学上有肌细胞的变性、坏死、再生,部分肌纤维有吞噬现象,但无或极少炎性细胞浸润,部分患者毛细血管壁增厚,呈杆状,上皮细胞内可出现包涵体;肌电图呈肌源性损害;大部分患者对类固醇激素反应良好.
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帕金森病发病机制的相关蛋白研究进展
帕金森病(Parkinson disease,PD)是一种常见的神经变性疾病,由于中脑黑质多巴胺能神经元进行性变性坏死,造成多巴胺(dopamine,DA)生成障碍,残存的多巴胺神经元胞浆中出现淀粉样蛋白包涵体(Lewy小体).主要临床特征是静止性震颤、肌强直、运动减少和姿势平衡障碍等.大部分病人是散发的,部分和环境因素、遗传及年龄有关.
