基因重组蛋白L243诱导表达包涵体的变性、复性与纯化

目的 对来自于日本七鳃鳗的基因重组蛋白L243包涵体进行变性、复性与纯化,以获得成分均一的活性蛋白.方法 以6 mol/L尿素为变性剂,以0.1 mol/L氧化型谷胱甘肽及0.9 mol/L还原型谷胱甘肽为复性剂,对构建于pET23b的日本七鳃鳗L243基因在大肠杆菌Rosetta中表达的包涵体进行了的变性、复性与组氨酸亲和层析纯化.结果 经变性、复性后,获得了均质的L243纯化蛋白,该蛋白的复性率达80%.结论 成功对上述重组蛋白包涵体进行了变性、复性及纯化,为后续与此蛋白相关的生物活性测定奠定了物质基础.

曼氏血吸虫虫卵白细胞介素-4诱导因子的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 原核表达曼氏血吸虫虫卵白细胞介素-4诱导因子(IL-4-inducing principle of schistosoma eggs,IPSE),并制备小鼠多克隆抗体.方法 人工合成IPSE基因,采用PCR技术克隆其成熟体开放阅读框,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-IPSE.转化E coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析后,应用组氨酸标签蛋白纯化柱纯化包涵体蛋白,免疫BALB/c鼠,制备多克隆抗体.结果 克隆的IPSE基因与GenBank中登录的基因序列同源性为100％;重组表达质粒pET-28a-IPSE经PCR及双酶切鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为16 000,以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30％,可与鼠抗His单抗特异性结合；用纯化的包涵体蛋白免疫BALB/c小鼠后,获得的特异性抗血清效价为2× 10-4,该血清可与IPSE蛋白发生特异性反应.结论 已原核表达、纯化了曼氏血吸虫IPSE蛋白,并制备了高滴度的特异鼠抗血清,为进一步从日本血吸虫中筛选相似蛋白及研究其功能奠定了基础.

人TRAIL细胞外段基因在大肠杆菌中的表达及其包涵体的复性

目的在大肠杆菌中表达人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)基因,并研究其包涵体的复性.方法应用RT-PCR法从正常人外周血单核细胞中获得sTRAIL的编码基因,将其克隆到原核表达载体pBV220,于大肠杆菌DH5α中通过温控诱导表达;将包涵体进行变性和复性处理后,采用离子交换层析纯化表达产物,并经Dot blot及MIT试验鉴定.结果通过温度诱导,目的基因主要以包涵体形式高效表达,包涵体蛋白经梯度透析法复性可获得具有抗肿瘤活性的重组人sTRAIL.结论已获得大量纯化重组人sTRAIL,为开发新型抗肿瘤制剂奠定基础.

TRAIL与导向肽融合基因的克隆、表达及其表达产物的生物学活性

目的获得具有生物学活性的与导向肽融合表达的重组TRAIL蛋白,提高TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用.方法构建TRAIL与导向多肽PEPHC1的融合基因,克隆入质粒pGEM-3zf(-)中进行测序,序列正确后,亚克隆人表达载体pBV220中,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达.结果42℃诱导4 h,融合基因得到了表达,SDS-PAGE表明目的蛋白占菌体总蛋白的15%以上,以包涵体形式存在.经包涵体洗涤、变性、复性,并经离子交换层析柱纯化后可得到融合蛋白PE-TRAIL,经体外试验证明具有生物学活性.结论成功克隆并表达了具有生物学活性的与导向肽融合表达的重组TRAIL蛋白.

重组人白细胞介素-10在大肠杆菌中的表达及生物学活性分析

目的在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10),并检测其生物学活性.方法将IL-10基因重组到质粒pET11c中,转化BL21(DE),提取质粒,经酶切鉴定和测序分析;在25℃用低浓度的IPTG诱导表达,对包涵体IL-10稀释复性;经ELISA检测其含量,MC/9细胞增殖法检测其生物学活性.结果工程菌IL-10/pET11c/BL21诱导表达的目的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,Western blot鉴定证实为IL-10蛋白,两种形式的IL-10均具有一定的生物学活性.结论已成功地在大肠杆菌中表达了IL-10,为进一步纯化和制备IL-10的基因工程药物打下了基础.

实验设计法优化可溶性人肿瘤坏死因子α Ⅰ型受体包涵体的复性工艺

目的 通过实验设计(Design of Experiment,DoE)方法对重组的可溶性人肿瘤坏死因子αⅠ型受体(soluble tumor necrosis factor α receptor Ⅰ,sTNFαR Ⅰ)包涵体复性工艺中的关键参数进行优化.方法 采用DoE软件中的中心复合设计(Central Composite Design)建立二次模型(Quadratic Model),对复性工艺中游离巯基浓度(CSH)和复性液蛋白浓度(C.Pro)2个关键参数进行优化.设置2个响应值:每克湿菌体中所获得的sTNFαR Ⅰ蛋白收率和每制备10 g sTNFαR Ⅰ蛋白所需复性体积(V.10g),通过DoE软件对模型数据进行评估分析.在sTNFαR Ⅰ收率高及V-10g小的前提下,采用二次模型响应面分析预测优的复性参数值,并通过两次放大试验对优化结果进行验证.结果 由2因素5水平2个Block共14组试验结果所建立的DoE响应面二次模型中心点重复性好,试验点均符合正态分布.响应面二次回归分析中,分别以sTNFαR Ⅰ收率和V-10g作为响应值进行失拟检验的P均＞0.05,模型失拟不显著.预测值和真实值接近,模型拟合度好.信噪比均＞4,表明该模型有效,可用于复性工艺优化指导.通过以上模型得出:当CPro为0.48 mg/mL,复性起始CSH为8.69 mmol/L时模型愿望值(0.643)高,sTNFα R Ⅰ收率为16.38 mg/g,V.10g为36.73 L.通过两次放大试验对优化结果进行验证,sTNFαR Ⅰ收率分别为11.34和9.72 mg/g,与优化前(收率均值5.1mg/g)相比,有所提高.结论 DoE软件中心复合设计的二次模型可用于sTNFαR Ⅰ包涵体复性条件的筛选,且筛选结果为后续工艺放大提供了可靠的实验依据.

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位

目的建立一种有效的方法,从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(rUreB).方法重组大肠杆菌发酵后,表达的rUreB包涵体经洗涤、变性、复性,采用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和Pheny1 Sepharose High Performance疏水层析分离纯化.使用SDS-PAGE和HPLC检测纯度,选用ELISA和Western-blotting对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定.结果 rUreB包涵体经洗涤和溶解后,rUreB的纯度＞70%.包涵体溶解液经阴离子交换层析和疏水层析后纯度超过95%.rUreB纯品具有良好的生物学活性.结论建立了从包涵体中获得高纯度的rUreB的工艺,为进一步的研究打下了基础.

四种金属离子亲和层析纯化重组戊型肝炎病毒包涵体的效果比较

目的选择固相金属亲和层析柱的金属离子,以优化分离纯化重组戊型肝炎病毒包涵体的条件.方法在同一试验条件下用4种金属离子柱分离纯化目的蛋白.结果包涵体经不同离子柱层析时目的蛋白的收获率、纯度、洗脱条件各异. 结论镍离子柱纯化效果佳.

应用疏水层析纯化HIV-1跨膜蛋白gp41截短体包涵体

目的对表达HIV-1跨膜蛋白gp41截短体包涵体进行纯化.方法将收获的表达菌体洗涤、超声波破菌、预处理后进行疏水层析.结果纯化后的gp41截短体的融合蛋白纯度达到90%,并且具有较好的抗原性和特异性.结论利用疏水层析可以将目的蛋白进行有效的纯化,为下一步的应用打下基础.

应用蛋白质工程法制备含硒单链抗体酶

目的制备一种具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性的含硒单链抗体酶.方法利用RT-PCR方法从杂交瘤细胞株2F3中扩增出单克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因.经DNA序列测定后,构建成表达载体pTMF-scFv,经过金属螯合层析纯化、复性和化学诱变,得到含硒单链抗体酶.结果将重组质粒pTMF-scFv分别转化入大肠杆菌JM109(DE3)、BL21(DE3)和BL21(coden plus),表达目的蛋白分别占菌体总蛋白的5%～10%、15%～20%和25%～30%.该重组蛋白以包涵体形式存在,相对分子质量为30000.其GPX活性为3 400U/μmol,接近天然酶水平.结论为工业化制备含硒单链抗体酶奠定基础.

截断型人可溶性CD40L的表达与纯化

目的表达相对分子质量18 000的截断型人可溶性CD40L.方法针对人CD40L(Glu108-Leu261)设计引物,以全长人CD40L为模板,扩增目的基因,经pGEM-T中间载体进一步连接到pQE-40载体,构建pQE/sCD40L表达载体.转化E.coliM15后经IPTG诱导表达,分离、洗涤包涵体,并利用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白,经复性后检测对骨髓瘤细胞SP2/0细胞株的抑制作用.结果克隆的目的基因为480bp,经测序与文献报道一致,所构建的菌株(M15/PQE/sCD40L)经诱导表达目的蛋白量为26.7%,相对分子质量为18 000,纯化后蛋白纯度为96.5%,对SP2/0细胞有生长抑制作用.结论原核表达的截断型人可溶性CD40L具有抑制肿瘤细胞生长作用.

重组人白细胞介素-10融合表达载体的构建及其在BL21(DE3)pLysE细菌细胞中的表达

目的构建重组人白细胞介素10(recombinant human interleukin 10,rhIL-10)融合蛋白的表达载体,并在大肠杆菌中表达.方法应用RT-PCR方法扩增IL-10基因,克隆PCR产物,构建PCR(R)T7/NT-TOPO(R)-IL-10重组质粒,以Appied Biosystems 3 700 DNA分析仪进行分析.构建成功的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysE细胞,经12%SDS-PAGE鉴定融合表达蛋白.结果 PCR(R)T7/NT-TOPO(R)质粒已载入rhIL-10基因,其序列与理论设计完全一致,表达质粒在BL21(DE3)pLysE中得到高效表达,产物主要以包涵体形式存在.结论已成功构建重组PCR(R)T7/NT-TOPO(R)-IL-10质粒载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysE细胞内高效表达.

从包涵体中高效纯化HBx-蛋白

重组幽门螺杆菌粘附素的纯化工艺

目的纯化大肠杆菌表达的重组幽门螺杆菌粘附素.方法将表达HpaA蛋白的工程菌经高压均质机破菌获得包涵体,经洗涤、变性、复性,Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和亲和层析分离纯化.采用SDS-PAGE和HPLC检测纯度,用Western blot检测其抗原性.结果纯化后HpaA蛋白纯度高达95%以上,具有良好的抗原性.结论建立了从包涵体中获得高纯度HpaA纯化工艺,为进一步的研究打下了基础.

重组人载脂蛋白A-I(米兰变体)的复性及纯化

目的从大肠杆菌中获得载脂蛋白A-I(米兰变体)的包涵体,对包涵体进行复性、纯化,终获得具有生物活性的载脂蛋白A-I(米兰变体).方法包涵体以尿素溶解后,以疏水层析法复性重组蛋白;以离子交换层析对其进一步纯化,并对所得的蛋白进行生物活性分析.结果经复性纯化的蛋白纯度达95%,体外生物活性检测显示其具有生物活性.结论本法能快速有效地对目的蛋白进行复性、纯化,并且有望放大至工业生产规模.

重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体纯化条件的优化

目的 优化重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件.方法 将表达Gp41的大肠杆菌菌体高压匀浆破碎、洗涤分离提取包涵体,以不同pH值的低浓度变性剂溶解包涵体,稀释复性并用离子交换层析纯化目的 蛋白,纯化产物经Western blot进行鉴定.结果 以50 mmol/L Tris buffer、2 mol/L,pH 11.5尿素溶解的包涵体蛋白得到很好的溶解,目的 蛋白复性得率大于40%.经纯化后,目的 蛋白的纯度大于90%,且具有良好的反应原性.结论 优化了重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件,为HIV-1 Gp41抗原纯化工艺的放大提供了依据.

重组人EC-SOD包涵体的稀释复性及重折叠后蛋白的纯化

目的确定重组人EC-SOD包涵体体外稀释复性和复性后蛋白纯化的适宜方法.方法通过对pH、温度、包涵体蛋白浓度、尿素和精氨酸浓度及氧化还原对比率的定性定量分析,研究重组人EC-SOD包涵体体外稀释复性的基本条件.采用金属离子亲和柱(IMAC)和肝素亲和柱(Heparin-sepharose)对复性蛋白进行纯化,比较纯化效率的差异.结果佳复性条件为pH8.5,尿素浓度为1.5 mol/L,精氨酸浓度大于0.3 mol/L,GSH:GSSG=4:1;复性温度及包涵体蛋白终浓度越高,复性效率越低.IMAC和Heparin-sepharose亲和柱均可用来纯化复性蛋白溶液,但Heparin-sepharose纯化效率较高.结论确定了重组人EC-SOD包涵体体外稀释复性的佳条件及复性后蛋白纯化的方法.

原核表达HPVl6L1蛋白的变性、纯化及复性效果评价

目的 探讨原核表达HPVl6 L1蛋白的变性、纯化及复性条件,并对复性效果进行评价.方法 将重组质粒PET28a-L1转化E.coli BL21(DE3).经放大培养诱导表达后,收集菌体.超声破碎后提取包涵体.并对其进行洗涤、变性,离子交换层析纯化,然后稀释复性.经电镜观察、红细胞凝集试验以及免疫原性分析,对复性效果进行评价.结果 LI蛋白在8 tool/L尿素中溶解不完全,SDS、硫脲和高pH值可提高其溶解度;纯化后的L1蛋白纯度可达90%;电镜可观察到VLP,并能凝集小鼠红细胞.免疫家兔后,可产生高滴度的抗体.结论 复性的HPVl6 LI蛋白在体外可自我折叠形成具有正确空间构象的VLP,且具有较好的免疫原性,为进一步研制HPVl6预防性疫苗及诊断试剂盒奠定了基础.

60H-DOPA而非MPP+通过抑制α-syn酶解和促进其积聚取消α-syn的抗凋亡作用

帕金森病病人大脑组织特征性病理变化是黑质致密部多巴胺能神经元发生退行性改变,神经元胞浆内出现包涵体即Lewy小体累积,α-syn是Lewy小体的主要组分,是第一个已鉴定可引起常染色体显性遗传性帕金森病的基因突变产物.前期研究发现,野生型α-syn主要通过下调神经元p53-依赖的caspase-3的激活发挥抗细胞凋亡作用.

p65蛋白的诱导表达及电子显微镜观察其显微结构

目的:构建重组原核表达载体pGEX-5x-1-p65,诱导GST-p65融合蛋白的表达并观察其包涵体的显微结构.方法:应用PCR技术扩增得到p65全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5x-1载体中.经酶切、测序鉴定后,在原核细胞中诱导表达GST-p65融合蛋白并将诱导后的菌体制作透射电镜标本,观察菌体内部显微结构.结果:成功构建表达载体pGEX-5x-1-p65,原核细胞中诱导表达、凝胶电泳后未见可溶性融合蛋白的高效表达.透射电镜观察到在承载有重组载体的菌体内部出现大量高电子密度的包涵体.结论:成功构建了原核表达载体pGEX-5x-1-p65,电子显微镜观察并证实在原核细胞内p65蛋白诱导表达形成包涵体.