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伴镶边空泡远端肌病患者GNE基因突变分析
目的 探讨5例伴镶边空泡远端肌病(DMRV)患者GNE基因突变类型.方法 对5例患者行肌活检,所有患者及例5的父母、妹妹、女儿行GNE基因编码区外显子及其侧翼序列聚合酶链反应扩增,纯化后产物经测序比对分析基因突变点,应用SnaPshotTM技术在100名健康对照者中进行新发突变位点检测.结果 5例患者均携带GNE基因突变,例1-4为复合杂合子,例5为纯合子.共检测到已知突变6个,1个无义突变(p.R8X),5个错义突变(p.D176V、p.1298T、p.A591T、P.A631V、p.V696M),发现新发错意突变1个(c.317T＞C,p.I106T),例5父母、妹妹及女儿均为P.A631V健康携带者.结论 本研究为p.R8X、p.1298T、p.A591T、p.V696M突变首次在中国人群中的报道,且p.1106T为GNE基因新发突变,这些发现进一步扩展了中国人群GNE基因突变谱.
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融合表达的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素包涵体复性的研究
目的构建融合表达载体,获得具有生物活性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素.方法克隆t/h基因,构建表达载体pET32a+/tlh,融合表达副溶血弧菌不耐热性溶血毒素,用8mol/L的尿素溶解包涵体,亲和层析纯化目的蛋白,采取逐步透析、降低蛋白浓度、加入氧化还原剂等复性方法.结果复性蛋白具有溶血活性及免疫原性.结论通过克隆tlh基因,构建融合表达载体pET32a+-tlh,采取纯化、复性方法,获得具有融血活性及免疫原性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素.
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重组生长激素释放激素GHRH的纯化及活性测定
目的用基因工程的方法在大肠杆菌中诱导表达重组生长激素释放激素(GHRH),检测其生物学活性.方法将重组表达质粒pET-28a/L-ansB-GHRH,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达.经裂解细胞、洗涤、乙醇沉淀、酸水解、SP-Sephadex C-25和Sephadex G25柱层析等方法纯化GHRH.用人生长激素放免试剂盒检测GHRH多肽的活性.结果SDS-PAGE分析显示重组表达质粒在大肠杆菌中成功地表达了融合蛋白,它以不溶性的包涵体形式存在,占菌体总蛋白的30%左右.经抽提、酸水解、层析等方法表明纯化倍数达147倍,多肽收率为0.68%.通过电喷雾质谱测得多肽的相对分子质量为5235.25,与理论计算值相吻合.多肽的纯度经SDS-PAGE测定为单一峰.GHRiH三组刺激实验组与空白对照组相比之间差异显著(P＜0.01),且随着剂量增加,差异明显增加.结论体外重组GHRH多肽具有较高的生物学活性.
关键词： 生长激素释放激素(GHRH) 纯化 融合蛋白 包涵体 -
恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究
目的建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法.方法将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH/pGEX-4T-1转化到宿主菌BL21,该GDH/GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达,经SDS-PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体.经超声酶解法、离心、变性剂/去污剂洗涤后获得包涵体.包涵体经8 mol/L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性,并通过浊度分析、非还原SDS-PAGE等方法比较、优化复性方法和条件.复性后的GDH/GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化.结果经SDS-PAGE分析表明,GDH/GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25%左右;浊度分析表明:稀释复性法优于其它两种方法,同时20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、pH8.5及GSSG/GSH=1:10为该融合蛋白稀释复性的佳条件,其复性回收率可达90%以上.复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果.结论通过稀释复性,二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH/GST融合蛋白.
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高频等位基因HLA-A*1101重链胞外域-BSP融合蛋白原核表达载体的构建及表达鉴定
目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白.方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以免疫印迹法进行鉴定.结果:从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA,以此cDNA为模板,将编码HLA-A*1101重链胞外域1～276序列与编码BSP的序列融合,构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体,重组质粒经测序验证.融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达,约占菌体总蛋白的20%;其相对分子质量约为35 000,与理论值一致.免疫印迹分析显示表达产物主要存在于包涵体中,上清液中几乎无任何产物存在.结论:成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体,该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达.
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HLA-A*0207重链胞外区原核表达载体的构建及表达
目的:克隆HLA-A*0207(A2)重链基因,构建在羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BirA substrate peptide, BSP)的A2重链胞外区原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达.方法:以RT-PCR方法从HLA-A2+供者白细胞中克隆A2基因并进行DNA测序,并以PCR方法构建在羧基端融合BSP的A2重链胞外区表达载体,在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达.结果:从31名HLA-A2+供者白细胞中克隆到的基因经DNA测序显示,只有从供者2得到的基因是HLA-A*0207.将编码该基因编码重链胞外区1-275的序列和编码BSP的序列融合,构建融合蛋白表达载体,并以测序验证.融合蛋白在BL21(ED3)中获得高效表达,产物相对分子质量为35 000,约占菌体总蛋白的30%,主要存在于包涵体中,对包涵体进行洗涤后得到纯度为80%的重组蛋白.结论:成功克隆HLA-A*0207基因,构建了其胞外区和BSP融合蛋白表达载体并在大肠杆菌中获得高效表达.
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原核表达的多串重复人脑钠素蛋白的裂解
目的:将原核表达的多串重复人脑钠素蛋白裂解成单体.方法:利用高效表达质粒载体将串联5拷贝人脑钠素基因转入宿主菌E.coli M5219,以热诱导方式表达 5BNP融合蛋白,超声裂解收获 5BNP融合蛋白包涵体,制备性电泳分离纯化;凝血酶消化后,再经BMPS-Skatole 法裂解.结果:利用本文原核表达系统所表达的5BNP融合蛋白占菌体总蛋白的30%,采用制备性电泳可获得纯度＞95%的5BNP融合蛋白;凝血酶消化后,再经BNPS-Skatole法可以将5BNP融合蛋白裂解成BNP单体.结论:BMPS-Skatole法是裂解多串重复人脑钠素蛋白的良好方法.
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截短型人转化生长因子βⅡ型受体胞外域的表达及活性分析
目的 构建截短型人转化生长因子βⅡ型受体胞外域( thTβRⅡ)原核表达载体,诱导表达纯化thTβRⅡ蛋白,并分析其生物学活性.方法 以本实验室前期构建的TβRⅡ全长基因片段( pGEX-4T1-TβRⅡ)为模版,常规PCR扩增出带有 NdeI和BamHI酶切位点的thTβRⅡ目的基因,并插入原核表达载体pET28a,命名为pET28a-thTβRⅡ.将经过PCR、双酶切和DNA测序正确的pET28a-thTβRⅡ转化至大肠杆菌Rossta诱导表达,用Ni2+亲和层析纯化获得高纯度thTβRⅡ目的蛋白,经SDS-PAGE进行纯度分析,MTT法观察其对转化生长因子-β1(TGF-β1)活化的人肝星状细胞LX-2增殖活性的影响,real-time RT-PCR及Western blot检测其对TGF-β1、纤连蛋白(FN)mRNA及FN、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达的影响.结果 pET28a -thTβRⅡ原核表达载体构建成功,宿主菌 Rossta/pET28a -thTβRⅡ在37℃经0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导5 h获得目的蛋白thTβRⅡ的大量表达,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,通过Ni2+亲和层析成功获得高纯度thTβRⅡ,SDS-PAGE鉴定分子量约为18.0 kD, MTT显示150 μg/mL的重组蛋白thTβRⅡ能明显抑制活化的人肝星状细胞LX-2增殖,real-time RT-PCR及Western blot显示200 μg/mL的重组蛋白thTβRⅡ其能显著减少TGFβ1、FNmRNA;FN、α-SMA蛋白的表达.结论 成功构建thTβRⅡ原核表达载体,诱导表达纯化并获得高纯度重组蛋白thTβRⅡ,其能抑制活化的LX-2 细胞增殖并具有抗纤维化作用,为进一步体内外功能研究打下基础.
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人白细胞介素-29cDNA克隆及其在大肠杆菌系统的表达
目的:克隆人细胞因子 IL- 29全长 cDNA及其在大肠杆菌中表达,制备抗 IL- 29多克隆抗体.方法:分离外周血单核细胞; vsv感染后,提取总 RNA,通过一步 RT- PCR获得 IL- 29全长 cDNA. DNA测序正确后,将 IL- 29cDNA的编码框序列构建到原核表达载体 pET28a(+ )中.卡那霉素平板筛选及 PCR鉴定,挑出阳性克隆进行扩增、转化大肠杆菌进行 IPTG诱导表达. SDS- PAGE、 Western blotting鉴定,亲和层析分离纯化得到 Mr为 23 000组氨酸标签重组人 IL- 29融合蛋白.纯化的 IL- 29免疫家兔制备抗 IL- 29多克隆抗体.结果:成功获得人 IL- 29全长 cDNA,并以包涵体形式表达于大肠杆菌中.免疫家兔后获得特异抗 IL- 29的多克隆抗体.结论:获得 rhIL- 29细胞因子及其多克隆抗体,为其进一步研究及应用奠定基础.
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婴儿巨细胞病毒肺炎35例临床分析
巨细胞病毒(cytomegaJlovirus,CMV)为双链线状DNA病毒,具有潜伏-活化的双重生物学特性,在人群中普遍感染,婴儿免疫功能低下,极易受CMV感染,大都为潜伏性无症状性感染,出现症状者为CMV包涵体病,CMV肺炎是此病的重要组成部分.
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女性不孕症宫腔分泌物沙眼衣原体检测的意义邋
女性沙眼衣原体(CT)感染与不孕关系日益受到重视.CT在受感染细胞内发育繁殖,于胞浆内形成包涵体,只感染粘膜上皮引起宫颈炎、宫内膜炎及输卵管炎等[1].本文对50例不孕患者行CT检测,取宫腔液检查,探讨宫腔液CT感染与不孕的关系.
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包涵体复性的研究进展
大肠杆菌表达的外源基因产物通常是不可溶的包涵体.包涵体需要经过溶解和复性才能得到有活性的蛋白质.复性是蛋白质从未折叠到折叠形式的过程,受到许多因素的影响,包括变性剂对包涵体的溶解度、变性剂的去除、一些小分子对复性的帮助等等.现就影响蛋白复性的相关因素进行阐述.
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链球菌溶血素O抗原的原核表达及条件优化
目的：构建链球菌溶血素O抗原（SLO）的重组表达质粒，并优化其在大肠杆菌中的佳表达条件。方法以 A群链球菌DNA为模板，采用PCR法扩增SLO基因，将扩增的基因连接pET-32a（＋）表达载体构建pET-32a（＋）-SLO重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，转化后的表达菌经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导和自诱导的方式分别诱导及纯化，终确定佳的表达条件。结果 PCR扩增的基因大小与SLO基因大小一致，测序完全正确。不同浓度的IPTG诱导均为包涵体表达，且表达量均较低；自诱导的方式，不仅表达量明显提高，且实现了部分可溶性表达。结论成功构建了SLO的原核表达质粒，优化筛选出能高效可溶性表达的诱导条件，纯化获得了SLO重组融合蛋白质，为进一步的基础及临床研究应用奠定基础。
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包涵体蛋白的复性技术
细菌表达系统产生的重组蛋白常为不溶的包涵体蛋白,影响产率.随着对蛋白质折叠中凝聚机制的认识,在包涵体复性中对一些条件加以控制,如蛋白质浓度、缓冲液的组成等,特别是低分子量添加剂的使用,可使蛋白产率提高.
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成人获得性风疹患者肝功能损害的病理及临床观察
目的 探讨成人获得性风疹患者肝功能损害的临床及病理学特点,为临床诊治及判断预后提供依据.方法 36例成人获得性风疹患者,分别于入院次日及以后每隔5～10 d抽取静脉血,全自动生化分析仪定量检测患者血清总胆红素、直接胆红素、ALT、AST、血清总蛋白和血清白蛋白等肝功能指标,对其并发肝功能损害情况进行了连续动态观察,并对其中2例典型病例进行了肝活组织病理检查.无肝功能损害患者与并发肝功能损害患者住院天数比较采用秩和检验.结果 成人获得性风疹患者并发肝功能损害发生率高达77.8%,但其肝功能损害多轻微,多以ALT和(或)AST升高为主,其中以退疹后的第6～10日肝功能损害发生率高,达72.2%,且此时肝功能损害亦明显.肝脏活组织病理学检查发现其肝脏组织结构完整,仅有肝脏组织轻微炎症改变,并发现其病毒包涵体.并发肝功能损害患者组平均住院18.2 d,与无并发肝功能损害患者组平均住院7.8 d比较,差异有统计学意义(u=3.596,P＜0.05).结论 近年成人获得性风疹患者并发肝功能损害发生率高,但其肝功能损害多轻微,多以ALT升高为主.但一旦出现AST异常或黄疸,说明肝功能损害较重,除积极治疗外,要严密观察,防止发生急性肝衰竭.如本病患者并发肝功能损害,则明显延长了病程及住院时间.
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重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性研究
对经大肠杆菌表达的重组人肝再生增强因子进行纯化并观察其对肝损伤小鼠模型的促修复作用。1. 方法：pBV-hALR/JM109工程菌由本室构建，30℃培养至A600＝0.6，42℃诱导表达5h，收集不同诱导时间菌体鉴定rhALR的表达水平。包涵体的洗涤变性，复性后经CM-Sepharose FF离子交换柱层析，收集洗脱峰，行SDS-PAGE，结果经UVP labwork扫描处理软件分析测定rhALR纯度，N端氨基酸分析采用手工Edman降解法。
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人巨细胞病毒宫内感染诊断的研究进展
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是胎儿宫内感染常见的病毒.存活新生儿中有0.3%～2.0%有先天性HCMV感染,其中5%为典型的CMV包涵体病,5%症状不典型,剩余的90%分娩时无症状,而其中的5%～17%将在生后4年内发展成渐进性的听力丧失和智力低下等不可逆转的损害,甚至死亡[1].
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组织学、血清学、尿荧光定量聚合酶链反应及尿沉渣中巨细胞包涵体检测方法在诊断巨细胞病毒所致胆汁淤积型婴儿肝炎综合征作用的研究
目的:探讨肝脏光镜组织学检查、血清学检测巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)特异性免疫球蛋白M(Immune globulin M,IgM)、尿HCMV荧光定量PCR(Fluorescence quantitative polumerase chain reaction,QPCR)检测和晨尿找包涵体方法在诊断婴儿肝炎综合征中HCMV感染的作用.方法:免疫组织化学法检测肝组织HCMV的极早期抗原(Immediately early antigen,IEA)和早期抗原(Early antigen,EA).采用Fisher精确检验比较HCMV-IEA/EA阳性组和阴性组在组织形态改变上的差异.运用ELISA方法常规检测血清HCMV抗体IgM、荧光定量PCR技术检测尿HCMV-DNA和瑞氏染色后显微镜下检测晨尿脱落细胞沉渣中包涵体,分析上述检查方法的灵敏度和特异度.结果:淤胆型婴儿肝炎综合征(Infantile hepatitissyndrome,IHS)患儿肝组织HCMV-IEA/EA阳性22/36例.HCMV-IEA/EA阳性组及阴性组比较,光镜组织形态学分析无明显特异性,晨尿脱落细胞找HCMV包涵体差异无统计学意义(P均＞0.05),而血清HCMV-IgM、荧光定量PCR技术检测尿HCMV-DNA差异有统计学意义(P均＜0.01).血清HCMV-lgM、荧光定量PCR技术检测尿HCMV-DNA和晨尿脱落细胞找HCMv包涵体诊断符合率分别为77.8%、69.4%和50.0%.结论:普通组织病理对淤胆型婴儿HCMv肝炎的诊断缺乏诊断特异性,血清HCMv-IgM检测仍不失为简单易行的实验室诊断方法.
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抗人氨基末端脂多糖结合蛋白二硫键稳定性Fv抗体的制备及生物学活性的初步研究
目的 制备抗人氨基末端脂多糖结合蛋白(N-terminal fragment of human lipopolysaccharide binding protein,NH-LBP)的二硫键稳定性Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv),并初步测定其生物学活性.方法 将含有dsFvVL与dsFvVH包涵体蛋白经复性、折叠和纯化,获得完整的dsFv抗体.通过ELISA、TNF-α分泌等方法,初步测定dsFv抗体在体内外的生物学活性.结果 获得dsFv抗体蛋白约2.1 mg,dsFv与NH-LBP有较好的结合能力,并在动物体内减轻了LPS所诱导的炎症反应,发挥了一定的保护活性. 结论通过分别表达VL和VH片段,再制备dsFv抗体是可行的,dsFv能部分抑制LBP的生物学功能.
关键词： 人氨基末端脂多糖结合蛋白 包涵体 二硫键稳定性Fv抗体 -
重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的纯化及生物学活性鉴定
目的纯化rLTB 并对其生物学功能进行初步研究.方法重组基因工程菌发酵后,以包涵体形式表达的rLTB经过洗涤、变性溶解后,分别采用Q SepharoseTM High Performance阴离子交换层析和Phenyl FF(high sub)疏水层析对其进行纯化并透析复性,然后采用SDS-PAGE和HPLC检测纯度,并选用ELISA、动物实验和Western-blotting实验对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定.结果得到纯度达97.85 %的rLTB,复性的rLTB经检测具有良好的生物学活性.结论得到纯度较高、生物学活性较好的rLTB,可用于进一步的研究.
