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Src羧基端激酶抑制剂PP2对大鼠C6胶质瘤细胞生物学行为的影响及机制研究
目的：探讨Src羧基端激酶（C－terminal Src kinase，Src激酶）抑制剂PP2对大鼠C6胶质瘤细胞生物学行为的影响及其机制。方法用浓度为0（溶剂对照组）、2．5、5、7．5 mol／L PP2作用于C6胶质瘤细胞12 h后，分别采用CCK8、划痕实验、transwell基质胶侵袭实验观察PP2对C6胶质瘤细胞形态、增殖、侵袭和迁移的影响。免疫印迹法检测细胞核内β－catenin蛋白表达。结果不同浓度的PP2作用于C6胶质瘤细胞12 h后均能诱导细胞聚集并产生明显的形态改变，且浓度越高，聚集效果越明显。 PP2作用于C6胶质瘤细胞12 h后可明显抑制其增殖、迁移和侵袭，且呈浓度相关性，同时，细胞核内p－β－catenin蛋白表达明显减少。结论 Src激酶抑制剂PP2可能通过减少细胞核内p－β－catenin蛋白表达，从而有效抑制C6胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。
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双向电泳技术分析大鼠星形细胞和C6细胞的蛋白差异
目的:建立大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的双向电泳(2-DE)技术体系,寻找星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的蛋白表达差异.方法:提取大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中的总蛋白,进行第一向等电聚焦(IEF)和第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离总蛋白,GS-800获得凝胶图像,并测量不同凝胶间蛋白斑点在IEF和SDS-PAGE方向上的位置偏差,使用PDQuest7.3软件对凝胶图像进行分析,找出星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的差异表达蛋白.结果:星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的蛋白表达谱上,分别检测到523±16和550±20个蛋白点,平均匹配点数为452±18和472±21,匹配率达86.4%和85.8%,不同凝胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为(0.67±0.48)mm,在SDS-PAGE方向上的偏差为(0.73±0.56)mm,对比分析了星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的2-DE图谱,发现有24个点发生了明显的表达变化(P<0.01),在星形胶质细胞中高表达的点有8个,在C6胶质瘤细胞中高表达的点有14个,星形胶质细胞中没有发现表达的点有2个.结论:建立了大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的双向电泳技术体系,发现两者的双向电泳图谱存在明显差异,C6胶质瘤细胞中表达上调以及星形胶质细胞中没有发现表达的蛋白可能与肿瘤的发生,神经干细胞的迁移有关.表达下调的蛋白可能与抑制肿瘤的发生有关.
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125I近距离照射对C6胶质瘤细胞的影响
目的了解不同剂量125I硅胶球囊内近距离照射对C6胶质瘤细胞的生物学效应.方法将125I-NaI溶液放入硅胶球囊内,对体外培养的C6胶质瘤细胞给予不同剂量的近距离照射,检测细胞死亡率、增殖抑制及细胞周期再分布情况.结果与对照组相比,受照射组细胞死亡率、增殖抑制率明显增加,S期比例降低、G1期阻滞,细胞周期发生紊乱.结论 125I近距离照射可以通过导致细胞死亡、细胞增殖抑制以及细胞周期改变在胶质瘤的治疗中发挥作用.
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氯化三乙基锡对大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响
目的 探讨氯化三乙基锡(triethyltin chloride,TETC)对体外培养大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响.方法 采用MTT法检测0.5、1.0和2.0 μmol/L TETC对体外培养大鼠C6脑胶质瘤细胞作用24 h和48 h后细胞增殖的影响、采用细胞形态学观察及流式细胞术(FCM)方法检测0.5、1.0和2.0 μmol/L TETC对体外培养大鼠C6脑胶质瘤细胞作用48 h后细胞增殖和细胞周期的影响.结果 MTT法及细胞形态学观察均检测到0.5、1.0和2.0 μmol/L TETC在体外均可抑制C6细胞增殖,C6细胞增殖率存在着剂量依赖性和时间依赖性降低趋势;TETC可将C6细胞阻滞在G0/G1期.结论 TETC可抑制体外培养大鼠C6胶质瘤细胞增殖,其机制可能与C6细胞周期阻滞在G0/G1期有关.
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自噬在ALA-PDT诱导C6胶质瘤细胞死亡中的作用机制
目的 探讨自噬在光敏剂5-氨基乙酰丙酸(aminolaevulinic acid,ALA)介导的光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)C6胶质瘤细胞死亡中作用机制.方法 ALA-PDT处理后不同时间,用自噬特异染料MDC和免疫荧光法观察自噬水平变化,Western blotting检测自噬相关蛋白cathepsin B的表达水平.结果 MDC染色和免疫荧光观察可见ALA-PDT后C6胶质瘤细胞内有大量含点状荧光颗粒的自噬泡和自噬体标志物LC3绿色荧光蛋白,Western-blot示自噬相关蛋白cathepsin B表达水平明显升高,其白噬水平随AIA-PDT后时间而逐渐增强.结论 ALA-PDT可诱导C6胶质瘤细胞发生自噬,其诱导胶质瘤细胞发生自噬的机制可能与溶酶体酶cathepsin B大量释放有关.
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Ⅱ、Ⅲ组亲代谢型谷氨酸受体激动剂对脂多糖抑制C6胶质瘤细胞摄取谷氨酸的影响
目的:探讨Ⅱ、Ⅲ组亲代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors, mGluRs)激动剂对脂多糖(LPS)抑制C6胶质瘤细胞摄取谷氨酸(glutamate, Glu)的影响.方法:应用同位素标记法测定C6胶质瘤细胞对[3H]-D,L-Glu的摄取.应用Hoechst染色法、噻唑蓝比色法(MTT)分别检测C6胶质瘤细胞的凋亡、细胞活力.结果:LPS(4、6 μg/Ml)显著抑制C6胶质瘤细胞摄取[3H]-D,L-Glu,抑制率分别达 17.6%和 22.2%.Ⅱ组mGluRs激动剂 DCG-Ⅳ 100 μmol/L 和Ⅲ组mGluRs激动剂L-AP4 100 μmol/L 逆转LPS对C6胶质瘤细胞摄取[3H]-D,L-Glu的抑制作用,这种逆转作用分别被Ⅱ、Ⅲ组mGluRs拮抗剂 APICA和MSOP取消.结论:DCG-Ⅳ和L-AP4逆转LPS引起的C6胶质瘤细胞Glu摄取抑制,提示Ⅱ、Ⅲ组mGluRs激动剂通过促进Glu摄取,降低细胞外Glu浓度,从而发挥神经保护作用.
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Ⅱ、Ⅲ组亲代谢型谷氨酸受体激动剂逆转1-甲基-4-苯基吡啶离子抑制C6胶质瘤细胞摄取谷氨酸
目的:探讨II、III组亲代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors,mGluRs)激动剂对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-metyl-4-phenylpyridinium,MPP+)抑制C6胶质瘤细胞摄取谷氨酸(glutamate,Glu)的影响.方法:应用同位素标记法测定C6胶质瘤细胞对培养液中[3H]-D,L-谷氨酸的摄取.结果:II组mGluRs激动剂(2S,2'R,3'R)-2-(2',3'-dicarboxycyclopropyl) glycine (DCG-IV)和III组mGluRs激动剂L(+)-2-amino-4-phosphonobutyric acid (L-AP4) 100 μmol·L-1可以逆转MPP+抑制C6胶质瘤细胞摄取Glu的作用,而II组mGluRs拮抗剂(RS)-1-Amino-5-phosphonoinan-1-carboxylic acid (APICA)和III组mGluRs拮抗剂 (RS)-α-methylserine-O-phosphate (MSOP)可以完全阻断其激动剂的逆转作用.结论:激活C6胶质瘤细胞上的II、III组mGluRs可以通过促进谷氨酸转运体摄取Glu、进而降低细胞外液的Glu浓度.
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MPP+和6-羟基多巴胺对C6胶质瘤细胞摄取谷氨酸的影响
目的: 研究1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)和6-羟基多巴胺(6-OHDA)对C6胶质瘤细胞摄取谷氨酸(Glu)的影响.方法:应用放射免疫法测定C6胶质瘤细胞对培养液中[3H]-D,L-谷氨酸的摄取;应用四氮唑(MTT)比色法检测胶质瘤细胞的活性.结果:6-OHDA和MPP+均不同程度地抑制C6胶质瘤细胞摄取Glu;6-OHDA显著抑制C6胶质瘤细胞活性,而MPP+却不影响细胞活性;蛋白激酶C(PKC)激动剂TPA显著增强C6细胞对Glu的摄取,并拮抗MPP+对C6细胞摄取Glu的抑制.结论:6-OHDA抑制C6胶质瘤细胞对Glu的摄取,可能与其抑制细胞活性有关,而MPP+的抑制作用可能与直接影响转运体的摄取功能有关,并可能由PKC途径介导.
关键词： 6-羟基多巴胺 1-甲基-4-苯基吡啶离子 C6胶质瘤细胞 谷氨酸 摄取 -
芬太尼对C6胶质瘤细胞黄嘌呤氧化还原酶基因表达的影响
芬太尼同吗啡是较强的μ受体激动剂,许多实验已经表明μ受体介导了吗啡的依赖、耐受作用[1].芬太尼是常用于心脑血管外科手术的麻醉镇痛剂.芬太尼在细胞水平对核苷酸代谢相关酶的基因表达还不清楚.本文采用了高度灵敏的RT-PCR-Southern 杂交方法检测芬太尼对C6胶质瘤细胞黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase,XD)/黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase, XO)基因表达的影响.
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BrdU标记检测慢性吗啡对C6胶质瘤细胞增殖的影响
大鼠C6胶质瘤细胞稳定表达μ受体,也表达其它阿片受体,许多实难已经表明受介导了码啡的依赖、耐受作用[1].
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不同速率生长的胶质瘤细胞的葡萄糖代谢状态研究
目的观察不同速率生长的胶质瘤细胞的葡萄糖代谢状态.方法用C6细胞克隆培养得到不同细胞形态、不同生长速率的细胞株.分别检测生长快的C64细胞和慢的C61细胞的胞内葡萄糖、ATP浓度,同时检测两种细胞的己糖激酶蛋白和它们的胞质/线粒体己糖激酶活性.结果 C64细胞内检测不到葡萄糖,C61细胞内葡萄糖浓度为(0.17±0.05)μmol/g蛋白;C64细胞、C61细胞内ATP浓度分别为(10.16±1.51)μmol/g蛋白和(7.57±0.32)μmol/g蛋白.条带的吸光度分析显示C64细胞的己糖激酶Ⅰ稍高于C61细胞;C64细胞线粒体己糖激酶活性约为C61细胞的3倍,但其胞质己糖激酶活性仅为C61细胞的一半.结论葡萄糖转运系统与肿瘤细胞的葡萄糖摄取、葡萄糖代谢状态及生长速度等密切相关.
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VEGF单抗对低氧环境下C6胶质瘤细胞侵袭性的影响
目的 探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)单克隆抗体对低氧环境下C6胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响.方法 采用含有10％胎牛血清的DMEM培养基(对照组)培养C6胶质瘤细胞,加入终浓度为100 μmol/L氯化钴模拟缺氧环境(缺氧组),然后加入终浓度为0.1(VEGF-1组)、1(VEGF-2组)、10μg/ml(VEGF-3组)VEGF抗体处理.MTT法测定细胞活性,Transwell技术检测细胞侵袭和迁移能力,免疫印迹法检测粘着斑激酶(FAK)及富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)蛋白及其磷酸化水平.结果 对照组、缺氧组、VEGF-1组和VEGF-2组C6胶质瘤细胞增殖活性无显著差异(P＞0.05),但VEGF-3组细胞活性显著降低(P＜0.05).缺氧组和VEGF-1组C6胶质瘤细胞侵袭能力无显著差异(P＞0.05),但VEGF-2组C6胶质瘤细胞侵袭能力显著增强(P＜0.05).缺氧组、VEGF-1和VEGF-2组C6胶质瘤细胞FAK蛋白表达及其磷酸化水平无显著差异(P＞0.05).缺氧组、VEGF-1和VEGF-2组C6胶质瘤细胞Pyk2蛋白表达亦无显著差异(P＞0.05),但VEGF-2组Pyk2磷酸化水平显著降低(P＜0.05).结论 缺氧条件下,VEGF单抗显著增强C6胶质瘤细胞的侵袭能力,可能与Pyk2磷酸化水平增高有关.
关键词： 胶质瘤 C6胶质瘤细胞 侵袭 缺氧 血管内皮生长因子单克隆抗体 -
外胚间充质干细胞向小胶质细胞分化的研究
目的 观察外胚间充质干细胞(EMSCs)在大鼠胶质瘤模型中枢神经系统(CNS)内的分化方向.方法 将大鼠C6胶质瘤细胞系微量注射入12只SD大鼠(4～6周龄)右侧纹状体内,建立大鼠胶质瘤模型；C6细胞移植后2d,Hoechst 33342标记EMSCs移植到SD大鼠双侧纹状体内.EMSCs移植后7d行全脑组织冰冻切片,免疫荧光染色观察细胞表面标记OX-42(CD11b/CD11c)的表达,荧光显微镜下观察标记效果.结果 SD大鼠全脑组织切片观察证实12只大鼠脑胶质瘤模型建立成功；Hoechst 33342标记EMSCs阳性率达95％以上；荧光显微镜镜下观察显示注射入大鼠体内的EMSCs经过7d后大部分细胞都保持存活状态.同时有C6细胞和EMSCs存在的时候,C6细胞周围存在大量0X-42阳性细胞；而只有C6细胞或只有EMSCs时,0X-42阳性的细胞数量非常少.另外,远离C6细胞的EMSCs具有向C6细胞迁移的特性.结论 在SD大鼠胶质瘤模型纹状体内中,EMSCs大多数被C6细胞诱导成为具有吞噬和抗原提呈功能的小胶质细胞.
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125IUdR对大鼠C6脑胶质瘤细胞AgNOR和PCNA表达的影响
目的探讨5-[125I]-2′-脱氧尿苷(125IUdR)对大鼠C6胶质瘤细胞中嗜银核仁组织原区蛋白(AgNOR蛋白)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响.方法体外培养C6胶质瘤细胞,建立C6胶质瘤Wistar大鼠模型,合成125IUdR和127IUdR后于肿瘤原位局部注射,5日后处死动物取标本分别行AgNOR染色和PCNA免疫组织化学染色,计算AgNOR颗粒数目、面积和PCNA标记指数.结果125IUdR治疗组C6胶质瘤细胞的AgNOR颗粒计数和面积、PCNA标记指数分别为(1.70±0.42)个/细胞,(4.32±1.38)μm2/细胞,(36.87±14.51)%;对照组分别为(2.50±0.37)个/细胞,(7.01±1.97)μm2/细胞,(52.24±10.86)%,两组相比均相差显著(P＜0.05).结论125IUdR可掺入肿瘤细胞DNA的合成中,选择性的杀伤S期的肿瘤细胞,显著的抑制C6胶质瘤细胞中AgNOR和PCNA的表达,从而抑制胶质瘤细胞的增殖.
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miR-124对C6胶质瘤细胞增殖和迁移能力的影响
目的:研究miR-124对C6胶质瘤细胞增殖和迁移能力的影响.方法:体外培养C6胶质瘤细胞,依据转染不同分为空白对照组、阴性对照组和miR-124拟似物组.实时荧光PCR检测转染效率,绘制生长曲线,MTT实验检测miR-124对C6细胞增殖能力影响,计算抑制率.划痕实验检测miR-124对C6细胞迁移能力影响,计算迁移率.结果:生长曲线显示miR-124拟似物组C6细胞生长能力受到明显抑制,转染后第3天,miR-124拟似物组C6细胞数目显著低于阴性对照组(5.410±0.463Vs.6.917±0.385;P＜0.01);miR-124拟似物组mRNA表达量显著高于阴性对照组和空白对照组(5.92±0.56 vs.0.93±0.13和1.00±0.12;P＜0.01);MTT增殖实验显示miR-124抑制C6细胞增殖能力,miR-124拟似物组抑制率显著高于阴性对照物组(42.90±5.169 vs.10.24±3.351;P＜0.01);划痕实验显示miR-124明显抑制C6细胞迁移能力,阴性对照组迁移率显著高于miR-124拟似物组(98.79±1.210vs.81.72±5.972;P＜0.05).结论:miR-124能够显著抑制C6胶质瘤细胞的增殖和迁移能力.
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大鼠骨髓间充质干细胞分化的神经细胞在体外对C6胶质瘤细胞的趋向性
目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化后的神经细胞在体外对C6胶质瘤细胞的趋向性.方法 首先采用梯度离心分离BMSCs,在条件培养基中添加合适诱导因子诱导BMSCs分化为神经细胞,分化后的细胞进行免疫荧光细胞化学分析后与C6胶质瘤细胞采用Transwell培养板共培养,后对迁移的细胞做统计学分析.结果 BMSC成功诱导分化为神经细胞Nestin(24.3±5.2)%、NSE(33.6±3.8)%和NeuN(41.9±4.7)%,共培养实验显示实验组迁移细胞明显多于对照组迁移细胞(p＜0.05).结论 大鼠骨髓间充质干细胞分化后的神经细胞在体外对C6胶质瘤细胞具有明显趋向性.
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光动力学疗法对体外培养大鼠C6胶质瘤细胞的效应研究
目的 探讨血卟啉衍生物介导的光动力学疗法对体外培养大鼠C6胶质瘤细胞的杀伤效应.方法 ①应用MTT 法测定不同HpD浓度组(0,2,5,10,20,30及40 mg/L)C6细胞PDT(628 nm,20 mW/cm2,照光5 min)后的生存率;②采用光镜及电镜观察PDT后C6细胞的形态学变化;③DNA琼脂糖凝胶电泳检测各组样本的DNA条带;④TUNEL法检测各组样本PDT治疗后的细胞凋亡阳性率.结果 ①HpD浓度分别为2、5、10、20、30、40 mg/L各组样本的细胞生存率分别为:110.31±6.25%、74.63%±6.57%、41.74%±4.16%、36.43%±2.14%、31.94%±2.25%及30.25%±2.88%;②PDT后C6细胞(HpD浓度>5 mg/L时)出现细胞回缩等改变;透射电镜观察发现10 mg/L HpD组C6细胞出现染色质边集、凋亡小体形成等改变;20 mg/L HpD组C6细胞出现胞膜破裂崩解、细胞核肿胀等表现;③DNA琼脂糖凝胶电泳检测发现10 mg/L及5 mg/L HpD浓度组产生了明显的梯状条带;④TUNEL测定5 mg/L及10 mg/L HpD浓度组C6细胞凋亡阳性率分别为33%和63%;20 mg/L HpD浓度组细胞凋亡阳性率为6%.结论 当HpD浓度为2 mg/L时PDT对C6胶质瘤细胞无杀伤效应;当HpD≥5 mg/L时PDT治疗能够引起C6胶质瘤细胞出现细胞凋亡及坏死,较低浓度(5-10 mg/L)时C6细胞以凋亡为主,较高浓度HpD(≥20 mg/L)时C6细胞主要以坏死为主.
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苦参碱对C6胶质瘤细胞的增殖和原癌基因表达的影响
目的:本研究拟探讨苦参碱对胶质瘤细胞株(C6细胞株)的抑制作用及其作用机理.方法:应用MTT比色法检测不同浓度苦参碱对C6细胞的增殖抑制,应用流式细胞仪观察苦参碱对C6细胞周期的影响,应用RT-PCR观察原癌基因C-myc表达的变化.结果:苦参碱对C6细胞增殖抑制作用呈剂量依赖性,当浓度为0.20g/L时,对C6细胞增殖的抑制率达到(53.8±5.6)%.流式细胞仪分析显示,用0.20g/L苦参碱培养3 d,细胞周期中G0/G1期所占比例增加,S期占细胞周期的比例降低.RT-PCR结果显示,随着苦参碱作用剂量的增加,C-myc基因的表达被明显抑制.结论:苦参碱对大鼠胶质瘤细胞系C6的增殖具有明显的抑制作用,并对原癌基因C-myc的表达具有抑制作用.
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RNasin对脑胶质瘤细胞生长的抑制作用
目的:探讨核糖核酸酶抑制因子(RNasin)对脑胶质瘤生长的抑制作用及可能机理.方法:从人胎盘组织中提取制备RNasin,体内外观察其对人SHG44和大鼠C6胶质瘤细胞生长的抑制作用.结果:(1)体外不同浓度的RNasin对培养的C6及SHG44胶质瘤细胞存活率无明显影响,与对照组比较无显著性差异(P>0.05);(2)加入RNasin后裸鼠体内C6胶质瘤平均重量为1.72g±0.184g,平均大小(直径)为12.84mm±1.15mm;SHG44胶质瘤平均重量为1.012g±0.174g,平均大小为11.20mm±1.21mm,均与对照组有显著性差异(P<0.05).结论:RNasin体外对培养的胶质瘤细胞生长无抑制作用,而体内对胶质瘤瘤体的生长有明显抑制作用.
关键词： 核糖核酸酶抑制因子 胶质瘤 C6胶质瘤细胞 SHG44胶质瘤细胞 -
125Ⅰ球囊内照射治疗脑胶质瘤的研究
目的 了解不同剂量125Ⅰ硅胶球囊内近距离照射对C6胶质瘤细胞的生物学效应,探讨术后内置125Ⅰ球囊内照射治疗脑胶质瘤的临床效果.方法 将125Ⅰ-NaI溶液放入硅胶球囊内,对体外培养的C6胶质瘤细胞给予不同剂量的近距离照射,检测细胞死亡率、增殖抑制及细胞周期再分布情况.采用125Ⅰ充填球囊内照射方法治疗脑胶质瘤患者6例.近距离放射治疗剂量为60～80 Gy,持续照射5～8 d. 结果 与对照组相比,受照射组细胞死亡率、增殖抑制率明显增加,S期比例降低、G1期阻滞,细胞周期发生紊乱.应用于临床后随访一年1例死亡,生存5例,5例患者卡氏评分均较治疗前有明显提高.随诊期内未出现严重并发症.结论 125Ⅰ球囊内照射可以通过导致细胞死亡、细胞增殖抑制以及细胞周期改变在胶质瘤的治疗中发挥作用,方法简便,可提高患者的生存质量和延长患者的生存时间,不会导致严重并发症,是治疗胶质瘤的一种有效方法.
