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在原核细胞中重组人肝刺激因子的表达、纯化及其功能研究
目的肝刺激因子(hepatic stimulator substance, HSS)在肝细胞中含量甚微、纯化困难,至今未分离到理想的生化纯品.利用DNA重组技术,进行人肝刺激因子(human HSS, hHSS)基因原核表达研究.方法 hHSS基因片段经PstⅠ和NdeⅠ消化后,定向插入至pT7-7载体相应位点.转化感受态细菌DH5α,通过限制性酶切图谱分析及DNA测序反应鉴定hHSS基因.再将pT7-7-hHSS表达载体转化到BL21(DE3)中,以IPTG诱导hHSS表达,通过超滤膜及阴离子交换柱纯化,获得目的蛋白,经蛋白印迹杂交及蛋白质肽指纹图谱分析鉴定hHSS.重组hHSS作用于BEL-7402细胞,利用MTT法检测其促增殖作用.结果 pT7-7-hHSS正确地表达了hHSS,纯化的rhHSS具促增殖作用,并呈现剂量-效应关系.结论通过构建pT7-7-hHSS原核表达体系,能正确高效地表达hHSS,且具有生物学活性.
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人β细胞素基因原核表达载体的构建
目的 构建人BTC基因的原核表达载体.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列,克隆入原核细胞表达载体PET32a(+)中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.结果 PCR扩增的特异性片段长度为240 bp,以此构建的重组质粒PET32a(+)-BTC,经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后显示5.9 kb和250 bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人BTC基因cDNA(Genbank序列号NM_001729)序列一致.证明人BTC基因已成功克隆到了原核细胞表达载体PET32a(+)中.结论 成功构建了PET32a(+)-BTC重组原核表达载体.
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人睾丸特异表达基因PIAS-NY原核表达和多克隆抗体的制备
目的 构建PIAS-NY-pET30a原核表达载体,并诱导其成功表达,经纯化后获得高浓度的可溶性融合蛋白His-PIAS-NY,免疫小鼠获得鼠源性PIAS-NY多克隆抗体.方法 以人精原cDNA文库为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增PIAS-NY开放阅读框,克隆到pET30a表达载体中,酶切、PCR鉴定构建重组质粒.测序完全正确后将质粒PIAS-NY-pET30a转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行大量扩增,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.超声、离心、His-Ni柱亲和层析纯化包涵体蛋白,依次经过不同浓度尿素进行蛋白质复性,获得高浓度的可溶性His-PIAS-NY融合蛋白.分6次BalB/C小鼠腹腔注射乳化纯化蛋白.2个月后小鼠眼球取血,收集血清.结果 成功构建原核表达质粒PIAS-NY-pET30a;利用终浓度1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h,大肠杆菌BL21大量表达融合蛋白His-PIAS-NY,并以包涵体形式存在于菌体中;尿素变性后His-Ni柱纯化融合蛋白,复性后获得高浓度的可溶性蛋白His-PIAS-NY;6次免疫后收获存活小鼠抗血清;酶联免疫吸附测定(ELISA)抗血清滴度达到1:100000;免疫印迹和免疫共沉淀证实PIAS-NY抗血清能特异性识别293T细胞和GC2细胞中PIAS-NY蛋白.结论 成功获得PIAS-NY多克隆抗体,而且具有高反应性和高特异性,PIAS-NY在GC2细胞和293T细胞中表达,并且能够与RUVBL2蛋白发生相互作用.
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奶牛主要过敏原β-乳球蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建
目的 克隆奶牛主要过敏原β-乳球蛋白(BLG)基因及其原核表达载体的构建.方法 RT-PCR克隆奶牛主要过敏原BLG的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增奶牛BLG基因的完整开放阅读框,与pET-28a载体连接,构建原核表达载体.结果 克隆了奶牛主要过敏原BLG基因,且构建了其原核表达载体.该基因含有长度为537 bp的开放阅读框,编码178个氨基酸.该蛋白质的相对分子质量为19 883,等电点为5.14(GenBank数据库中的登录号为EU883598).序列同源性分析发现其与数据库中已知的BLG基因同源性很高.结论 成功克隆了奶牛主要过敏原BLG基因及其原核表达载体的构建,为进一步奶牛主要过敏原BLG的重组表达和免疫活性鉴定等奠定基础.
关键词： 奶牛 过敏原 β-乳球蛋白(BLG) 原核表达载体 -
HBx基因缺失型突变体HBx-d382与HBx-d431原核表达载体的构建和鉴定
目的 为探讨HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431在临床上应用的价值,构建HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431原核表达载体.方法 以pGM-T/HBx-d382和pGM-T/HBx-d431质粒为模板,PCR扩增含EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的HBx基因片段.HBx基因PCR扩增产物与载体pET-28a(+)经双酶切、连接,形成重组DNA后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经卡那霉素筛选、酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组HBx基因缺失型突变体原核表达载体.结果 成功构建了重组pET-28a(+)/Hax-d382和pET-28a(+)HBx-d431原核表达载体,重组前后HBx基因片段序列一致.结论 pET-28a(+)/HBx-d382和pET-28a(+)/HBx-d431原核表达载体构建成功,为HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431蛋白的免疫原性和临床应用的研究奠定了基础.
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家蚕蚕蛹过敏原几丁质酶基因的克隆和原核表达载体的构建
目的 克隆、表达家蚕蚕蛹过敏原几丁质酶基因,并构建其原核表达载体.方法 提取家蚕的总RNA,RT-PCR克隆家蚕过敏原几丁质酶的全长基因,设计简并引物,扩增家蚕几丁质酶基因的完整开放阅读框,与pET-28a载体连接,构建原核表达载体.结果 成功克隆家蚕主要变应原几丁质酶基因并构建其原核表达载体.该基因含有长度为1 668 bp的开放阅读框,编码555个氨基酸.该蛋白质的相对分子质量为61 500,电点为5.78,编码序列与数据库中已知的家蚕几丁质酶基因的同源性为99%.结论 成功克隆家蚕蚕蛹主要过敏原几丁质酶基因并构建了原核表达载体,为家蚕蚕蛹过敏原几丁质酶的重组表达和免疫活性鉴定等奠定了基础.
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人MMP-11原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11的构建及其融合蛋白的表达和纯化
目的构建表达人基质金属蛋白酶-11(MMP-11)N-端肽段的重组原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11,获得人源性MMP-11融合蛋白.方法应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从正常人子宫内膜组织扩增目的基因片段,利用体外基因重组技术将目的基因片段连接到原核表达载体pGEX-5X-3上构成重组的原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11,并通过酶切和测序进行鉴定.将重组质粒转化人大肠杆菌DH5a后挑选阳性克隆,用异丙基硫代半乳糖苷诱导其融合蛋白的表达并进行纯化.结果RT-PCR获得预期大小的特异性DNA片段,经双酶切鉴定及测序证实已将人基质金属蛋白酶-11N-端肽段的cDNA片段正确插入原核表达载体中.融合表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,证实相对分子量大小为4 550.结论成功构建了表达人MMP-11N-端肽段的重组原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11,获得相对分子量为4 550的GST-MMP-11融合蛋白,为进一步制备抗人MMP-11抗体及其在临床中进一步推广应用于恶性肿瘤的快速诊断及临床疗效的评价奠定了基础.
关键词： 基因重组 基质金属蛋白酶-11 表达与纯化 原核表达载体 -
大鼠IgE依赖组胺释放因子重组蛋白纯化效果的优化
目的 提高大鼠IgE依赖组胺释放因子(rHRF)的可溶性表达水平,改善其亲和层析纯化效果,为深入研究该重组蛋白的生物学功能奠定基础.方法 选择多克隆酶切化点BamH I和Xho I,将rHRF完整编码区基因从原有的pET-30a-rHRF重组质粒亚克隆至pET-28a载体,构建重组质粒pET-28a-rHRF;转化大肠杆菌BL21(DE3)后,通过改变IPTG浓度(0.1～1.0 mmol/L),调节诱导表达温度(25～37℃)和时间(1～5 h),筛选能够提高rHRF可溶性表达水平的条件;同时改进亲和层析纯化的条件,提高纯化效果.结果 成功构建重组质粒pET-28a-rHRF,不同IPTG浓度、诱导温度和时间对重组蛋白的可溶件表达水平无明显影响.但是,与pET-30a-rHRF转化菌相比,pET-28a-rHRF转化菌所表达的重组蛋白因其N端和C端均带有6xhis标签,增强了目的 蛋白与树脂的结合力,而使亲和层析纯化效果(重组蛋白的浓度和纯度)显著提高.结论 rHRF重组蛋白的可溶性表达水平不受IPTG浓度、诱导表达温度和时间的影响.但是可溶性重组蛋白两端均携带6xhis标签可使亲和层析纯化效果显著提高,从而有利于获得足昔rHRF 用于进一步的生物学功能研究.
关键词： 大鼠 IgE依赖组胺释放因子 原核表达载体 蛋白质纯化 -
高效hCu,Zn-SOD-PTD融合蛋白的表达及其穿膜功能的研究
目的 探讨hCu,Zn-SOD-PTD融合蛋白的表达及其穿膜功能. 方法 首先,人工设计合成蛋白转导域序列(protein transduction domain,PTD),以人胚肝组织的总RNA为模板,逆转录扩增得人铜锌超氧化物歧化酶全长cDNA序列.其次,将此序列及人工合成PTD序列定向插入pET16b载体;测序鉴定后,将构建成功的重组载体导入E coli BL21菌株,异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,经镍柱纯化,洗脱液经SDS-PAGE检测.后,将纯化产物与食管癌细胞(EC9706)共孵育,用激光共聚焦和流式细胞仪的方法检测蛋白穿膜能力及活性. 结果 测序结果与人铜锌超氧化物歧化酶全长cDNA序列相符;SDS-PAGE结果出现18.6 kd和20 kd的目的条带;激光共聚焦和流式细胞仪的方法显示蛋白可穿膜且保持活性. 结论 本实验成功构建了PET16b/hCu,Zn-SOD-PTD原核表达质粒,可在大肠杆菌中稳定表达融合蛋白,融合蛋白具有穿膜且保持活性.
关键词： 蛋白转导域 人铜锌超氧化物歧化酶 生物膜 原核表达载体 内化作用 -
NT4-A1融合基因原核表达载体的构建
目的 构建神经营养素(NT4)与肿瘤血管抑制肽Alphastatin融合基因的原核表达载体pBV220-NT4-A1.方法 采用非对称互补引物(模板)法,依据GenBank提供的Alphastatin基因序列,设计合成并扩增出肿瘤血管抑制肽Alphastatin的cDNA:将其连接到NT4的信号肽和前导序列3'端,组成融合基因NT4-A1,再将该融合基因亚克隆于表达载体pBV220,构建pBV220-NT4-A1.结果 经DNA测序、限制性内切酶酶切等方法 证实Alphastatin成功重组到NT4信号肽和前导序列3'端,并将融合基因亚克隆于pBV220内.结论 成功构建原核表达载体pBV220-NT4-A1,为进一步研究肿瘤基因治疗奠定了基础.
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利用原核表达系统制备肾癌相关抗原G250/MN/CA Ⅸ
目的 利用原核表达系统制备肾癌相关抗原G250/MN/CA Ⅸ.方法 采用PCR法从原有质粒中扩增G250/MN/CA Ⅸ全长编码序列,将获得的编码序列片段插入pET32a(+)表达载体,转化Rosseta大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,而后进行纯化及Western blot鉴定.结果 正确构建pET32a(+)/G250重组质粒,重组质粒转化Rosseta菌后,经IPTG诱导,在58 000相对分子质量处有明确的条带.目的蛋白表达占菌体总蛋白的32.7%.89.9%的重组蛋白是可溶性的.Western blot结果显示纯化后的蛋白可以与G250单克隆抗体M75特异性结合.结论 在原核系统中成功进行G250/MN/CAⅨ的高效表达,为下一步的单克隆抗体制备和蛋白功能研究奠定了基础.
关键词： 肾肿瘤 G250/MN/CA Ⅸ抗原 克隆 原核表达载体 -
小鼠B7-H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备
目的 探讨小鼠B7-H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备.方法 采用特异性引物扩增小鼠B7-H4(mB7-H4)胞外功能区DNA,经酶切、拼接构建原核表达载体pET28a-mB7-H4.将构建的重组表达质粒转化入E.coli BL21 (DE3)菌株,采用IPTG诱导表达、Ni-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白、SDS-PAGE分析蛋白纯度.将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定.结果 序列测定证实了构建的pET28a-mB7-H4重组表达载体含有mB7-H4编码序列,其序列分析与GenBank中公布序列对比一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为26.5 KD的目的蛋白,SDS-PAGE分析表明纯化后的目的蛋白达到电泳纯.双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16,ELISA法检测抗体效价为1∶12 800,Western blot分析显示抗体能特异性结合mB7-H4.结论 成功制备了高表达重组mB7-H4蛋白的原核表达载体及高效价抗mB7-H4多克隆抗体,为进一步研究B7-H4的功能奠定了基础.
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人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10基因的克隆、原核表达载体的构建及表达
目的 获取泛素偶联酶家族成员之一的UBE2C/UbcH10的基因,构建具有His标签的原核表达载体,在大肠杆菌中表达UBE2C/UbcH10蛋白.方法 利用RT-PCR的方法 从肝癌细胞HepG2中获得UbcH10的基因,克隆到pMD-19T载体中并测序鉴定,酶切回收后插入原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达载体pET32a-UbcH10,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达.结果 重组表达载体pET32a-UbcH10在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导4h获得稳定高效的融合表达.重组蛋白以可溶形式存在,大小在29.0 kD左右.结论 UbcH10重组表达载体的成功构建以及重组蛋白的表达,为进一步其结构和功能的研究奠定了基础,有望揭示该蛋白在癌症发生发展过程中的作用.
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凋亡素原核表达载体的构建和表达
目的构建凋亡素原核表达系统,以制备抗原物质凋亡素融合蛋白.方法通过PCR方法,以pcDNA-VP3质粒为模板,扩增出凋亡素VP3基因.将其克隆到原核表达载体pET-DsbA的多克隆位点,构建成凋亡素的高效原核表达载体pET-DsbA-VP3,将该质粒转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plysS中,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白.结果转化有凋亡素原核表达载体pET-DsbA-VP3的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plysS经IPTG诱导后,聚丙烯酰胺凝胶电泳出现 38300 的目的蛋白条带.结论凋亡素原核表达载体pET-DsbA-VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白.
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多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2表达载体的构建
目的:构建DAZAP2原核表达重组质粒,以获得DAZAP2蛋白用于制备抗DAZAP2抗体.方法:提取一正常人骨髓总RNA,逆转录后,以其作为模板,PCR扩增DAZAP2的开放阅读框,采用定向克隆法与原核表达载体连接,转染大肠杆菌,酶切及测序分析.结果:获得阳性重组质粒,读框没有发生改变.结论:成功获得DAZAP2的原核表达重组质粒,可以用于下一步实验.
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诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质的原核表达载体构建研究
目的构建一种诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质的原核表达系统,以制备抗原物质凋亡素融合蛋白.方法通过PCR的方法,以pcDNA-VP3质粒为模板,扩增出凋亡素VP3基因.将其克隆到原核表达载体pET-DsbA的多克隆位点,构建成凋亡素的高效原核表达载体pET-DsbA-VP3,将该质粒转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plysS中,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白.结果转化有凋亡素原核表达载体pET-DsbA-VP3的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plysS经IPTG诱导后,聚丙烯酰胺凝胶电泳出现38.3KD的目的蛋白条带.结论凋亡素原核表达载体pET-DsbA-VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白.
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对嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型重组env的研究
目的 探讨人类嗜T淋巴细胞病毒( Human T-cell Lymphotropic Virus,HTLV)I型重组env抗原的表达.方法 分析和选择HTLV-Ⅰ env目的基因,将目的基因片段分别克隆人原核表达载体pQE80L,PCR和酶切鉴定重组子,诱导并亲和层析纯化表达重组env蛋白抗原,Western-blot检测重组env蛋白抗原活性,ELISA方法测试重组env蛋白抗原的特异性.结果 PCR扩增和酶切筛选得到阳性重组子pQE80L-env.SDS-PAGE显示重组蛋白相对分子质量约为25KDa,与预期分子量相符.免疫印迹在约25KDa有一明显特异印迹条带.转染细胞培养48h,SDS-PAGE分析,有相对分子质量约为27KDa目的重组蛋白表达,与预期的融合蛋白大小相符.ELISA检测到正常人、HIV阳性和HTLV-Ⅱ阳性的参考血清均为阴性；HTLV-Ⅰ阳性的参考血清为强阳性.结论 HTLV-Ⅰ env基因5915nt-6545nt区,可以利用原核系统表达得到特异性HTLV-Ⅰ重组抗原,重组抗原无显著性差异,有望成为检测试剂的抗原.
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猪和小鼠endoglin原核表达载体的构建及重组蛋白的诱导表达和纯化
目的:体外扩增猪和小鼠endoglin胞外段基因序列,构建猪和小鼠endoglin重组原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,并对表达产物进行分离、纯化和鉴定.方法:设计猪和小鼠endoglin胞外段基因序列的引物,利用RT-PCR技术扩增克隆猪和小鼠endoglin胞外段基因序列,通过限制性核酸内切酶酶切,然后用T7酶连接,构建猪和小鼠endoglin胞外段的原核表达质粒pQE-pEDG和pQE-mEDG.筛选的重组质粒经酶切和DNA序列测定等证实正确后,再转染感受态大肠杆菌JM109,用IPTG诱导表达.表达产物经Ni-NTA亲合层析进行分离纯化,后用SDS-PAGE和免疫印迹法进行鉴定.结果:琼脂糖凝胶电泳发现扩增克隆的猪和小鼠endoglin胞外段基因序列分子量大小和预期值相一致,酶切分析显示,pQE-pEDG和pQE-mEDG和预期值相符,DNA序列测定显示,目的基因片段和阅读框架正确无误.重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达,表达的重组蛋白分子量与预期值相一致,纯化的蛋白浓度达90%以上,抗小鼠endoglin抗体可特异性识别pEDG和mEDG.结论:成功构建了猪和小鼠endoglin的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达并纯化,为进一步了解重组endoglin蛋白质作为疫苗是否可以有效诱导产生抗自身endoglin的免疫反应奠定了基础.
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人泛素-核糖体蛋白27a原核表达载体构建及表达
目的 构建并表达携带谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的人泛素-核糖体蛋白S27a(UBRPS27a)原核表达载体.方法 利用反转录聚合酶链反应从HL-60细胞中扩增RPS27A基因全长,克隆至pMD-19T载体中,酶切回收后插入原核表达载体pGEX4T-1,构建重组表达载体pGEX4T1-RPS27A,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达GST-UBRPS27a融合蛋白.结果 经测序与酶切鉴定,重组质粒pGEX4T1-RPS27A构建正确;经重组质粒转化的BL21细菌诱导4 h后可高效表达UBRPS27a融合蛋白.结论 成功构建UBRPS27a原核表达载体,为进一步研究其结构、功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础.
关键词： 泛素-核糖体蛋白S27a 原核表达载体 构建 表达 -
人幽门螺杆菌VacA与HspA双价疫苗载体的构建
目的:构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HsPA)和空泡毒素(VacA)编码基因的重组载体,进行核甘酸序列分析,为在E.coliBL21中表达,及其抗原性的研究奠定基础.方法:利用分子克隆技术,扩增HpI-IspA、VacA编码基因,分别将其与载体pET32a(十)进行酶切、连接,同时将筛选的pET32a(+)/HspA和pET32a(+)/VaeA重组载体分别经Xho工、BamHI双酶切,通过凝胶电泳回收pET32a(+)/I--IspA和VaeA片段,经T4连接酶将pEI'32a(+),qtspA和VacA编码基因连接,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体.结果:经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为I--IpHspA和VacA编码基因,由1080bp组成,与GenBank报道的相比较,有3.4％的碱基发生变异,1.10％的氨基酸残基改变;但编码的蛋白质特性无本质性改变.结论成功地克隆了HpHspA和VacA编码基因,并构建了能够同时表达mpa和VacA蛋白的双价疫苗重组载体,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础.
