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pETNF-P16质粒的构建及其在食管癌细胞中的辐射诱导表达特性
目的构建重组质粒pETNF-P16并研究其在食管鳞状细胞癌细胞系EC9706中X射线照射诱导表达特性和基因-放射治疗食管癌的可行性.方法构建重组质粒pETNF-P16,通过脂质体介导转染EC9706细胞.利用ELISA,Western blot和免疫细胞化学的方法检测pETNF-P16在被转染的EC9706细胞中的X射线照射诱导表达特性.结果成功构建真核载体pETNF-P16并转染EC9706细胞.在不同剂量X射线照射后被转染细胞中TNFα的表达量明显高于0 Gy组(P＜0.05或P＜0.01).2GyX射线照射后2～48 h TNFα和P16的表达量明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.001).在正常的EC9706细胞中没有P16的表达,在转染组和辐射诱导组中P16有较强的表达.结论在pETNF-P16质粒转染的EC9706细胞中X射线可诱导TNFα和P16的表达增强.本研究结果为临床食管癌基因-放射治疗进一步研究提供实验基础.
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pEgr.p-TNFα的构建及其在NIH3T3细胞中的辐射诱导表达
目的分离和扩增Egr-1启动子,构建pEgr p-TNFα质粒,探讨不同辐射剂量对被转染的NIH3T3细胞中TNFα表达的影响.方法用PCR方法从小鼠基因组DNA中分离并扩增出Egr-1启动子,构建pEgr.p-TNFα表达质粒,脂质体介导的转染法转染小鼠NIH3T3细胞,用ELISA方法检测不同剂量X射线照射后的TNFα表达水平.结果本实验得到的Egr-I启动子序列与报道基本一致,Egr-1启动子和TNF α cDNA正确插入表达载体;各照射组在不同剂量X射线照射后8 h,TNFα表达水平均高于假照射组(P＜0.05～0.001).结论本实验分离和扩增的Egr-1启动子具有辐射激活和诱导下游基因表达增强的功能,低剂量辐射可激发并启动下游基因表达,在基因-放射联合治疗中有重要意义.
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辐射诱导pEgr-sHemopexin在MCF-7细胞的表达和侵袭能力及人脐静脉内皮细胞小管形成的影响
将治疗基因克隆于可被辐射诱导激活的Egr-1启动子下游,利用Egr-1基因的调控序列可被辐射刺激的特点,形成基因和射线对肿瘤的双重杀伤作用,是近年来放射治疗研究的热点[1-2].下游目的基因的选择,对提高肿瘤基因放射治疗疗效至关重要.基质金属蛋白酶2(MMP-2)C端血色素结合蛋白样片段PEX可阻断血管生成和细胞外基质的降解,从而抑制肿瘤的生长、侵袭和转移[3-5].本研究根据Egr-1基因启动的辐射激活特性和PEX的抗血管生成和阻断细胞外基质的降解作用,将肿瘤抑制基因治疗和放射治疗二者联合起来,在构建pEgr-sHemopexin(pEgr-sPEX)重组表达质粒的基础上,观察体外pEgr-sPEX重组质粒辐射诱导表达特性,检测辐射诱导pEgr-sPEX对MCF-7细胞侵袭能力及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)小管形成的影响,探讨抑癌作用.
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人穿孔素N端肽段的放射诱导表达研究
目的:构建人穿孔素N端(hPFN-N)的真核放射诱导表达载体,并在放射诱导条件的刺激下研究hPFN-N的表达产物(rhPFN-N)在肺癌细胞SPC-A1中的分布及其对该细胞的细胞毒性作用.方法:以克隆有hPFN全长cDNA序列的载体pcDNA3.1(+)/hPFN为模板,用PCR扩增hPFN-N,将该基因片段克隆到含放射诱导启动子的真核表达载体pcDNA3.1(+)/ Egr-1中,以重组体稳定转染SPC-A1细胞,经过X射线的放射诱导后,应用RT-PCR、细胞免疫化学法检测hPFN-N蛋白的表达,用MTT法测定该蛋白对靶细胞的杀伤活性.结果:成功构建了真核放射诱导表达载体pcDNA3.1(+)/ Egr-hPFN-N.以重组体转染SPC-A1细胞后,用RT-PCR检测到hPFN-N mRNA的表达.细胞免疫化学法检测结果呈阳性反应,MTT法检测结果为rhPFN-N对靶细胞的杀伤活力为 29.2%.结论:构建了pcDNA3.1(+)/ Egr-hPFN-N真核放射诱导表达载体,在经过X射线的放射诱导后,hPFN-N能够在SPC-A1细胞的细胞膜上大量表达,表达产物rhPFN-N对靶细胞有明显杀伤活力.
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pNEgr-mIL-12真核表达重组质粒的构建及在COS-7细胞和黑色素瘤B16细胞中的表达
目的:构建含辐射敏感启动子的pNEgr-mIL-12真核表达载体,转染哺乳动物细胞后经不同剂量X射线照射,检测mIL-12的表达.方法:限制性内切酶酶切构建pNEgr-mIL-12表达载体;脂质体转染法转染COS-7细胞和B16细胞;ELISA法检测mIL-12p70表达.结果:①pNEgrmIL-12重组质粒转染瞬时表达细胞COS-7细胞,经不同剂量X射线照射后,照射组mIL-12表达量比未照射组明显增高(P＜0.05,P＜0.001),约为未照组的1.5～2.5倍;在2.0 Gy照后表达增高为明显,表达于照后4 h达峰值,在观察的72h内保持于较高水平;②转染pNEgr-mIL-12的B16细胞于2.0 Gy照后增高明显,为未照射组的1.5倍;并且经2.0 Gy X射线照射后随时间延长表达水平逐渐增高;低至0.05 Gy的剂量对两种细胞亦均有激活作用.结论:pNEgr-mIL-12重组质粒具有辐射激活下游基因表达的功能,且经不同剂量X射线照射后表达均有增强,尤以2.0 Gy照射组作用明显,但在低剂量50、75、100 mGy照后表达水平增高与对照组差异均有显著性.
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pEgr-angiostatin基因辐射诱导表达特性及其抗肿瘤作用
目的:检测pEgr-angiostatin重组质粒在B16细胞中的辐射诱导表达和观察pEgr-angiostatin基因-放射治疗的抗肿瘤作用.方法:用RT-PCR方法从小鼠肝脏中扩增出angiostatincDNA,经测序证实后,构建pEgr-angiostatin重组质粒,脂质体介导的转染法转染小鼠B16细胞,检测B16细胞内angiostatin mRNA的辐射诱导表达,体内观察pEgr-angiostatin基因-放射治疗的抑瘤作用.结果:测序表明扩增的angiostatin cDNA序列与报道基本一致,Egr-1启动子和angiostatin cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1,转染B16细胞内angiostatin mRNA的表达具有辐射诱导特性,pEgr-angiostatin基因-放射治疗荷瘤小鼠具有明显的抑瘤作用.结论:成功地克隆小鼠angiostatin基因,并证实pEgr-angiostatin的辐射诱导表达规律及其基因-放射治疗的抗肿瘤作用.
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小鼠Egr-1启动子的克隆及其辐射诱导特性的研究
目的：扩增Egr-1启动子并构建Egr-PGL重组质粒，探讨不同剂量X射线诱导被转染的NIH3T3细胞荧光素酶表达活性。方法：利用PCR方法扩增Egr-1p与PGL3-E表达载体连接，用发光仪测定荧光素酶与底物反应的发光值，分析X射线诱导荧光素酶表达。结果：对PCR产物进行测序，序列基本正确；电泳检测重组质粒，有正确的特异性片段；重组质粒转染小鼠NIH3T3细胞鉴定Egr-1p的辐射调节特性，发现照射组发光值均高于假照组，75 mGy照射组的表达量约为假照组的5倍，2、4、6、8和10 Gy照射组的表达量分别约为假照组的5～7.5倍。结论：扩增得到的Egr-1启动子在不同剂量X射线照射下均具有诱导下游基因表达增强作用；低剂量照射诱导Egr-1启动子下游基因表达增强作用的发现可能在肿瘤基因治疗中更具有实用价值。
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含Egr-1启动子和Smad7基因的重组腺病毒的构建
目的:构建含Egr-1启动子和Smad7 cDNA的重组复制缺陷型腺病毒并初步验证其活性,为下一步的基因治疗奠定基础.方法:以Adeno-XTM表达试剂盒为基础,应用分子克隆技术,将穿梭质粒pShuttle的CMV启动子替换为Egr-1启动子,再将Smad7 cDNA亚克隆至穿梭质粒内,然后与腺病毒DNA重组,转化大肠杆菌E.coli DH5α,PCR鉴定正确即为pAdES.脂质体法转染HEK293细胞,包装出完整腺病毒,然后大量扩增测定滴度.重组腺病毒感染成纤维细胞(3T6),经深部X线照射后通过免疫细胞化学方法检测Smad7蛋白在细胞内的表达定位.结果:经酶切、PCR及测序鉴定证实成功构建了含Egr-1启动子和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒pAdES.病毒滴度为1.0×1011 TCID50/ml.细胞免疫化学结果显示Smad7蛋白表达定位于细胞质内.结论:利用Adeno-XTM表达试剂盒,通过分子克隆体外重组技术可以方便的构建重组腺病毒载体,并能在HEK293细胞内成功包装和扩增.通过重组腺病毒可在细胞质内表达外源性Smad7蛋白.
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人穿孔素C端肽段的放射诱导表达
目的 观察克隆的人穿孔素(perforin,PFN)羧基端肽段在肺癌细胞SPC-A1中的放射诱导表达及其对该细胞的杀伤活性.方法 用PCR方法获取hPFN-C基因片段,将该基因片段克隆到含放射诱导启动子的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Egr-1,脂质体介导转染SPC-A1细胞.放射诱导表达后,RT-PCR、免疫细胞化学方法检测该基因片段在SPC-A1中的表达.MTT法检测该基因片段的表达产物对SPC-A1细胞的杀伤活性.结果 成功获取hPFN-C基因片段,构建了放射诱导表达的真核表达载体,转染SPC-A1细胞后,免疫细胞化学法证实目的蛋白出现在细胞质中,而未照射的细胞则没有hPFN-C基因表达. MTT法检测显示,与对照组相比,有hPFN-C 表达的SPC-A1细胞存活率仅为0.657.结论 成功构建hPFN-C基因片段的放射诱导表达载体,它在SPC-A1细胞中获得可控性表达,其表达产物对该细胞具有较强的杀伤活性.
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人Egr-1启动子调控的自杀基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞株中的放射诱导表达
[目的] 构建由人Egr-1放射诱导性启动子调控的自杀基因靶向性真核表达载体,并转染人鼻咽癌细胞株CNE,比较射线诱导前后自杀基因在鼻咽癌细胞中的表达情况.[方法] 根据Genebank数据库提供的人Egr-1启动子基因序列,设计一对引物克隆人Egr-1启动子,采用PCR、酶切、连接等分子生物学技术,构建pcDNA3.1(+)-Egr-1-CD重组质粒表达载体,并利用脂质体转染方法转染人CNE细胞株,经G418筛选后获得阳性细胞克隆.RT-PCR分析鉴定0、5、10、15、20Gy放射剂量进行6MV X线照射对CD基因表达的影响.[结果] 经PCR、酶切、测序等证实了pcDNA3.1(+)-Egr-1-CD重组靶向性质粒表达载体构建成功,G418筛选所得到的CNE细胞阳性克隆经不同放射剂量的诱导后,RT-PCR结果显示体外放射线照射可显著提高CNE细胞中CDmRNA的表达水平,在10Gy及15Gy组CDmRNA的表达水平明显增高.尤以15Gy组CDmRNA的表达水平高,在20Gy组CDmRNA的表达水平反而下降.[结论] pcDNA3.1(+)-Egr-1-CD重组质粒表达载体构建成功,并成功转染人鼻咽癌细胞株,建立了基因表达与放射的剂量效应关系,为后续的临床应用研究奠定基础.
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放射线诱导hEgr-1-CD对鼻咽癌CNE放射增敏作用的研究
目的 研究放射线诱导hEgr-1-CD自杀基因前药系统对鼻咽癌CNE细胞株放射增敏作用.方法 将pcDNA3.1(+)Egr-1-CD利用脂质体转染的方法转染入鼻咽癌细胞株,给予不同剂量的X线照射观察基因表达与放射的剂量效应关系,观察不同的放射线及不同剂量的前药对鼻咽癌细胞的杀伤效应.结果 电离辐射可诱导增强自杀基因阳性鼻咽癌CNE细胞株中CD基因的表达,电离辐射与前药5-Fc的联合应用大大增强了对自杀基因阳性细胞的杀伤作用,其杀伤作用大于单独自杀基因前药系统和单独照射.结论 hEgr-1-CD自杀基因前药系统对鼻咽癌CNE细胞株有放射增敏作用,其与放射联合应用对CNE细胞有明显的协同杀伤作用.
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Egr-1启动子辐射诱导的基因表达特性
目的:研究电离辐射作用下早期生长反应因子1(Egr-1)启动子调控增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因在人结肠癌细胞SW480中的表达.方法:利用基因重组手段构建质粒Egr-1-EGFP;阳离子脂质体介导转染人结肠癌细胞SW480,给予不同剂量γ射线照射,流式细胞仪检测照射后不同时间点EGFP的表达.结果: 电离辐射能够诱导Egr-1启动子调控下游基因的表达,且6 Gy照射后为明显,在照射后24 h达到高峰.结论:Egr-1启动子具有电离辐射诱导特性.
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靶向性质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV·Egr-1CDglyTK的构建及转染研究
目的构建靶向性基因治疗载体pcDNA3.1(-)CMV*Egr-1CDglyTK并进行转染研究.方法采用PCR、RT-PCR、融合PCR、酶切、连接等技术构建pcDNA3.1(-)CMV*Egr-1CDglyTK表达载体,成功转染鼻咽癌CNE-2细胞,绘制细胞相对存活率曲线,初步研究该载体在前体药物干预下对CNE-2细胞生长的影响.结果表达pcDNA3.1(-)CMV*Egr-1CDglyTK的CNE-2细胞在5-FC/GCV干预下生长受到抑制.结论 pcDNA3.1(-)CMV*Egr-1CDglyTK可作为鼻咽癌基因治疗的载体.
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电离辐射对鼻咽癌HNE1细胞中Egr-1启动子的诱导作用研究
目的研究电离辐射对HNE1细胞中Egr-1 pCAT质粒的诱导作用.方法 Egr-1 pCAT质粒和β-gal Control质粒共转染入HNE1细胞,用60Co和核素两种放射因素对转染细胞进行干预,而后提取细胞裂解液进行β-gal和CAT分析.其中的β-gal 结果作为内对照.结果证实了该质粒对电离辐射敏感,并呈时间和剂量依赖性.其中,Tc-99 m在6 MBq/ml加药后12 h时能达到大活性,为PBS对照组的2.4倍.而60Co照射在10 Gy照射后6 h能达到大活性,为对照组的3.2倍.结论 60Co和Tc-99 m等电离辐射对HNE1细胞中克隆Egr-1启动子有诱导作用,并呈现时间和剂量依赖性.上述实验为进一步在Egr-1启动子下游构建各种肿瘤治疗基因,靶向NPC的基因治疗提供了重要的实验依据.
关键词： 鼻咽肿瘤/放射疗法 辐射 电离 Egr-1启动子 NPC细胞/辐射效应 -
人Egr-1启动子的克隆及其在肿瘤细胞中的辐射诱导反应
目的:克隆人Egr-1基因的启动子, 插入荧光素酶报告基因载体中, 并检测电离辐射对其活性的影响.方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出Egr-1启动子, 将其克隆到pGL3-basic载体中;将重组质粒转染人肿瘤细胞, 测定Egr-1启动子在不同辐射条件下转录活性的改变.结果:成功构建了Egr-1启动子的荧光素酶报告基因;在不同剂量的γ射线照射后, Egr-1的启动子活性均明显高于未照射组;在同一剂量照射后48 h, Egr-1的启动子活性达峰值.结论:本实验构建的Egr-1启动子具有辐射激活的功能, 为进一步研究放射-基因治疗奠定了基础.
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重组质粒pEgr-P16在EC9706细胞中的辐射诱导凋亡作用
背景与目的:研究pEgr-P16重组质粒在食管癌细胞系EC9706中的辐射诱导凋亡作用.材料与方法:pEgr-P16重组质粒通过脂质体介导转染人食管癌EC9706细胞,定量RT-PCR检测2 Gyγ射线照射后被转染细胞中P16的表达和细胞凋亡率的变化.结果:对照组无P16蛋白表达,转染质粒组细胞接受2Gyγ射线照射后2～24 h P16表达量与时间呈曲线关系,在22 h时P16的mRNA水平高;P16基因联合放射可诱导食管癌细胞凋亡,凋亡率高于单纯照射组和单纯基因诱导组.结论:γ射线可诱导pEgr-P16重组质粒在人EC9706细胞中表达并显著提高EC9706细胞的凋亡率.本研究结果为食管癌基因-放射治疗的进一步研究奠定了实验基础.
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pEgr-P16重组质粒的构建及其在EC9706细胞中的辐射诱导表达
目的:构建pEgr-P16重组质粒并检测其在人食管癌细胞系EC9706中的辐射诱导表达.方法:人P16cDNA基因连接到Egr-1启动子的下游构建成pEgr-P16重组质粒,利用脂质体介导转染人EC9706细胞,用Western blot方法检测不同剂量γ射线照射后被转染细胞中P16的表达.结果:酶切鉴定证实pEgr-P 16重组质粒构建正确.被pEgr-P16重组质粒转染的人食管癌EC9706细胞经不同剂量γ射线照射后,P16基因表达均高于未照射组.结论:γ射线可诱导pEgr-P16重组质粒在人EC9706细胞中表达增强.
关键词： Egr-1启动子 γ射线 p16表达 食管癌细胞系 Western blot
