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Nageotte计数方法改良分析
去白细胞成分血在我国已广泛应用,但多数医院输血科未能对去白细胞成分血的残留白细胞进行质量控制,主要原因是检测方法(常规Nageotte计数法)较难掌握.常规Nageotte计数法计数残留白细胞,其敏感度可达0.1个白细胞/μl.但细胞计数时,血样本须用Tuk's白细胞稀释液稀释10倍,以溶解红细胞.南于白细胞在破碎的红细胞层,龙胆紫染色后,在显微镜目镜20倍或物镜10倍强光下才能辨认,目前输血科多数显微镜达不到上述要求,我们尝试血标本用Percoll液梯度离心,取得良好效果,现报告如下.
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SHR 大鼠前额叶、纹状体突触体的提取方法
目的：介绍SHR大鼠前额叶、纹状体突触体的提取方法。方法采用Percoll密度梯度离心法制备突触体，透射电镜观察其形态和结构完整性。结果本实验所获取的突触体形态上呈连续膜封闭的椭圆结构，周围有完整的膜包围；突触前成分可见一个或多个线粒体和大量突触小囊泡；突触间隙清晰可见，且突触后部分特征性的致密部结构完整，形态清晰，密度较高。突触体突触前膜、突触间隙、突触后膜保存完好，突触体分布密度较高，具有典型的突触体形态结构特征。结论本实验提供了一种耗时少，产出率高，结构完整、形态典型且可运用于精细化研究的突触体制备新技术，补充了传统技术的不足，为神经系统疾病的研究提供技术支持。
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应用Percoll分离纯化组织工程用肌卫星细胞
目的探讨应用改良Percoll非连续密度梯度离心法分离纯化培养组织工程用肌卫星细胞.方法分别采用差速贴壁法和Percoll非连续密度梯度离心法进行兔肌卫星细胞的原代培养、光镜及扫描电镜检查细胞形态,通过免疫细胞化学染色方法鉴定培养细胞纯度,噻唑蓝法测定细胞生长曲线.结果差速贴壁法所得细胞纯度为30%～40%,Percoll非连续密度梯度离心法所得细胞纯度在90%以上,两种方法光镜及电镜检查均符合卫星细胞形态,细胞生长曲线显示细胞生长状况良好.结论应用Percoll非连续密度梯度离心法可以得到高纯度的肌卫星细胞,可以作为组织工程用种子细胞的培养方法.
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一种简便经济的肝库普弗细胞分离方法
目的 介绍一种简易、经济、高效的肝库普弗细胞分离方法,为研究库普弗细胞在肝病及全身性疾病中的作用提供细胞模型.方法 参照国内外文献方法加以改良,采用前灌流液在体灌流肝脏后,再用Ⅳ胶原酶离体灌流消化,Percoll分离液行密度梯度离心分离库普弗细胞,贴壁培养;锥虫蓝测定细胞活度,并用荧光显微镜、免疫组织化学以及吞噬功能实验行细胞纯度鉴定.结果 肝库普弗细胞的获得量为(5～10)×107/肝,细胞活度为90%以上,细胞纯度95%以上.贴壁后细胞呈典型的星型或三角型,免疫组织化学染色显示CD163(ED2)阳性,显微镜下可见细胞质内被吞噬的碳素颗粒.结论 本方法简便、高效,不需要特殊的设备,便于推广使用;获得的细胞活度和纯度较高,可用于库普弗细胞进一步的实验研究.
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人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化
背景:胎盘的细胞成分较复杂,其中所包含的滋养细胞在母胎免疫耐受过程中起重要作用,胎盘间充质干细胞具有多向分化潜能以及抑制淋巴细胞增殖的特性,常规分离方法通常难以获得大量且纯度较高的上述两种细胞.目的:拟建立一次操作即可同时获得大量、较高纯度的滋养细胞和胎盘间充质于细胞的操作方案.方法:人胎盘组织洗净剪碎,采用胰蛋白酶和DNAse I共同消化,分3个阶段,每个阶段在恒温37℃下180 r/min消化2 min.重悬消化产物,200目筛网过滤后采用Percoll密度梯度分离液分离,分别收集滋养细胞层和胎盘间充质干细胞层.滋养细胞层以差速贴壁法去除成纤维细胞,胎盘间充质干细胞直接接种于75 cm2培养瓶中培养.观察胎盘组织消化情况,计数滋养细胞数量及其细胞角蛋白7的表达,观察胎盘间充质干细胞生长增殖、表型及成骨分化潜能.结果与结论:经胰蛋白酶和DNAse I消化后,胎盘组织仅剩少许残渣.差速贴壁后,滋养细胞数达(5.48±1.98)×10~8个,细胞角蛋白7阳性率为(90+4.36)%.胎盘间充质干细胞接种19～21 d达90%融合,细胞数为(1.96±0.24)×10~6个,强表达CD29,CD44和HLA-ABC,不表达CD34,CD45,CD14和HLA-DR,诱导后茜素红染色呈鲜艳橙红色,可向成骨细胞方向分化.提示采用胰蛋白酶和DNAse I共同消化胎盘组织,并结合Percoll不连续密度梯度分离液分离细胞,可同时一次性获得大量的滋养细胞和较多的胎盘间充质干细胞,细胞纯度和活性均较好.
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大鼠睾丸Leydig细胞的分离纯化技术方法研究
目的为了深入研究Leydig细胞及其调控因素,采用本实验以获取较高纯度(60%～85% ,甚至 90%以上)的Leydig细胞.方法利用Percoll不连续密度梯度离心法,可以简便迅捷地获取较高纯度(60%～85%,甚至 90%以上)的Leydig细胞.结果得到较高纯度(60%～85% , 甚至 90%以上)的Leydig细胞.结论本实验采用简便迅捷的方法,虽然不能得到高纯度(95%以上)的Leydig细胞,但可以用简单的设备,较短的时间,获得满足实验要求的较高纯度(60%～85%,甚至 90%以上)的Leydig细胞,并通过体外细胞培养,取得具有生物学活性的Leydig细胞克隆,为进一步研究这种细胞提供了条件.
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大鼠仔鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与鉴定
目的分离培养骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)并进行鉴定.方法取周龄大鼠骨髓用percoll分离液分离,DMEM(含20%胎牛血清)培养、传代,碱性磷酸酶和苏丹Ⅳ染色,流式细胞仪测MSCs表面标志CD44和CD45.结果碱性磷酸酶染色和苏丹Ⅳ染色阴性,CD44、CD45表达甚微.结论所分离培养的细胞为未分化的具有较强增殖能力的细胞,可认为是间充质干细胞.
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Percoll密度离心富集慢性粒细胞白血病DC前体细胞
目的:建立一种有效、费用低的富集慢性粒细胞白血病树突状细胞(DC)前体细胞的方法.方法:Ficoll-Hypaque液常规分离慢性粒细胞白血病(CML)外周血单个核细胞,55%Percoll密度离心,比较Percoll分离后的低密度层细胞(B组)、高密度层细胞(C组)及未经Percoll分离细胞(A组)的细胞分类、诱导后CD1a、CD86表达.结果:55%Percoll混悬液分离后的B组细胞中早幼粒和中幼粒细胞所占百分比高于A组(P＜0.05)和C组细胞(P＜0.01),而淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的百分比明显少于C组,较A组也有所减少.B组细胞经诱导14 d后CD1a、CD86阳性细胞百分率明显高于C组细胞和A组细胞(P＜0.01).结论:经55%Percoll混悬液分离外周血单个核细胞可提高DC诱导的比率,且该方法无毒、费用低、易操作、分离细胞数量大,可充分满足临床DC的回输需要.
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1层和2层梯度离心法分离精子的效果评价
目的:评价1层和2层Percoll密度梯度离心法分离精子的效果. 方法:20份精液标本分别行50%1层,90%和45%Pereoll 2层密度梯度离心分离,处理前后应用SCA(sperm class analyzer)精子质量分析仪分析精子密度、活力和圆形细胞密度. 结果:1层法分离后精于回收率为(65.5±12.8)%,明显高于2层法(P<0.01);1层和2层法分离后a级精于百分率明显高于处理前(P<0.05,P<0.01),而1层法分离后a级精子百分率明显低于2层法(P<0.05);1层法分离精于后c级精子百分率明显高于2层法(P<0.05),与处理前相比没有明显差异(P>0.05);2层法分离后a+b级精子百分率明显高于处理前(P<0.05),1层法分离后a+b级精于百分率与处理前相比投有明显差异(P>0.05);1层和2层法分离后圆形细胞密度明显低于处理前(P<0.05,P<0.01),两种方法之间没有差异(P>0.05). 结论:1层法分离后精子回收率较高,精子的活力改变不大;2层法分离后精于回收率较低,精子的活力明显改善;1层和2层法都可以较好地把精于与圆形细胞分开.两种方法各有优势,在精于体外处理中都有着重要的应用价值.
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Percoll密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞
肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)活化并分泌胶原等基质成分,是肝纤维化发生、发展的中心环节[1];是目前肝纤维化实验研究的热点.
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小鼠肝脏淋巴细胞几种分离方法的比较
目的:通过比较几种肝脏淋巴细胞分离方法得到的总淋巴细胞、T细胞、自然杀伤T细胞(NKT cells)及自然杀伤细胞(NK细胞)的比例和细胞绝对数,明确各种方法的适用范围.方法:按照析因设计,将不放血(A法)、摘眼球放血(B法)、体循环灌流(C法)、摘眼球结合体循环灌流(B法+C法)4种肝脏预处理方法和单浓度离心法(Ⅰ法)、非连续密度梯度离心法(Ⅱ法)2种Percoll分离方法进行全面组合,共获得8种组合条件,分离小鼠肝脏淋巴细胞,用流式细胞术检测各类型细胞比例.结果:肝脏预处理方法中B法+C法获得淋巴细胞比例高,A法获得淋巴细胞绝对数高,B法获得的NKT细胞和NK细胞比例和细胞绝对数均高;Ⅱ法获得的淋巴细胞、T细胞、NKT细胞和NK细胞比例和细胞绝对数均高于Ⅰ法.对于NKT细胞比例和NK细胞绝对数,肝脏预处理方法和Percoll浓度之间有交互作用(P＜0.01和P＜0.05),其他均无交互作用(P＞0.05).结论:采用摘眼球放血结合体循环灌流法,结合Percoll非连续密度梯度法(33%+70%),可获得较高数量和比例的固有免疫细胞,有助于对肝脏固有免疫细胞如NKT细胞、NK细胞等的研究.
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宫腔内人工授精术治疗不孕症524例分析
目的探讨宫腔内人工授精术的临床应用.方法用Percoll梯度离心法对精子进行筛选.结果524例施术者中妊娠116例,妊娠率达22.14%.结论宫腔内人工授精术适用面广,是治疗不孕症的有效方法.
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大鼠睾丸间质细胞分离及其鉴定
目的和方法:通过血管冲洗、Ⅱ型胶原酶消化以及Percoll梯度离心,建立大鼠睾丸间质细胞分离方法.结果:(1)Percoll密度梯度离心后纯化的间质细胞3β-HSD染色阳性百分率可达85%.(2)1.2×10-3IU/ml hCG可显著性增加间质细胞睾酮的分泌(P＜0.05).结论:提示该方法可靠且具有一定应用前景.
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SD大鼠肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定
目的:建立一种良好的SD大鼠肾小管上皮细胞原代培养、传代及鉴定方法.方法:选用4周龄SD幼鼠的肾皮质进行细胞培养,采用机械研磨、胰酶消化、过滤,Percoll密度梯度离心法分离纯化肾小管后,选择含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行原代培养及传代.制作细胞爬片,用免疫细胞化学(Cytokeratin 18表达阳性)进行鉴定.结果:肾小管上皮细胞围绕肾小管节段呈岛屿状向四周生长,4～5 d后基本达到融合,细胞呈多边鹅卵石样,透明度及折光性强.结合形态学及免疫细胞化学鉴定,原代培养及传代的细胞98%以上为肾小管上皮细胞.结论:采用此方法分离培养的肾小管上皮细胞数量多,均一性生长佳,可重复性操作良好.
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一种大鼠腹腔肥大细胞分离方法
目的 介绍一种密度梯度离心分离大鼠腹腔肥大细胞(RPMC)的技术.方法 比较改良方法和原方法2种分离的细胞量、活性及纯度.台盼蓝染色检测细胞存活率;甲苯胺蓝染色检测肥大细胞纯度.将弃去密度梯度离心上液2 ml(A方法)与2.5 ml(B方法)比较,以分析弃去的细胞液的量与肥大细胞纯度的关系.用C48/80刺激分离的RPMC,检测细胞释放的β-氨基己糖苷酶和组胺以确定分离的RPMC脱颗粒活性;透视电镜扫描观察细胞.结果 改良方法分离的细胞显著多于原方法分离的细胞数;两种方法分离的细胞存活率都在99%以上;肥大细胞纯度都在90%以上.C48/80刺激RPMC,分离的细胞释放大量的β-氨基己糖酶和组胺,高于空白对照组.电镜观察细胞具有明显的肥大细胞形态.结论 改良的Percoll密度梯度离心分离大鼠腹腔肥大细胞的方法可行.
关键词： 腹腔肥大细胞 Percoll C48/80β-氨基己糖苷酶 组胺 甲苯胺蓝 -
Nycodenz-密度渗透压介质离心分离人外周血单核细胞研究
目的 研究人外周血单核细胞分离方法.方法 采集24名健康志愿献血者外周血,分别以EDTA-K2、肝素钠、枸橼酸钠抗凝,将抗凝全血或单个核细胞悬液缓慢加入不同密度和渗透压组合的Nycodenz-NaCI溶液上层,离心分离单核细胞;EDTA抗凝血经Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得的单个核细胞,再分别用Nycodenz-NaCl密度渗透压介质离心法、Percoll密度梯度离心法、贴壁法、MACS(抗CD-14磁珠)分离单核细胞.结果 如上4种方法 获得的单核细胞纯度和收获率中位数(M)分别为98.9%和68.5%、89.6%和64.5%、64.8%和60.5%、94.1%和73.5%,比较显示Nycodenz法获得的单核细胞纯度高(P<0.01);吞噬指数和趋化指数分别为188.8±11.2和26.8±5.9、187.8±12.2和26.1±5.1、144.4 ±24.8和15.4±7.3、177.1 ±18.3和18.9±6.7.统计表明Percoll法和Nycodenz法获得的单核细胞的吞噬指数、趋化指数高于贴壁法和MACS法(P<0.05);单核细胞受LPS刺激分泌细胞因子IL-12p70、IL-10、TNF-α水平(pg/ml)分别为2 545±341、1 216±397、3.999±418,2 489±425、1080±277、3 891±446,2 147±223、794±180、3268±411,35±12、142±81、407±199,比较得知MACS的单核细胞受LPS刺激分泌细胞因子IL-12p70、IL-10、TNF-α水平非常显著低于其他方法 (P<0.01);单核细胞经典亚群CD14+CD16-HLA-DR+百分比和非经典亚群CD14+CD16+HLA-DR+百分比(M)分别为89%和5%、88%和1%、73%和1%、51%和36%,统计表明MACS法的单核细胞经典亚群百分比明显低于其他分离方法 (P<0.01),而非经典亚群百分比明显高于其他方法 (P<0.01).结论 Nycodenz-NaCl密度渗透压介质离心法能够分离获得较高纯度、较多经典型的单核细胞.
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原代大鼠肝细胞分离与纯化方法
目的 探讨改良、简化肝细胞的灌注、分离方法,以提高细胞产量,降低制作成本.方法 对传统的两步原位胶原酶灌流法进行改进,改变灌注方式,分离的大鼠肝细胞采用三次低速离心,台盼兰染色检测活率,并与Percoll梯度离心纯化法进行比较.结果 大鼠肝细胞经低速离心后,活率仅(48.38±6.97)%.三次离心后再经Percoll梯度离心纯化后活率为(92.63±2.50)%,纯度＞95%,纯化前后活率比较差异有显著性(P＜ 0.01)结论 该方法要求设备简单、容易操作,细胞产量、活率及纯度高.
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介绍一种大鼠肝细胞的分离和培养方法
介绍分离、纯化大鼠肝细胞(用胶元酶二步灌流和Percoll不连续密度离心)及分离后的培养.此方法可靠易行,可制备出质量合格的肝细胞(实质细胞).讨论了保证分离和纯化成功的一些关键步骤、条件和原理.提出分离肝细胞应首选胶元酶Ⅳ,Percoll的渗透压和pH也是影响肝细胞的漂浮密度和存活能力的因素.
