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16个X-STR基因座在河南汉族人群中的法医学应用评估
目的 调查16个X-STR基因座在河南汉族人群中的遗传学数据,评估其法医学应用价值.方法 应用GoldeneyeTM DNA身份鉴定系统17X试剂盒,对河南地区326名汉族无关个体DNA进行PCR扩增,3130xl型遗传分析仪电泳分析,GeneMapper(R) ID-X软件分析等位基因片段大小.统计分析16个X-STR基因座的频率数据和群体遗传学参数,并与其他地区已有人群数据进行比较.结果 在所检测的16个X-STR基因座中,DXS6800具有中度多态性,其余15个基因座均具有高度多态性.这16个X-STR基因座在女性群体的累积个人识别率为0.999 999 999 999 992,在男性群体的累积个人识别率为0.999 999 996 577 712,在三联体中的累积非父排除率为0.999 999 971,在二联体中的累积非父排除率为0.999 992 574. 结论 这16个X-STR基因座达到了法医物证学应用要求,尤其对特殊的亲权鉴定案件具有重要的应用价值.
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XPG基因表达用于法医学年龄推断
目的 探讨着色性干皮病G组(xeroderma pigmentosum group G,XPG)基因在不同年龄段健康汉族人群中的表达情况,分析XPG mRNA和蛋白表达量与年龄之间的相关性,以期为法医学年龄推断提供新的分子生物学指标.方法 收集150名不同年龄段健康汉族人的外周血样,采用TRIzol法提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)总RNA,通过实时荧光定量PCR检测XPG mRNA在PBMC的相对表达量,酶联免疫吸附试验检测XPG蛋白在血浆中的表达量. 结果 XPG mRNA及其蛋白表达量在≤18岁组与19～45岁组之间、≤18岁组与≥46岁组之间的差异均有统计学意义(P＜0.05),但19～45岁组与≥46岁组之间的差异无统计学意义(P＞0.05).XPG mRNA和蛋白表达量均无性别差异(P＞0.05).结论 XPG mRNA在PBMC的相对表达量在低龄段内随年龄增加而下降,其血浆中蛋白随年龄增加而升高;XPG基因有望成为法医学年龄推断的新型指标之一.
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多重置换扩增在含抑制物检材中的应用
目的：研究多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）在含抑制物检材中的抗抑制能力，与磁珠法纯化检材相比较，证明其在法医学中的应用及意义。方法将不同浓度血红素和腐殖酸与样本DNA进行混合，分为MDA处理组、磁珠法处理组和空白对照组，PCR-STR单基因座D3S1358扩增联合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并应用AmpF?STR?IdentifilerTM Plus试剂盒联合毛细管电泳检测。结果血红素质量浓度大于1 ng/μL或腐殖酸质量浓度大于0.1 ng/μL时，空白对照组经单基因座STR检测不能得到扩增产物；磁珠法处理组血红素质量浓度大于100 ng/μL或腐殖酸浓度大于1 ng/μL时，不能够得到扩增产物；MDA处理组各浓度抑制物均能成功扩增，完全不受抑制物影响。结论 MDA技术可消除血红素及腐殖酸的抑制作用，其抗抑制能力优于磁珠法纯化DNA，具有一定的法医学应用意义。
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应用微生物菌群鉴定阴道分泌液
目的 探究特异性存在于阴道分泌液中的微生物菌群.方法 收集阴道分泌液16份、唾液样本16份、粪便样本16份、精液样本8份、外周血样本8份、尿液样本5份及鼻腔分泌液样本4份,对卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、惰性乳杆菌和阿托波氏茵的16S rRNA基因进行扩增,PCR产物采用3130xl型遗传分析仪进行检测.结果 卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、惰性乳杆菌和阿托波氏茵在阴道分泌液中的检出份数分别为15、5、8、14和3份.卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌特异性存在于阴道分泌液中.结论 检测卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌对鉴定阴道分泌液具有潜在的应用价值.
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广东地区汉族人群VEGF基因5'端SNP位点遗传多态性
目的 调查广东地区汉族人群VEGF基因5'端SNP位点的遗传多态性,为法医学应用及群体遗传学研究提供基础数据. 方法 DNA微测序技术SNaPshot分析184例广东地区无关个体VEGF基因5 '端4个SNP位点(rs699947、rs1570360、rs833061、rs2010963)的遗传多态性.应用PowerMarker v3.25软件进行统计分析.结果 184例广东地区汉族无关个体VEGF基因5'端4个SNP位点基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05),每个位点均检出3种基因型.rs833061和rs699947位点紧密连锁.共检出6种单倍型,其中C-G-T-C、C-G-T-G、A-A-C-G、A-G-C-G频率均＞10％,为主要单倍型.rs699947、rs833061、rs2010963位点的个人识别率为0.583～0.634,非父排除率为0.133～0.144;4个SNP构成单倍型的个人识别率为0.868,非父排除率为0.438. 结论 广东地区汉族人群VEGF基因5'端序列呈现出高度遗传多态性,可作为个人识别和亲权鉴定的遗传学指标,同时可用于相关疾病关联分析.
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24个Y-STR基因座荧光标记复合扩增体系的建立
目的 构建包含24个Y-STR基因座的荧光标记复合扩增体系.方法 选择DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS635、DYS587、DYS527a/b、DYS460、Y-GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、DYS570、DYS385a/b、DYS44424个Y-STR基因座,构建荧光复合扩增体系.检测该体系的特异性、同一性、灵敏度、扩增均衡性、抗干扰性和准确性,调查其在广东地区人群的基因多样性.结果 建立的复合扩增体系在检测的非人类及女性样本中未发现谱带,同一个体不同组织检测结果一致,0.1 ng以上标准品9948可检测获得完整分型结果.常见抑制物中体系内加入120~200μmol/L血红素、1.5~2.0 mmol/L钙离子时出现等位基因丢失,对靛蓝、腐殖酸、EDTA具有较强抗干扰性.通过146例无关个体与Yfiler系统平行检测比对,24 Y-STR检测体系分型准确.广东地区人群单倍型多样性(HD)为0.99972,优于Yfiler系统(HD=0.99858).结论 本研究建立的24个Y-STR基因座荧光标记复合扩增体系法医学应用前景广阔,可用于案件检验、亲权鉴定与Y-STR数据库建设.
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广东汉族人群H19基因上游差异甲基化区SNP
目的 调查广东汉族人群中H19基因上游差异甲基化区(differentially methylated region,DMR)的单核苷酸多态性(SNP)及单倍型.方法 应用PIA分型法,以限制性内切酶McrBC、HpaⅡ消化基因组DNA分别获得个体单亲源DNA模板链,经测序,分别获得个体H19基因上游DMR单亲源SNP等位基因、基因型及单倍型数据.结果 共检出13个SNP(rs10840167、rs2525883、rs12417375、rs4930101、rs2525882、rs2735970、rs2735971、rs11042170、rs2735972、rs10732516、rs2071094、rs2107425、rs4930098)及1个突变点(g7351c).所有位点经统计学分析均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05).除rs12417375位点DP值为0.279,其余12个SNP DP值在0.446~0.614;g7351c突变点DP值为0.013,提示为南方汉族民族特异性位点.共检出8种单倍型(命名为单倍型1~8),其中有3种为新发现的单倍型,其DP、PIC、PE及H分别为0.891、0.714、0.524和0.758.结论 PIA分型法获得的H19基因上游DMR SNP位点及其单倍型遗传标记系统具有较高的鉴别能力,在法医学鉴定中具有较好的实用价值.
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STR基因座与Amelogenin的峰面积比在DNA降解评估中的应用
目的：研究DNA降解过程中STR基因座与性别基因座Amelogenin（AMEL）峰面积比（STR/AMEL）的变化规律，探讨STR/AMEL值在评估DNA降解程度中的应用。方法取人体髂腰肌组织抽提DNA，分析DNaseⅠ酶人工降解后STR/AMEL值（Penta E/AMEL、Penta D/AMEL、FGA/AMEL）的变化，并分析室外环境自然降解的髂腰肌组织中三者比值的变化。以降解时间为自变量（x），STR/AMEL值为因变量（y），进行回归曲线分析，建立两种条件下三组曲线方程。结果人工降解及自然降解条件下STR/AMEL值与降解时间均呈负相关，一元三次方程能够较好地模拟STR/AMEL值随降解时间的变化规律。人工降解条件下， R2均大于0.99；自然降解条件下，R2均大于0.86。结论 STR/AMEL 值（Penta E/AMEL、Penta D/AMEL、FGA/AMEL）与DNA降解程度呈负相关，有望应用于DNA降解程度的评估。
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六色荧光标记快速PCR扩增体系的建立及验证
目的：建立PCR快速扩增程序和体系，并对其技术指标进行验证。方法采用六色荧光标记技术，对24个常染色体STR基因座、1个Y-STR基因座和Amelogenin、Y-InDel基因座进行复合扩增及毛细管电泳检测，同时考察体系的灵敏度、特异性、同一性、稳定性、混合样本及批量样本测试，并观察各种常见检材及降解、脱落细胞检材的分型情况。结果所建立的体系灵敏度达0.0625 ng，快速扩增仅耗时65 min就可获得准确分型；种属特异性高；各种纸质血样本和混合、降解、脱落细胞检材的分型正确。结论本研究建立的快速扩增体系可显著提升检验速率，分型准确、稳定，对建立STR数据库、研究群体遗传学和进行法医学鉴定有重要意义。
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外显子组测序对1例青壮年猝死的分子遗传学分析
目的：以1例青壮年不明原因猝死综合征（sudden unexplained death syndrome，SUDS）案例为研究对象，采用全外显子组测序技术，在全外显子组水平寻找与SUDS相关的致病基因突变。方法对1例常规尸体解剖及病理学检验未发现明显致死性病理改变的SUDS病例样本，利用Ion Torrent PGMTM系统进行全外显子组测序。测序数据以hg19为参照序列，并通过PhyloP、PolyPhen2、SIFT等软件进行突变功能分析。后设置三重条件过滤筛选有意义的单核苷酸变异：选取错义突变-等位基因频率<1%-蛋白质功能预测。结果共发现4个罕见的可疑致病性单核苷酸变异。结合尸体解剖及病理学检验的结果，确定1个“高危害性”突变MYOM2（8_2054058_G/A）。 PolyPhen2、SIFT的预测均为“有害”。结论利用二代测序技术进行全外显子组水平的基因突变检测和分析，可以为SUDS病例的死因分析提供新的方法和思路。 MYOM2基因新可能是SUDS的致病基因，但其具体机制仍需进一步研究。
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计算混合样本似然率方法的分析与探讨
目的：对混合样本似然率的四种计算方法进行分析和探讨。方法以2013年CNAS-T0757能力验证的1例样本为例，使用四种常用方法（无限制性组合的似然率法、Clayton等的计算方法、p2定律的计算方法和ISFG推荐方法）分别计算似然率，并进行比较。结果 Clayton等的计算方法、ISFG推荐方法得出的似然率高，其次为无限制性组合的似然率法得出的结果，p2定律得出的似然率低。结论无限制性组合的似然率法大程度兼顾了信息的保留及鉴定人的保护。
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Ion Torrent PGMTM系统检测孕妇血浆中胎儿游离DNA
目的：探讨Ion Torrent PGMTM系统用于孕妇外周血血浆中胎儿游离DNA的Y-STR检测的可行性。方法采集8例孕晚期（38周）和8例孕中期（12周）的无关孕妇外周血血浆，提取胎儿游离DNA，对DYS390、DYS391、DYS393、DYS438、DYS437、DYS456、DYS635共7个基因座进行复合扩增，在Ion Torrent PGMTM系统进行Y-STR测序分析和毛细管电泳分析，并将两者结果进行比较。结果在分娩男性胎儿的孕晚期及中期孕妇血浆中均检测到Y-STR片段，测序检测得出的基因座比毛细管电泳检测得出的多，且与分娩胎儿的Y-STR基因型相一致。结论 Ion Torrent PGMTM系统用于孕妇外周血血浆胎儿游离DNA的Y-STR检测，具有高灵敏度、高通量的特点，且有较好的法医学应用价值。
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GlobalFiler?PCR扩增试剂盒验证及其STR遗传多态性
目的：测试GlobalFiler?PCR扩增试剂盒技术性能指标，评估其法医学应用价值，并对其遗传多态性进行调查。方法从灵敏度、混合样本、种属特异性、适应性、耐受性、一致性、均衡性、稳定性8个方面对该试剂盒进行测试，自动工作站提取北京地区汉族人群373名无关个体血样DNA进行扩增检测。结果GlobalFiler?PCR扩增试剂盒灵敏度较高，对混合、酶切降解和含抑制剂样品具有一定的检测分析能力，适应性和均衡性较好。21个STR基因座基因型频率分布均符合Hardy－Weinberg 平衡（P>0．05），PIC 值在0．536~0．940，H值在0．558~0．933，DP值在0．783~0．992，PE值在0．243~0．874。结论 GlobalFiler?PCR 扩增试剂盒可用于法庭科学实际检案与建库，21个STR基因座在北京汉族人群中具有较高的遗传多态性，对法医学应用和群体遗传学研究具有重要意义。
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福建畲族人群26个Y－STR基因座遗传多态性及其法医学应用
目的：对GoldeneyeTM DNA身份鉴定系统26Y试剂盒在畲族人群中的法医学应用进行研究。方法应用毛细管电泳分型技术，对53名福建地区畲族男性无关个体的26个Y－STR基因座进行检测，获得基因型分布状况，计算等位基因频率及单倍型多样性等群体遗传学参数，并对福建畲族与其他民族群体遗传关系进行分析。结果53名无关个体中的26个Y－STR基因座共观察到126个等位基因，等位基因频率为0．0101~0．8868。26个Y－STR基因座的GD值为0．2112~0．8462，有19个基因座的GD值大于0．5。共观察到47种单倍型。根据RST构建的遗传距离矩阵显示福建畲族与闽南汉族之间遗传距离近，其次是南方汉族，与北方民族的遗传距离相对较远。结论 GoldeneyeTM DNA身份鉴定系统26Y试剂盒所包含的26个Y－STR基因座在福建畲族中多态性较好，在特殊案件中可作为良好的补充体系，具有法医学应用价值。
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Y-STR遗传标记在大家系中的突变
目的：调查大家系中Y-STR基因座在减数分裂等位基因传递过程中的突变现象。方法收集一个林姓父系家系的163个男性个体口腔拭子样本，采用AGCU Y24荧光检测试剂盒（AGCU Y24体系）进行22个Y-STR遗传标记分型。AGCU Y24体系包含YfilerTM复合扩增试剂盒（Yfiler体系）的全部16个Y-STR遗传标记。比较该家系内男性个体两两之间的Y-STR分型差异。结果该林姓家系163个男性个体在Yfiler和AGCU Y24体系分别获得20和30种单倍型，男性个体两两之间单倍型差异率分别为0.9105和0.9227，平均遗传标记差异数目分别为6.5821个和9.8248个。男性个体两两之间的单倍型差异率随着减数分裂次数增多而增加。结论 Y-STR突变会使同一父系男性个体的Y-STR基因分型产生差异，随着减数分裂次数增多差异增加。
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Goldeneye?DNA身份鉴定系统26Y试剂盒的法医学验证
目的：对Goldeneye?DNA身份鉴定系统26Y试剂盒的法医学参数进行验证和分析。方法根据DNA分析方法科学工作组（Scientific Working Group on DNA Analysis Methods，SWGDAM）对试剂盒的法医学验证要求，从PCR扩增体系的测试、重复性、准确性、灵敏度等多个角度对该试剂盒进行检测评估。应用该试剂盒对华东地区517名汉族健康无关个体进行Y-STR基因座分型检测，检测单倍型分布状况及频率信息，并评估该试剂盒的法医学参数。结果该试剂盒对6.25μL扩增体系、DNA量低至125 pg时仍然可以得到准确的分型结果。特异性检测发现该试剂盒对常见的动物DNA和微生物DNA无有效的扩增结果。男性混合样本（1∶19和19∶1）中，较少样本的等位基因检出率可以达到70%以上；在男女混合样本中，女性DNA背景的存在不影响试剂盒的灵敏度。结论 Goldeneye?DNA身份鉴定系统26Y试剂盒灵敏度高、特异性好，且可以应用于混合物的检测。试剂盒所包含的26个Y-STR基因座多态性良好，可满足法医学实际应用。
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16个X-STR基因座的连锁不平衡检验和突变率调查
目的：检测X染色体上16个STR基因座的连锁不平衡情况，并对其遗传稳定性进行调查。方法从华东汉族群体选取女性无关个体500名、家系885个，提取血样DNA，利用自主研发的IDtyperX-16试剂盒对16个X-STR基因座进行多重PCR扩增和毛细管电泳分型，使用PowerMarker v3.25软件对基因座进行连锁不平衡检验，并分析各个基因座的突变率。结果16个X-STR基因座彼此之间不存在连锁不平衡现象；有10个基因座检见突变，其中DXS6809和DXS7132的突变率均高达0.0048。结论对于IDtyperX-16试剂盒中的16个X-STR基因座，在亲权鉴定中应用时可运用乘积原理计算似然率，但若遇到不符合遗传规律的情形（尤其是DXS6809、DXS7132基因座），应考虑存在突变的可能。
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miniSTR荧光检测体系的建立及法医学应用
目的 建立检测片段均小于150bp的miniSTR荧光检测体系,提高对微量降解检材DNA的检测效能. 方法 应用Primer Premier 5软件设计、FastPCR 6.0筛选引物,组合成用四色荧光标记引物的miniSTR复合扩增体系.优化PCR检测条件和引物浓度,在3100-Avant仪上用POP4胶进行电泳检测.分型结果用DNA标准品9947A和007进行验证,并通过检测新鲜血样、疑难微量检材评估该体系的法医学应用效能.结果 建立的miniSTR荧光检测体系(D12A TA 63、D2S1776、D1GA TA 113、D4S2408、D17S974、D20S482、D3S3053、Ame logenin、D6S474、D9S1122)中各基因座的检测片段均小于150bp,各等位基因扩增均衡性良好,无非特异性扩增产物,等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡,累积个体识别率为0.999999983,三联体累积非父排除率为0.996 8.能成功检测腐败肌肉组织、低拷贝数DNA检材以及在40％甲醛溶液中固定12d的人体组织. 结论 miniSTR荧光检测体系可独立应用于降解DNA样本的个体识别鉴定或补充应用于亲权鉴定,提高对微量、降解检材DNA的检测能力.
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30个InDel位点在华东汉族和畲族人群的法医学应用
目的 评估Investigator(R) DIPplex试剂盒中30个插入/缺失(insertion/deletion,InDel)多态性位点在华东汉族和畲族人群的法医学应用价值.方法 采用Investigator(R) DIPplex试剂盒对华东地区565名汉族和119名畲族无关个体进行分型检测,统计分析30个位点的等位基因频率和群体遗传学参数.结果 在华东汉族人群中平均Ho为0.413 3,平均DP为0.551 1,平均PIC为0.320 0.在畲族人群中平均Ho为0.389 6,平均DP为0.543 3,平均PIC为0.3100.30个位点在汉族、畲族人群中均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05).结论 Investigator(R) DIPplex试剂盒包含的30个位点在华东汉族和畲族中多态性良好,在特殊亲权鉴定案件中可作为良好的补充体系.
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微滴式数字PCR技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量
目的 运用微滴式数字PCR技术进行生物样品的种属鉴定和绝对定量.方法 选择人mtDNA两个编码基因ND4和16S rRNA,设计特异性引物与探针,用人来源及常见动物样本验证种属特异性,再用重组质粒和2组共16份人来源生物检材,倍比稀释.使用微滴式数字PCR技术进行种属检验和绝对定量,验证其灵敏度和稳定性.结果 人重组质粒FAM (ND4)可进行人来源样品的检测,其检测结果与各级稀释梯度基本吻合,微滴式数字PCR技术可以检测出反应体系中低至单拷贝的DNA.结论 微滴式数字PCR技术可以进行生物样品的种属鉴定和绝对定量,并具有很高的灵敏度和特异性,可应用于日常法医物证检验.
