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肝癌细胞线粒体的纯化及双向凝胶电泳分析
目的:建立纯化肝癌细胞线粒体的方法,通过双向电泳及酶活力测定确认纯化效果.方法:使用蔗糖密度梯离心法分离纯化线粒体,双向凝胶电泳分析纯化过程中样品蛋白质图谱的变化.结果:通过标志酶活力的监测,梯度离心后线粒体纯提高近12倍,线粒体蛋白质在双向凝胶电泳中得到很好的显现.结论:使用蔗糖密度梯度心法可有效地分离纯化线粒体,为线粒体蛋白质组后续研究奠定了基础.
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小鼠胚泡黏附时已黏附侧与未黏附侧子宫内膜蛋白质组差异的研究
目的:用蛋白质组相关技术分析小鼠胚泡黏附时已粘附侧与未黏附侧子宫内膜蛋白质组的差异,探讨小鼠胚泡在双侧子宫黏附不同步现象发生的可能机制.方法:用固相pH梯度双向凝胶电泳(2D-PAGE)分别分离妊娠五天(D5)小鼠胚泡已黏附侧与未黏附侧子宫内膜的蛋白质组.银染显色,PDQuest 2DE软件分析.结果:图像分析测得两种胶的匹配率达82.5%,在等电点pI4～7、分子量14.0～75.4kD范围内分离得胚泡黏附侧小鼠子宫内膜蛋白点大约760个,胚泡未黏附侧小鼠子宫内膜蛋白点大约720个,其中至少60个蛋白点在两种子宫内膜间有2倍以上的量变.结论:小鼠双侧子宫内膜蛋白质的差异表达,是造成两侧子宫内膜胚泡附着不同步的一个可能原因.
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操纵子comCDE调控肺炎链球菌转化的分子机制研究
目的:探讨操纵子comCDE对调控肺炎链球菌转化的分子机制.方法:将D39野生菌株与comE基因缺陷菌株(ΔcomE)分别用感受态刺激因子(Competence-stimulating peptide,CSP)诱导转化,记录不同时间点的转化率,并采用FQ-PCR技术检测其comE的mRNA表达水平,并通过双向电泳及图像分析比较CSP诱导后不同时间点的蛋白质表达谱差异及野生菌株与ΔcomE菌株的蛋白质表达谱差异.结果:D39菌株在CSP诱导后不同时间点都能发生转化,其中0 min时转化率高,其comE的mRNA表达量在CSP诱导10 rain后表达显著增加,20 rain时迅速回落(P＜0.05). ΔcomE菌株不能被CSP诱导发生转化.蛋白质组学研究显示,ΔcomE菌株有6个蛋白较D39菌株的表达量显著增加;CSP诱导10min时有6个蛋白表达显著增加,而在20 min时又迅速回落;二者有2个蛋白相同;有1个蛋白在加入CSP后表达显著降低.结论:基因comE的存在是CSP诱导转化必需的,CSP诱导转化可能有非comE依赖途径,而comE可能有除转化以外调控功能,且不依赖于CSP.
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人尿液蛋白质的超滤离心制备及其双向凝胶电泳分析
目的:优化尿液蛋白质制备方法以获得蛋白点数多且分辨率高的尿液双向凝胶电泳(two dimensional gel electrophoresis,2-DE)图谱,为尿液蛋白质组学研究提供技术支撑.方法:首先,使用6种不同方法制备尿液蛋白质后比较蛋白质得率,并分析这些方法的2-DE谱蛋白点数及3次重复匹配率,进行统计分析计算P值;后利用2种固相pH梯度(immobilized pH gradient,IPG)胶条和不同的聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)胶浓度进行2-DE分析,比较所得蛋白图谱的蛋白点数及分辨率.结果:与其他方法相比,超滤离心法制备尿液蛋白能获得更多的蛋白总量[(791±17) μg,P=0.000],得到的电泳图谱蛋白点数也更多[(724±29)个,P=0.000];利用pH 3～10 IPG胶条和12.5％ PAGE分离有利于尿液蛋白质的整体分析,特别是酸性和碱性蛋白质点信息,而pH 4～7 IPG胶条能使等电点为4～7蛋白质的2-DE谱分辨率更高(P＜0.05).结论:建立了与2-DE兼容的尿液蛋白质制备方法,获得了更为全面的尿液蛋白点信息,为临床生理和疾病的尿液蛋白质组学研究奠定了基础.
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双向电泳分析精索静脉曲张不育患者精浆蛋白质的表达差异
目的:初步观察精索静脉曲张不育患者与正常成人精浆中蛋白质的差异表达,为进一步探讨精索静脉曲张导致不育的分子机制奠定基础.方法:应用蛋白质组学的双向电泳技术,对精索静脉曲张患者与正常成人精浆蛋白质表达进行比较,观察其差异点.结果:得到分辨率和重复性均好的精索静脉曲张患者与止常成人精浆蛋白的双向凝胶电泳图谱,发现二者之间在表达上有明显差异,差异表达蛋门质点数共38个.结论:精索静脉曲张患者导致不育可能与精浆中某些蛋白质的表达和修饰改变有关,对这些差异蛋白质点的进一步分析有助于揭示精索静脉曲张导致男性不育的分子机制.
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早期肺鳞癌患者与正常人血清表达差异蛋白筛选
目的:应用蛋白质组学方法来比较早期肺鳞癌患者和健康人血清蛋白质的差异,筛选与肺鳞癌发生发展密切相关的蛋白质.方法:以6例1期肺鳞癌患者血清和健康正常人血清为研究对象,运用比较蛋白质组学方法,用双向凝胶电泳(2-Pi-mentional electrophoresis,2-DE)分离肺鳞癌患者血清和正常人血清的总蛋白质,银染显色后经图像分析识别差异表达的蛋白质,再应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达的蛋白质点.结果:肺鳞癌患者血清和健康正常人血清的平均蛋白质点数分别为939±40和962±27,匹配率达89.2%和87.1%;找到表达量差异3倍以上蛋白质点25个;对25个差异蛋白质点进行分析,得到了16张肽质量指纹图谱,终鉴定出8个差异蛋白质.其中,有3个蛋白质只在早期肺鳞癌患者血清中表达,1个蛋白质在早期肺鳞癌患者血清中表达显著上调.另4个蛋白质在早期肺鳞癌患者血清中表达显著下调或缺失.结论:通过对早期肺鳞癌患者和健康正常人血清的蛋白质表达谱进行比较,鉴定出8个与早期肺鳞癌可能相关的蛋白质,为进一步筛选肺鳞癌早期诊断、治疗和预后评估的分子生物学标志物奠定了基础.
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不同分化喉鳞状细胞癌蛋白质组差异表达的研究
目的 研究不同分化程度喉鳞状细胞癌黏膜组织蛋白质组的差异表达.方法 用固相pH梯度双向凝胶电泳分离不同分化程度喉癌黏膜组织总蛋白质,行考马斯亮蓝染色,Image Master 2D软件分析所获得的双向凝胶电泳图谱,找出差异表达的蛋白质点.结果 获得分辨率和重复性均较好的双向凝胶电泳图谱,发现13种蛋白质与喉癌分化密切相关.其中有7种蛋白质在高分化喉癌组织中表达上调,6种蛋白质表达明显下调.结论 利用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离不同分化喉鳞状细胞癌黏膜组织总蛋白质,建立了重复性较强的不同分化喉鳞状细胞癌黏膜组织蛋白质组表达图谱,且两者蛋白质的表达明显不同,可能与喉癌不同分化程度的发病机制有关.
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食管鳞癌转移淋巴结蛋白质双向凝胶电泳图谱差异分析
目的 分析食管鳞癌转移淋巴结与正常淋巴结组织蛋白质表达差异.方法 采用双向凝胶电泳(2-DE)技术和计算机辅助的图像分析方法,对食管鳞癌转移淋巴结与正常淋巴结组织蛋白质进行分离和比较分析.结果 获得了背景清晰、分辨率和重复性较好的双向凝胶电泳图谱,比较分析显示23个蛋白点的表达量存在明显差异,其中新增蛋白点4个,缺失1个,14个蛋白点表达发生明显上调,4个蛋白点表达发生明显下调.结论 食管鳞癌转移淋巴结与正常淋巴结蛋白质表达存在明显差异,可能与食管鳞癌淋巴结转移机制有关.
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便秘大鼠结肠黏膜上调蛋白质的分离及鉴定
目的 观察慢传输型便秘大鼠结肠黏膜上调蛋白质的变化特性,并对明确的蛋白质组进行功能分析.方法 利用复方苯乙哌啶建立大鼠慢传输型便秘模型,利用高分辨双向电泳(2-DE) 对STC大鼠结肠黏膜组织进行蛋白质分离, ImageMaster 2D Elite 图像分析软件进行分析,应用生物质谱、蛋白质库及文献分析等技术对差异蛋白质中的上调蛋白质组进行鉴定、功能和临床意义分析.结果 慢传输型便秘在其发生过程中有显著的蛋白质表达差异.主要差异表达的蛋白质有: 类肌钙蛋白Calponin(CaP)(A1),组蛋白H2B(A2),鼠醛酮还原酶蛋白类似物(RAKb蛋白类似物)(A3), A1、A2、A3在便秘大鼠的胶图中表达明显上调.结论 CaP与胃肠道的运动状态密切相关,它在胃肠道运动中具有调节作用,可能介导了复方苯乙哌啶的抑制胃肠动力作用,通过表达量的变化来实现对胃肠道运动的调节.
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亚健康肾阴虚证的血浆蛋白质组学初步研究
目的:初步观察亚健康肾阴虚证患者血浆蛋白质组的变化与表达差异,为进一步探讨亚健康的发生机制奠定基础.方法:采用双向凝胶电泳(2-DE)技术分离亚健康肾阴虚证患者与正常人血浆总蛋白,银染显色;PDQuest 软件对凝胶图象进行定性定量差异表达分析;从中选取差异表达蛋白质斑点,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDL-TOF-MS)分析,获取肽质量指纹图谱(PMF);通过Mseot-Wizard软件进行数据库搜索,鉴定蛋白质.结果:获得了重复性和分辨性较好的血浆双向凝胶电泳图谱;在亚健康肾阴虚证血浆较正常人血浆表达量升高的蛋白质斑点11个,表达量降低的蛋白质斑点6个;选取其中表达量升高相差10倍以上的3个蛋白质斑点进行PMF鉴定,得到1个匹配精确的蛋白质(热休克蛋白27).结论:亚健康肾阴虚证血浆与正常人血浆中存在差异表达蛋白质,利用蛋白质组学技术有望对亚健康的发生机制进行阐释,并将促进中医证候研究的拓展和深入.
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红芪多糖对S180细胞体内化疗增效作用的差异蛋白质研究
目的:研究红芪多糖对S180瘤细胞化疗协同增效作用的差异蛋白质.方法:以环磷酰胺和红芪多糖联合环磷酰胺治疗S180荷瘤小鼠14天后测定小鼠免疫器官指数及抑瘤率,利用双向电泳分离提取的瘤细胞总蛋白,考染显色后应用PDQuest8.0软件分析电泳图谱,找出差异表达的蛋白质.结果:与环磷酰胺(20 mg/kg)组相比,红芪多糖(200 mg/kg)联合环磷酰胺(20 mg/kg)可明显抑制小鼠S180瘤生长(P＜0.05),显著减轻环磷酰胺所致免疫器官指数的下降(P＜0.01)；建立了背景清晰、重复性好、分辨率高的S180瘤细胞双向电泳图谱,环磷酰胺组与红芪多糖联合环磷酰胺组蛋白质点数分别为:776±22和721±16；平均匹配率分别为:91.13％和89.37％.比较分析环磷酰胺组与红芪多糖联合环磷酰胺组双向电泳图谱,筛选出差异明显的蛋白质点28个,其中8个表达上调,19个表达下调,1个仅在环磷酰胺组表达.结论:红芪多糖联合环磷酰胺可减轻其对S180荷瘤小鼠的免疫抑制作用,增强环磷酰胺对S180瘤细胞的化疗效果,其作用可能与筛选出的28个差异蛋白质点有关,对这些差异蛋白质点的鉴定将为揭示红芪多糖的化疗协同增效作用提供实验依据.
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人肺癌单克隆抗体的制备及其抗原分子的鉴定
用人肺癌细胞株A549的细胞膜蛋白作为免疫原,采用杂交瘤技术成功制备了抗人肺癌细胞单克隆抗体McAb4E7,并利用双向电泳、免疫印迹杂交、肽指纹图谱和MALDI-TOF-MS串连质谱分析鉴定其相关抗原分子,发现其相关抗原在人肺癌细胞株A549及人肝癌细胞株HepG2中有表达,且在A549细胞中表达量较高.后得到一个在A549细胞中表达的与单克隆抗体McAb4E7特异性结合的蛋白,并鉴定出这个蛋白是ATP合成酶β亚基,从而证明了ATP合成酶β亚基就是肺癌单克隆抗体McAb4E7的靶抗原,其可作为肺癌具有潜在治疗意义的靶点.
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干细胞与蛋白质组学
蛋白质组学具有规模大和高通量的特点,其核心技术双相电泳、质谱分析和蛋白质组信息学的迅速发展,可完成极其复杂的蛋白质功能和细胞因子变化的研究.干细胞可定向分化为各种细胞和组织器官,其定向分化过程中有众多的蛋白质、细胞因子的参与和消失,应用蛋白质组学研究干细胞分化过程中极其复杂的蛋白质变化,对探索干细胞的分化机制和应用有重大意义.
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不同贮存时间红细胞悬液蛋白质组学分析
目的 比较不同贮存时间红细胞悬液蛋白质之阃的变化,阐明库存红细胞损伤的机制.方法 采用双向凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术检测d1、d12、d23和d 35血库贮存红细胞悬液中蛋白质水平的变化,寻找随着贮存时间延长发生变化的蛋白质点.结果 通过比较分析3名健康献血者在d 1 d、d 12、d 23和d 35贮存在4℃冰箱的红细胞悬液的蛋白质表达谱.发现在贮存的d 12与d 1相比增加了14个蛋白质点并达到高峰,其中有7种蛋白质,在以后的d 23和d 35则逐渐降低到一个稳定的水平.结论 通过血清蛋白质组学技术.成功鉴定了7种蛋白质与红细胞悬液贮存时间延长有关的差异蛋白质点,为减少红细胞损伤延长红细胞寿命提供重要的理论依据和途径.
关键词： 红细胞悬液 双向凝胶电泳 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 蛋白质组学 -
人参皂苷Rg3对肺癌细胞蛋白表达的影响研究
背景与目的 肺癌是对人类健康和生命危害大的恶性肿瘤.肺癌转移是肺癌的恶性标志和特征,也是肺癌病人治疗失败和死亡的主要原因.人参皂苷Rg3具有明显的抗肿瘤效应,该研究将应用双向凝胶电泳技术探讨人参皂苷Rg3抗肺癌侵袭转移分子作用机制.方法 筛选人参皂苷Rg3作用于人肺巨细胞癌高转移细胞株的半抑制浓度(IC50),用0.1倍半抑制浓度(0.1 × IC50)的Rg3溶液作用人肺巨细胞癌高转移细胞株95D 72 h,利用同相PH梯度双向凝胶电泳分离Rg3处理前后人肺巨细胞癌高转移细胞株95D的总蛋白,用图像分析软件比较分析Rg3处理前后细胞间的差异表达蛋白质.对15个差异表达的蛋13质点通过MALD-TOF-MS/MS,LC-MS/MS和蛋白质数据库检索进行鉴定.结果 人参皂苷Rg3作用人肺巨细胞癌高转移细胞株95D的半抑制浓度为100μg/mL.有12个蛋白点仅在对照组细胞株中出现,有6个蛋白点仅在药物处理组出现;在对照组与药物处理组中都存在,但在对照组中高表达的蛋白点有7个,在药物处理组中高表达的蛋白点有2个.通过对差异明显的15个蛋白质点进行质谱鉴定和蛋白质数据库查询.发现氯离子通道蛋白1(Chloride intracelular channel protein 1)、泛素结合酶E2-25 Kda(Ubiquitin-Conjugating Enzyme E2-25 Kda)等蛋白只在对照组有表达;14-3-30蛋白(14-3-3 protein theta)、ski作用蛋白(SKI-interacting protein)只在药物处理组有表达;膜联蛋白A2(annexin A2)、肌动蛋白结合蛋白Ⅱ同构体b(profilin 2 isoform b)等蛋白在对照组的表达量显著高于药物处理组;14-3-3ξ蛋白(14-3-3 protein zela),真核翻译起始因子4H(Eukaryotic translation initiation factor 4H)在药物处理组的表达量显著高于对照组.结论 该研究结果提示Rg3处理前后人肺巨细胞癌高转移细胞株蛋白质组的表达存在明显差异,鉴定的差异蛋白质多与肿瘤的侵袭转移相关.这些差异蛋白质有可能为进一步发现与肺癌转移相关的分子标志物和阐明人参皂苷Rg3抗肺癌侵袭转移的分子作用机制提供线索.
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人高、低转移大细胞肺癌细胞株双向凝胶电泳图像分析
背景与目的肺癌转移是肺癌的恶性标志和特征,也是肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因.为了更好地了解和阐明肺癌转移的分子机制,发现早期诊断和逆转肺癌转移的分子标志物,本研究应用双向凝胶电泳技术,比较人高转移大细胞肺癌细胞株(L9981)和人低转移大细胞肺癌细胞株(NL9980)间蛋白质组表达的差异.方法利用固相pH梯度双向凝胶电泳,分离L9981和NL9980细胞株的总蛋白,用图像分析软件比较分析并识别细胞间的差异表达蛋白质.结果应用比较蛋白质组学技术对L9981和NL9980细胞株的蛋白质表达进行双向电泳分离,成功地获得了蛋白组分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳图谱.在三次重复实验结果中,在L9981和NL9980细胞株中检测到的蛋白质点数分别为902±169和941±173,蛋白质斑点位置在IEF方向的平均偏差为(0.858±0.076)mm,在SDS-PAGE方向的平均偏差为(1.514±0.127)mm,蛋白质表达量的变异为12.06%～12.22%.经ImageMaster软件分析后发现有15个蛋白质点仅在L9981肺癌细胞株中检测到有表达,27个蛋白质点仅在NL9980中检测到有表达.发现4个蛋白质点在两种肺癌细胞株中均存在,但在两种细胞株间的表达量差异在2倍以上,其中3个蛋白质点在L9981中表达量显著高于NL9980,1个蛋白质点在NL9980中表达量显著高于L9981(P<0.05).结论本研究结果提示人高、低转移大细胞肺癌细胞株的蛋白质组表达存在明显差异,这些差异蛋白质有可能为进一步发现肺癌转移相关分子和阐明肺癌侵袭转移的分子机制提供实验证据.
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蛋白质组学技术及其在口腔医学中的应用
蛋白质组是后基因组时代出现的一个新兴研究领域.它的研究主要是先通过双向凝胶电泳和差异凝胶电泳等方法分离蛋白质,然后再用质谱技术和Edman测序法等方法进行鉴定.目前蛋白质组研究得到人们的关注,并且成为生物技术中的一个重要领域.本文就蛋白质组研究的主要技术及其在口腔医学领域中的应用作一综述.
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蛋白质组学在肿瘤研究中的进展
蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的一门新兴学科,是后基因计划的重要组成部分.近年来,国内外学者运用蛋白质组学及其技术,筛选和鉴定肿瘤特异性标记物,为肿瘤的诊断和治疗疗效评价提供了新的途径和技术支持.本文就蛋白质组学及其在肿瘤研究中的新进展作一综述.
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面神经再生微环境的蛋白质分布及针刺对其的影响
目的探讨面神经再生微环境的蛋白质分布及穴位针刺对该微环境的影响.方法建立兔面神经再生微环境动物模型,采用蛋白质双向凝胶电泳技术对面神经再生微环境中的蛋白质进行了检测和分析.结果神经再生液中的蛋白质主要分布于相对分子质量80×103以下,等电点4～7之间,对照组检测到800±53个蛋白质点,针刺组检测到850±78个蛋白质点,在匹配的点中,有十几种蛋白质发生了明显变化.结论尚不能证实针刺对面神经再生微环境有积极的影响作用.
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应用蛋白质组技术对维甲酸耐药相关蛋白的初步分析
目的探讨采用蛋白质组学技术研究维甲酸的耐药机制.方法提取维甲酸敏感细胞株NB4及维甲酸耐药细胞株MR2的总蛋白,进行双向凝胶电泳识别差异表达蛋白,经质谱分析、数据库搜索进行蛋白鉴定.结果单张凝胶电泳图上呈现约600多个蛋白点,组间的匹配性较好,初步筛选出三个表达差异蛋白,经鉴定分别为DJ-1蛋白、热休克蛋白70及KIAA1289未知功能蛋白.结论应用双向电泳连接质谱的蛋白质组学方法有助于筛选到耐药相关的表达蛋白,为进一步研究维甲酸耐药机制提供分子基础.
