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SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定
目的 探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的分离和鉴定方法及其意义.方法 以经体外培养及10 μmol/L褪黑素药物干预的内皮祖细胞差异表达蛋白质为研究对象,分别采用Tricine-SDS-PAGE和双向凝胶电泳方法进行差异蛋白分离及结果比较,以FT-MS二级质谱鉴定.结果 经Tricine-SDS-PAGE分离后,选取分子量为53 ku左右的趋势性差异表达蛋白进行FT-MS分析,质谱鉴定为微管蛋白-α3(吻合度评分为87).经双向凝胶电泳分离后,于凝胶近酸性端、分子质量在72 ～95 ku之间区域,选取蛋白表达量较高的一点,质谱鉴定其为人热休克蛋白90-α(吻合度评分为91).结论 Tricine-SDS-PAGE对于大致35～62 ku范围的蛋白分离较清晰、重复性好且样品用量少,2-DE对低上样量有较严格要求,但它能提供分子质量、等电点双重参数来更准确定位所感兴趣蛋白点,且对大分子质量蛋白的分离效果更佳,经质谱鉴定结果理想.
关键词： SELDI Tricine-SDS-PAGE 双向凝胶电泳 质谱 -
人胃黏膜组织蛋白质组二维电泳图像的获得
目的初步建立并优化人类胃黏膜组织蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术,提高其分辨率及重复性.方法刮取手术胃黏膜组织,对以固相pH梯度为第一向的双向凝胶电泳的关键因素与环节, 如样品处理、上样量、电泳参数、凝胶浓度和SDS凝胶电泳染色方法等进行一系列的优化.以固相pH梯度--IPG胶条(pH=3～10)进行第一向等电聚焦,以SDS均一胶(13%)的垂直电泳为第二向.结果成功地得到了胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱.
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大鼠脑内突触后致密物蛋白质的提取及鉴定
目的 提取纯度高、易分离溶解的突触后致密物(PSD)蛋白质.方法 应用蔗糖密度梯度离心法,逐次获取P2,突触小体和PSD-1;应用Western blot检测PSD-1蛋白质的纯度;对PSD一1运用膜顺序提取法获取可溶性蛋白PSD-2;应用双向凝胶电泳技术分离PSD-1与PSD-2蛋白质点,PDQuest软件分析比较其数目差异.结果 突触后标志分子PSD-95在P2成分、突触体和PSD-1 3组成分中均呈免疫染色阳性,而突触前标志分子突触素在PSD-1成分中呈免疫阴性.从PSD-1蛋白中电泳分离到286±25个蛋白质点而显著低于从PSD-2中分离到720±17个蛋白质点(P<0.01).结论 蔗糖密度梯度离心联合膜顺序提取法可获得纯度高、易分离溶解的PSD蛋白质.
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脑脊液蛋白质组学高丰度蛋白去除方法的建立与评价
目的 建立和评价脑脊液蛋白质组学中高丰度蛋白的去除方法.方法 使用Oasis HLB(hydrophilic-lipophilic balance)过滤柱,运用反相固相法,根据蛋白质不同的疏水性分馏脑脊液,去除高丰度蛋白和盐.将含有低丰度蛋白的过滤液冻干,利用双向凝胶电泳(2-DE)分析评价脑脊液蛋白层析去除高丰度蛋白的效果.结果 通过Oasis HLB柱处理可将大部分高丰度蛋白去除.2-DE图谱中低丰度蛋白质分辨率明显增加,点数增多59.86%.结论 本研究建立的脑脊液高丰度蛋白去除方法可有效地应用于疾病的脑脊液蛋白质组学研究.
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血吸虫成虫排泄分泌抗原的组成及免疫反应性分析
目的 分析日本血吸虫成虫排泄分泌抗原的组成及其与血吸虫感染兔疗前、疗后配对血清的免疫反应特征.方法采用7 cm(pH5～8)的IPG和12% SDS-PAGE对血吸虫成虫排泄分泌抗原的组成进行双向凝胶电泳分析,并用免疫印迹试验检测排泄分泌抗原各蛋白点与疗前、疗后血清的反应性;采用PDQuest8.0图像分析软件对二维图像斑点进行分析,寻找差异反应蛋白点. 结果 血吸虫成虫排泄分泌抗原双向凝胶电泳图谱主要由215个蛋白斑点组成,其中16个斑点大、染色深,可能为高丰度的循环抗原;免疫印迹显示可被感染6周兔血清识别,但不能被治疗12周兔血清识别的蛋白斑点有84个,与感染6周兔血清的反应强度比与治疗12周兔血清的反应强度高2倍的蛋白点有38个. 结论 血吸虫成虫排泄分泌抗原中存在高丰度的能被短程抗体识别的抗原分子.
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应用MALDI-TOF-MS法筛选儿童急性淋巴细胞白血病潜在标记物
本研究旨在分析儿童急性淋巴细胞白血病(c-ALL)的肿瘤特异性蛋白,寻找新的肿瘤蛋白分子标志物.应用双向凝胶电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)及联网检索数据库,鉴定表达上调的差异蛋白,并应用细胞免疫组织化学法验证相关蛋白.结果表明,获得了4个表达上调的蛋白点,经质谱分析初步鉴定出其中2个表达上调的差异蛋白为谷胱甘肽S转移酶P和阻殖蛋白；细胞免疫组织化学法检测发现,二者在儿童ALL细胞内的表达阳性率明显高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:谷胱甘肽S转移酶P和阻殖蛋白有望成为儿童ALL新的诊断标志物和药物靶点.
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Tel/aml1阳性儿童急性淋巴细胞白血病细胞双向凝胶电泳分析
本研究采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术建立不同预后tel/aml1阳性儿童ALL白血病细胞的蛋白质表达谱,探讨此临床亚型儿童ALL的发生发展机制.根据初诊时白细胞数、早期治疗反应及临床预后将tel/aml1(+)儿童ALL分为3组:早期复发组、高白细胞组和标危组.取初诊患者骨髓提取蛋白,通过双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行细胞蛋白质凝胶电泳,对组间差异蛋白进行图像分析.结果显示:不同组间将tel/aml1(+)儿童蛋白表达谱存在显著差异(大于2倍或小于0.5倍),具有统计学意义(P<0.05).早期复发病例与标危病例及初诊时高白细胞(>100×109/L)病例相比,有71个蛋白点表达消失,93个新蛋白点出现,37个蛋白点表达上调,23个蛋白点表达下调;标危病例与初诊时高白细胞病例比较,有6个蛋白点表达消失,56个新蛋白点出现,7个蛋白点表达上调,19个蛋白点表达下调.结论:早期复发组病例蛋白表达谱与其他组别存在显著性差异,部分蛋白在儿童ALL的发生发展过程中具有重要作用,可能成为个体化治疗的新的分子指标和药物靶点.
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几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较
本研究对蛋白质染色法进行比较和分析,以求获得满足蛋白质组研究所需的适宜的蛋白质检测法.实验采用2-D电泳分离急性早幼粒白血病细胞株NB4的全蛋白及1-D电泳分离蛋白质分子量标准物,从蛋白质检测的灵敏性、质谱兼容性、操作的简便性等角度,比较了传统考马斯亮蓝染色法、胶体考马斯亮蓝染色法、改良考马斯亮蓝染色法和银染法4种蛋白质着色法对凝胶分离蛋白质的检测影响,探讨了影响蛋白质染色与鉴定的影响因素.结果显示,银染检测灵敏度高,但质谱鉴定相容性差,鉴定率近10%;改良考马斯亮蓝染色法检测灵敏度也高,可达4 ng/spot,质谱鉴定率可接近55%.结论:改良考马斯亮蓝染色法的蛋白质检测灵敏度高,与质谱兼容好,能满足蛋白质组研究需要.
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蛋白质组学技术在肝癌研究中的应用进展
基因的功能终是由蛋白质决定的.蛋白质组学作为一门新兴学科,已经广泛地应用于医学的各个领域.本文着重介绍了蛋白质组学的主要技术以及这些技术在寻找肝癌早期标记物和肝癌特异性抗原方面的研究进展,以为临床提供指导.
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腋淋巴结阳性乳腺浸润性导管癌差异蛋白的质谱分析
目的 筛选可能用于判断乳腺浸润性导管癌发生腋淋巴结转移的血清蛋白标志物.方法 收集2015年3月—2016年5月天津市宝坻区人民医院收治的乳腺浸润性导管癌患者血清样本24份,按照是否发生腋淋巴结转移分为两组,每组各12份.将每组的12份血清等量混合,利用双向凝胶电泳(2D-PAGE)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术鉴定差异蛋白质,对2D-PAGE图谱与MALDI-TOF-MS质谱进行分析.结果 2D-PAGE图谱分析筛选出差异蛋白点11个;经MALDI-TOF-MS质谱分析鉴定出高可信度的蛋白5种,表达上调的为T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)、组织蛋白酶K(CatK)、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、肌动蛋白相关蛋白复合物3(ARPC3),表达下调的为抑癌蛋白Necdin(覆盖率分别为Tiam1蛋白29％,CatK蛋白12％,VEGF-B蛋白34％,ARPC3蛋白26％,Necdin蛋白18％).结论 乳腺浸润性导管癌发生腋淋巴结转移后其蛋白质表达谱也发生了变化,所鉴定出的差异蛋白有可能成为判断其是否发生腋淋巴结转移的血清蛋白标志物.
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血浆置换对慢性重型乙型肝炎患者血浆蛋白质组影响的初步研究
目的 探讨慢性重型乙型肝炎血浆置换(PE)治疗前后的血浆蛋白质组变化,为研究PE治疗重型肝炎的作用机制及寻找治疗靶标提供新的线索. 方法 收集慢性重型乙型肝炎患者PE前后血浆各15份,去除血浆中高丰度蛋白质.应用双向凝胶电泳(2-DE)技术构建两组研究对象血浆蛋白2-DE图谱,经Image Master差异分析软件进行分析,寻找差异蛋白质点.用电喷霉离子串联质谱(ESI-MS/MS)对重要的差异蛋白质点进行鉴定.结果 经过样品预处理后,血浆中白蛋白和免疫球蛋白IgG等高丰度蛋白质含量明显减少,低丰度蛋白得到较好的富集.PE前组蛋白质点297个,PE后组蛋白质点305个,筛选出3倍以上的差异蛋白质点15个,鉴定了5个差异蛋白质,其中在PE后血浆中上调的蛋白质有补体因子B(Complement factor B precursor,CFB,点1)、CD5 antigen-like蛋白(CD5 antigen-1ike precursor,点2)、纤维蛋白原B链(Fibrinogen beta chain precursor,FGB,点3)、触珠蛋白(Haptoglobin precursor,点4),下调的蛋白质有载脂蛋白E(Apo-E,点5).结论 鉴定了5个PE治疗前后差异表达的蛋白质,这些蛋白表达的改变提示PE可以干预机体脂蛋白代谢、蛋白质分解合成代谢,并能调节机体免疫功能,补体旁路活化途径等.深入研究这些蛋白质结构和功能对于进一步揭示PE的治疗作用机制具有重要的临床意义.
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血清蛋白预处理方案对双向电泳效果的影响
目的 比较不同的血清蛋白预处理方案对双向凝胶电泳(2-DE)分辨率与重复性的影响.方法 收集健康志愿者血清样本3例,分别以原始血清及经Aurum Serum Protein Mini Kit(ASPMK)、ProteoMiner Protein Enrichment Kit(PMPEK)、Multiple Affinity Removal System(MARS)处理后的血清样本进行2-DE,所得2-DE图谱经PDQuest软件分析,比较上述4种方法所获得的凝胶图谱的整体蛋白质点数及其变异系数(CV)、组内凝胶匹配点数.同时,通过划分白蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原、IgA与α1-抗胰蛋白酶富集区域(Ⅰ区)及IgG分布区域(Ⅱ区),细化比较其中蛋白点数.结果 3名健康志愿者的原始血清及经ASPMK、PMPEK、MARS处理的血清样本2-DE图谱中蛋白质点数分别为589±83、611±45、798±26及810±20个,CV分别为41.1%、28.6%、23.5%及22.9%,组内匹配蛋白质点数分别为424±50、523±34、713±18及734±19个.在Ⅰ区和Ⅱ区,经PMPEK及MARS处理的血清样本蛋白质点数均较经ASPMK处理的样本获原始血清多.结论 预处理可提高血清样本2-DE分辨率及重复性;以PMPEK及MARS处理血清效果优于ASPMK.
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腹水前期处理满足双向凝胶电泳技术的探索
目的 用双向凝胶电泳方法分析不同腹水中的蛋白质谱.方法 用防止腹水蛋白质降解、去细胞成分、浓缩、去脂、脱盐及去干扰大的白蛋白等腹水的前期处理以满足双向凝胶电泳的条件.结果 经2次离心可基本去除腹水细胞成分;用分子量5 000的膜包超滤浓缩腹水,可消减腹水蛋白质的浓度差异;去白蛋白前,0.3mg上样量双向电泳图中可检出(421±20)个蛋白质点,去白蛋白后可检出(483±24)个蛋白质点.经上述腹水前期处理后得到较为清晰的双向凝胶电泳图谱.结论 腹水前期处理能满足双向凝胶电泳技术的要求,已建立的腹水蛋白双向凝胶电泳技术将为进一步的腹水蛋白质成分研究奠定基础.
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双向电泳和质谱技术在类风湿关节炎滑膜细胞差异蛋白分析中的应用及意义
目的 采用2-DE和质谱技术分析RA患者和创伤件关节炎患者关节滑膜组织中FLS蛋白质组学的变化,寻找RA关节滑膜特异性自身抗原.方法 采用2-DE分离6例创伤性关节炎患者及3例RA患者关节滑膜组织中FLS总蛋白质,凝胶经银染显色和图像数据分析识别差异蛋白质点,并用MALDI-TOF-MS对筛选出的差异蛋白质点进行鉴定.结果 RA患者与创伤性关节炎患者中的FLS蛋白质通过2-DE检测,分别检出1 633、1 603个蛋白质点;对2组相互匹配的蛋白质点进行差异分析后,其中蛋白质差异量大于3倍的差异点共有92个,从中选取在RA患者FLS中表达上调的33个差异蛋白质点进行MALDI-TOF-MS 鉴定分析,并与IPI和Swiss-Prot数据库进行比对,共鉴定出包括肿瘤型丙酮酸激酶、α-烯醇化酶、二硫键异构酶A3 前体、谷胱甘肽转移酶、泛素结合酶E2K、血小板活化因子乙酰水解酶、二氢嘧啶酶样2、腺苷酸酶、转醛醇酶、乙酰基辅酶A异构酶、26S蛋白调节亚单位S6a、膜联蛋白A11、过氧化物还原酶1、人色氨酰tRNA合成酶、核纤层蛋白、肌间蛋白、核基质蛋白、肌动蛋白、T-复合物多肽1、葡萄糖调节蛋白75、αB-晶体蛋白、葡萄糖调节蛋白78、未知蛋白:如PSMFA和SELENBP1等30个与RA发病有关的蛋白.结论 RA患者与创伤性关节炎患者FLS间存在差异表达的蛋白质,这些差异蛋白有可能是构成RA关节滑膜的相关自身抗原,并可能在诱导RA自身免疫反应中发挥一定作用.
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不同银染法和上样模式对双向凝胶电泳影响的初步分析
双向凝胶电泳(2-DE)技术是蛋白质组学研究的重要支撑技术之一.该技术利用蛋白质2项独立物化参数--等电点(pI)和分子量的差异,将高分辨率的等电聚焦电泳(IEF)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)程序相组合.2-DE常用的标本上样方式有溶涨上样和杯上样.前者溶涨与等电聚焦同时进行,后者溶涨与等电聚焦依次进行.常用的下游蛋白质显示技术包括同位素标记法、荧光标记法、染料标记法、金属和重金属离子标记法.银染法属金属离子还原染色,分双胺银染法和非双胺化学显色银染法.本研究通过比较两种上样方式和两种银染法对人肝癌细胞系MHCC97H、97L的2-DE图谱的影响,以期建立较理想的实验室内2-DE相关技术的方法.
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奥美沙坦酯对自发性高血压大鼠血清蛋白质表达谱的影响
目的 探讨奥美沙坦酯对自发性高血压大鼠(SHR)降压作用的蛋白质组学机制.方法 选取雌雄各半12周龄的SHR,随机分为对照组(n=10)、奥美沙坦酯组(n=10).对照组给予0.9%生理盐水灌胃,奥美沙坦酯组给予奥美沙坦酯配制的混悬液灌胃,两组均连续灌胃四周后,分离血清.每组随机各取5份血清样品.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定肽质量指纹图谱(PMF),采用数据库检索鉴定各肽段对应的蛋白质,获取差异表达蛋白质的信息.结果 对照组、奥美沙坦酯组凝胶上的平均蛋白点数分别为(476±30)、(508±55)个,两组经统计分析有20个显著差异点,奥美沙坦酯干预后表达增强13个,降低5个,蛋白点消失2个.对这20个差异蛋白点进行质谱分析.鉴定出的8个蛋白质分别为线粒体膜蛋白、锌指蛋白、T细胞受体、视黄醇结合蛋白、转甲状腺蛋白A链、Rho GTPase、假想蛋白(2个).结论 奥美沙坦酯对高血压的作用机制可能与线粒体膜蛋白、锌指蛋白、T细胞受体、转甲状腺蛋白A链高表达,视黄醇结合蛋白、Rho GTPase低表达有关.
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乙型肝炎肝纤维化组织双向电泳技术的优化
目的:建立并优化乙型肝炎肝纤维化组织蛋白质组研究所需的双向凝胶电泳技术,提高其分辨率和重复性.方法:外科手术获取乙型肝炎肝纤维化组织,提取肝组织总蛋白.利用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离总蛋白,考马斯亮蓝染色后分析凝胶图像.对2-DE中的关键因素与环节,如样本处理、上样量、电泳参数等各步条件进行了一系列优化.结果:优化条件后的乙型肝炎肝纤维化组织双向凝胶电泳图谱水平拖尾减少、斑点分辨率改善、斑点检出数量增加(246±33→729±83).结论:该双向凝胶电泳技术可应用于乙型肝炎肝纤维化组织的蛋白质组学研究.
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人胃癌细胞环氧合酶-2表达的蛋白质组双向凝胶电泳分析
目的:建立和优化胃癌蛋白质组研究的方法系统,并分析人胃癌细胞SGC7901-asCOX2及SGC7901-pcDNA(用COX-2反义重组质粒及空载体分别转染胃癌细胞系SGC7901得到的两个细胞系)表达的蛋白质组,并建立二者之间的差异表达谱.方法:用固相pH梯度双向凝胶电泳分离SGC7901-asCOX2及SGC7901-pcDNA细胞总蛋白,银染显色,Melanie3 2-D软件分析两种细胞蛋白质组的表达差异.结果:获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳银染图谱.图像分析发现6个蛋白点只在SGC7901-pcDNA细胞中检测到表达,4个点只在SGC7901-asCOX2细胞中检测到表达.与SGC7901-pcDNA细胞相比,在SGC7901-asCOX2细胞中有10个蛋白质点表达下调,6个蛋白点表达上调.结论:人胃癌细胞SGC7901-asCOX2及SGC7901-pcDNA表达的蛋白质组有明显差异.
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应用蛋白质组学技术筛选胰腺癌生物标志物的研究进展
胰腺癌是一种十分凶险的恶性肿瘤.胰腺癌早期症状不明显,临床确诊的患者多已处于中晚期,大多失去手术治疗机会.蛋白质组技术的快速发展为研究胰腺癌发病机制、发现早期诊断和预后的生物标志物提供了可能.本文就蛋白质组学技术在胰腺癌细胞系、组织、血清和胰液等方面的应用作一综述.
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肿瘤标志物的蛋白质组学
随着蛋白质组学概念的提出及其技术的不断发展,人们可以从细胞蛋白整体水平研究肿瘤的发病机制,寻找肿瘤诊断和预后的特异性标志.蛋白质组学表达模式研究的技术包括用于蛋白质分离的双向凝胶电泳,用于鉴定的质谱分析及用于蛋白质对比研究的数据库,这些技术正应用于肿瘤标志物的寻找和鉴定.人们已在肾细胞癌中找到相关的诊断标志,并建立了膀胱癌相关蛋白数据库;在肝癌研究中也发现了大量可能用于早期诊断和肿瘤分型的蛋白;在肺癌早期可检测"恶性"蛋白信号,预测肿瘤发生和观察化疗效果;在卵巢肿瘤中联合应用筛选的肿瘤标志和CA125可明显提高肿瘤的检出率;另外蛋白质组学方法在乳腺癌、结肠癌、白血病等疾病研究中的应用也日益广泛.尽管这项技术仍有不足,但他在不断完善,使我们能发现更多敏感、特异的肿瘤标志物.
