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不育患者精浆α-1,4糖苷酶活性与精液参数的关系
目的探讨精浆α-1,4糖苷酶活性与精液参数之间的关系. 方法分光光度比色法测定精浆α-1,4糖苷酶活性及进行精液常规分析. 结果 2 902例男性不育者精浆α-1,4糖苷酶活性异常率为38.87%.该酶活性与精子密度、精子活率、a, b级精子活力和顶体酶活性呈显著正相关(r分别为0.460、0.122、0.086和0.230,P均<0.001),而与精液量、精液pH、液化时间和畸形精子率无显著相关(P>0.05 ).α-1,4糖苷酶活性正常组精子密度、活率、a,b级精子活力和精子顶体酶活性均明显高于α-1,4糖苷酶活性异常组(P<0.001). 以常规精液分析法(RSA)主要参数正常与否分成的两组间α-1,4糖苷酶活性差异有显著性(P<0.001). 结论α-1,4糖苷酶活性对精子密度、活率、a,b级精子活力和顶体酶活性均有明显影响,对精液量、精液pH、液化时间和畸形精子率无显著影响.
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探讨活血化瘀方剂对肺间质纤维化TGF-β/Smad2/3信号转导通路糖基化修饰的影响
目的:明确活血化瘀方剂是否影响TGF-β/Smad2/3信号通路中TGF-β受体糖基化修饰,用现代医学手段阐明活血化瘀方剂治疗肺间质纤维化的机制.方法:胚胎成纤维细胞WI-38细胞随机分为3组,①正常组为单独的DMEM培养;②TGF组加入浓度为10ng/mL的TGF-β 1孵育48h;③TGFH组先用10％含活血化瘀方剂血清孵育24h,然后加入10ng/mL TGF-β 1继续孵育48h.应用荧光定量PCR、免疫荧光、免疫印记技术检测各组WI-38细胞的FUT8、细胞的岩藻糖基化水平,TGF-β受体ALK5及TGF-β RⅡ的表达,应用ELISIA技术检测细胞培养液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原纤维(COLⅠ、Ⅲ、Ⅳ)和纤维连接蛋白(FN)的变化.结果:活血化瘀方剂能明显地抑制WI-38细胞的FUT8的表达和细胞的岩藻糖基化水平,活血化瘀方剂对TGF-β受体ALK5及TGF-β RⅡ的表达无明显影响,但可以减少TGF-β 1对WI-38细胞p-Smad2/3的影响,使其表达降低.COL Ⅰ在TGF组中表达约为正常组的1.5倍,COLⅢ在TGF组中表达约为正常组的2.5倍,COLⅣ在TGF组中表达约为正常组的1倍,FN在TGF组中表达约为正常组的2.5倍,TGFH组COLⅠ、Ⅲ、Ⅳ及FN表达略高于正常组,与TGF组间具有统计学差异.结论:活血化瘀方剂可以抑制TGF-β诱导后肺成纤维细胞ALK5/TGF-βRⅡ-Smad2/3信号通路的糖基化修饰,减少Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原纤维和FN的表达.
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小鼠胚泡植入早期FucT-Ⅶ和sLe(X)寡糖抗原表达
目的 探讨妊娠第1～5天(d1～5)小鼠子宫内膜唾液酸化的路易斯寡糖[sLe(X)]合成关键酶α-1,3岩藻糖基转移酶基因(FucT-Ⅶ)的表达和其表面sLe(X)寡糖抗原表达对胚胎植入的影响.方法 应用RT-PCR和免疫组化方法检测妊娠第l～5天小鼠子宫内膜FucT-Ⅶ及寡糖抗原的表达规律.用子宫角内注射sLe(X)单克隆抗体的方法检测小鼠胚胎着床数.结果 妊娠第1～5天小鼠子宫组织均有FucT-Ⅶ的表达,且在妊娠d4表达更强(P＜0.05).妊娠第1～5天sLe(X)寡糖抗原表达在子宫内膜的腔上皮和腺上皮.单侧子宫角sLe(X)抗体注射后胚胎的着床数量明显较对侧(注射等体积生理盐水)减少.结论 在小鼠胚胎着床过程中,FucT-Ⅶ及sLe(X)寡糖抗原可能参与了胚泡的定位、黏附及侵袭过程,在胚泡植入的早期发挥作用.
关键词： α-1 3岩藻糖基转移酶基因(FucT-Ⅶ) sLe(X)寡糖 着床 子宫内膜 -
人类α-1,2-岩藻糖苷转移酶在猪血管内皮细胞的表达及作用
目的:探讨人类α-1,2-岩藻糖苷转移酶(HT)基因在猪血管内皮细胞(PIECs)的表达及意义.方法:将人HT基因重组质粒通过脂质体转染进猪血管内皮细胞,经G418筛选(500mg/L),用流式细胞仪检测HT的表达,表达阳性细胞与人血清共同孵育检测细胞的生存率.结果:流式细胞仪检测结果显示,未经转染HT基因的PIECS的H抗原表达率是13.80%,平均荧光强度很低是32.39,α-Gal表达率是99.98%,平均荧光强度是1347.09;转HT基因的PIECS其H抗原表达率是40.17%,平均荧光强度是143.66,α-Gal表达率是41.15%,平均荧光强度是158.72.转HT基因的细胞在人血清的作用下生存率明显高于未转染的细胞.结论:转染HT基因的PIECs明显提高了H抗原的表达,同时降低了α-Gal的表达,为转基因动物实验探讨克服异种移植超急性排斥反应(HAR)提供理论依据.
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鼠源性α-1,3-半乳糖基转移酶催化结构域的表达及纯化
目的:表达和纯化鼠源性的α-1,3-半乳糖基转移酶的催化结构域(α1,3 GTcd)以及为在肿瘤细胞表面生成α-gal表位提供了可行性手段.方法:利用pET-15b载体以可溶性形式表达鼠源性α1,3 GTcd.利用高效液相色谱阴离子交换柱检测酶的活性.结果:①成功地构建了带有His-tag的α1,3GTcd重组质粒.②可溶性高效表达与纯化了带有His-tag的α1,3GTcd.③利用HPLC阴离子交换柱检测α1,3GTcd的活性.结论:可溶性地表达了α1,3 GTcd.
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在人消化道肿瘤细胞表面构建α-gal表位的研究
目的 在大肠杆菌中以可溶性形式表达鼠源性α-1,3-半乳糖基转移酶的催化结构域(α1,3 GTcd;catalytic do-main of α1,3GT),利用其在人消化道肿瘤细胞表面构建α-gal表位(Galαl-3Gal-β1-4GlcNAc-R),拟用来制备一种新的自体肿瘤疫苗.方法 利用pET-15 b载体以可溶性形式表达鼠源性α1,3 GTcd,利用高效液相色谱阴离子交换柱检测酶的活性.通过其在人不同消化道肿瘤细胞表面构建α-gal表位,先与人血清孵育,FITC标记的羊抗人的IgG为第二抗体,用流式细胞仪检测荧光强度,以分析α-gal表位的表达结果.结果 可溶性高效表达与纯化了带有His-tag的α1,3GTcd并利用HPLC阴离子交换柱检测α1,3 GTcd的活性.流式细胞仪检测结果证明了在人消化道肿瘤细胞表面成功构建了α-gal表位.结论 本研究可溶性的表达了α1,3 GTcd,并利用其在人消化道肿瘤细胞表面成功地构建了α-gal表位.为该方法的临床治疗的应用打下坚实的基础.
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α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶p.M1421突变导致Ax亚型的分子机制研究
目的:以一个血型Ax亚型家系为研究对象,探讨我国人群血型中产生Ax亚型的潜在分子机制.方法:采用血清学方法鉴定该家系成员的ABO血型,测定血浆α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶活性,行DNA直接测序和克隆后测序分析ABO基因序列,并构建3D分子模型,就发现的突变对α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶稳定性改变(△△G)的影响进行预测.结果:血清学鉴定和DNA测序分析显示,先证者的血型为AxB亚型,其2个女儿分别为A型和AB型,其ABO基因型分别为AW.38/B.01、A1.02B.01、A1.02/AW.38.先证者和其A型女儿的第7外显子均存在c.426G＞C杂合突变,导致α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶的氨基酸发生p.M142I改变.分子模建分析提示,该基因突变改变了蛋白局部氨基酸间氢键的数目,从而导致氨基酸间作用力发生改变,而动力学改变,△AG值升高表明其蛋白稳定性降低.结论:α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶p.M 142I突变可能通过降低了酶的稳定性导致Ax表现型,而其深入机制有待体外实验进一步研究.
关键词： ABO血型 α-1 3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶 基因突变 蛋白稳定性 -
hTERT启动子调控的异种抗原基因α-1,3GT表达载体的构建及其在肺癌细胞中的靶向表达
目的:构建人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子调控的异种移植抗原α-1,3半乳糖基转移酶(α-1,3 galactosyltransferase, α-1,3GT)基因真核表达载体,研究其调控的α-1,3GT在肿瘤细胞中的靶向表达.方法:将前期克隆并测序正确的猪α-1,3GT基因定向克隆到pEGFP-hTERTp质粒中, 构建α-1,3GT真核表达载体pEGFP-hTERTp-GT.分别将pEGFP-hTERTp-GT和CMV启动子调控的α-1,3GT真核表达质粒pEGFP-N1-GT转染端粒酶阳性的人肺癌细胞A549及端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞MRC-5.RT-PCR检测转染细胞中α-1,3GT mRNA的表达,免疫荧光法和流式细胞仪检测α-gal抗原的表达.结果:成功构建了pEGFP-hTERTp-GT真核表达载体.转染pEGFP-N1-GT的A549和MRC-5中均有α-1,3GT mRNA的表达;转染pEGFP-hTERTp-GT的A549中有α-1,3GT mRNA的表达,而端粒酶阴性的MRC-5细胞中无α-1,3GT mRNA的表达.转染pEGFP-N1-GT的A549和MRC-5中均可表达异种移植抗原α-gal;转染pEGFP-hTERTp-GT质粒的A549中有α-gal的表达,而MRC-5细胞中无α-gal的表达(P<0.01).结论:hTERT启动子调控的α-1,3GT基因能靶向性表达在端粒酶阳性的肺癌细胞中,并合成异种移植抗原α-gal.
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α-1,3-半乳糖苷转移酶基因沉默小鼠的建立初探
目的 获得转α-1,3-半乳糖苷转移酶沉默基因的小鼠.方法 将α-1,3-半乳糖苷转移酶沉默基因用显微注射的方法导入小鼠受精卵.结果 移植注射胚853枚,其中移植312枚1-细胞胚于11只受体鼠,6只受孕(54.5%)均中途流产(解剖发现子宫角明显增粗,充血,残骸);移植注射胚541枚2-细胞胚于23只受体鼠,18只受孕(78_3%),11只受孕均中途流产了,3只足日剖宫产获14只死胎,平均体重2.14g,未检测到阳性;4只12日龄左右剖宫荻21只残骸有7只阳性.结论 通过显微注射的方法,α-1,3-半乳糖苷转移酶沉默基因可以整合,但要得到整合成活个体还有待进一步研究.
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广西巴马小型猪α-1,3半乳糖转移酶基因真核表达载体的构建及鉴定
目的 通过RT-PCR扩增巴马小型猪GGTA1基因,分析其序列的结构特点并构建真核表达载体,为生产GGTA1基因沉默的广西巴马小型猪奠定基础.方法 根据NCBI上发布的猪α-1,3半乳糖转移酶基因cDNA序列(AF221508),设计合成一对含有 HindⅢ和BamHI酶切位点的特异性引物,以广西巴马小型猪肝脏组织总 RNA为模板进行RT-PCR,所得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序;将目的基因与pEGFP-N 1进行双酶切后连接构建真核表达载体pEGFP-GGTA1,通过测序,双酶切鉴定.结果 所克隆的广西巴马小型猪GGTA1基因存在缺失第五外显子(81-116) 的GGTA1序列,序列全长1 080 bp和未缺失第五外显子的GGTA1序列,全序列为1 116 bp.构建两个表达载体(缺失第五外显子 pEGFP-GGTA1-1、未缺失第五外显子pEGFP-GGTA1-2).结论 广西巴马小型猪GGTA1基因存在第五外显子缺失的现象,通过对GGTA1基因克隆序列进行分析以及构建两个真核表达载体,为后面在猪源PK-15细胞中对其进行表达鉴定以及巴马小型猪 α-1,3半乳糖转移酶基因的沉默实验奠定基础.
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雌孕激素对SMMC-7721人肝癌细胞α-1,6岩藻糖基转移酶的调控
目的探讨雌孕激素在肝癌细胞中对于α-1,6岩藻糖基转移酶表达的调控.方法通过对SMMC-7721细胞分别按不同时间点和不同浓度给予雌二醇和孕酮处理,观察细胞生长状态和形态学的改变,并进行半定量逆转录-聚合酶链式反应和小扁豆凝集素(LCA)印迹分析以检测α-1,6岩藻糖基转移酶基因(FUT8)转录水平和底物蛋白核心岩藻糖基化水平的改变.结果雌激素能明显上调FUT8基因的转录,并显著提高Mr为135×103、100×103和60×103 LCA反应阳性的糖蛋白的表达水平,同时改善了细胞的生长状态;而孕激素则可以明显下调FUT8基因的转录,并显著降低Mr为135×103、115×103、100×103和60×103 的LCA反应阳性的糖蛋白的表达水平,同时改变了细胞的正常形态.结论雌孕激素能通过调节α-1,6岩藻糖基转移酶的表达,改变靶蛋白的核心岩藻糖基化修饰,从而参与肿瘤的发生发展过程.
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2例类孟买血型的鉴定及基因突变分析
目的 探讨类孟买表型形成的分子机制和输血策略.方法 采用常规血型血清学方法对ABO正反定型不一致的患者进行ABO、H血型检测,采用PCR扩增技术检测α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-fucosyl transfer,FUT1)基因并测序.结果 2例均为类孟买血型Bbm.例1 FUT1基因测序显示为第547～552delAG碱基缺失,即CAGAGAG突变为CAGAG;其2个儿子血型为B型、H表型正常.例2 FUT1基因测序显示547～552delAG和814A＞G复合突变,母亲的FUT1基因为814A/G和547～552delAG杂合,复合突变遗传于母亲.结论 2例FUT1基因纯合和杂合突变致类孟买表型形成.
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大鼠精索静脉曲张后附睾上皮细胞凋亡及管腔α-1,4-葡糖苷酶、唾液酸含量观察
目的: 探讨大鼠左侧精索静脉曲张后同侧附睾上皮细胞凋亡与附睾管腔中α-1,4-葡糖苷酶和唾液酸含量改变的关系及意义. 方法: 16只雄性SD大鼠建立左侧精索静脉曲张模型,分为对照组和实验组,每组8只.缺口末端转移酶标记技术检测附睾上皮细胞凋亡;硝基酚法和5-甲基苯二酚法分别检测附睾管腔液α-1,4-葡糖苷酶和唾液酸含量.结果: 大鼠左侧精索静脉曲张模型建立后的第7 d,实验组同侧附睾上皮细胞凋亡指数显著高于对照组(P＜0.001);实验组附睾管腔液α-1,4-葡糖苷酶、唾液酸含量显著低于对照组(P＜0.05,P＜0.005).结论: 大鼠左侧精索静脉曲张可导致同侧附睾上皮细胞凋亡增加,进而影响该侧附睾上皮细胞的合成和分泌功能.
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岩藻糖相关指标联合检测在原发性肝癌诊断中的应用价值
目的 探讨联合检测α-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)、岩藻糖基化的甲胎蛋白(AFP-L3)和α-L-岩藻糖苷酶(AFU)在原发性肝癌(PLC)诊断中的应用价值.方法 选择92例PLC患者(PLC组)和42例非原发性肝癌患者(NPLC组),采用ELISA法检测血清FUT8和AFP-L3,采用电化学发光法检测血清AFU.结果 PLC组血清FUT8阳性62例(67％)、AFP-L3阳性69例(75％)、AFU阳性65例(71％),NPLC组分别为1例(2％)、3例(7％)、5例(12％);两组比较,P均＜0.05.FUT8诊断PLC的敏感性为67.39％、特异性为76.87％、准确性为91.04％,AFP-L3分别为75.00％、92.86％、80.60％,AFU分别为70.65％、88.10％ 、76.12％,三者联合检测分别为91.30％、90.48％、97.61％,三者联合检测诊断PLC的敏感性、准确性与单项检测比较,P均＜0.05.结论 血清FUT8、AFP-L3和AFU联合检测有助于PLC的诊断.
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类孟买血型的血清学特征及采血前后血液常规指标的观察
目的 对2例类孟买血型个体进行血清学鉴定、基因测序以及观察自体采血前后血液常规主要指标的变化.方法 采用血清学方法检测ABO血型、H抗原,采用PCR技术扩增α-1,2-岩藻糖基转移酶(FUT1)基因编码区序列并进行测序分析;采用血液分析仪检测血液常规主要指标.结果 2例类孟买血型个体确定为Bmh,直接测序其FUT1基因编码区序列:个体1:第547位～第552位A、G2个碱基缺失纯合(CAGAGAG→CAGAG)和第814位A/G杂合;个体2:第547位～第552位A、G2个碱基缺失纯合(CAGAGAG→CAGAG);个体1、2自体采血前后血常规主要指标无明显变化.结论 在类孟买血型个体中首次发现FUT1 547～ 552 delAG和814A＞G复合突变;类孟买血型作为受血者,输血时好采用自体血液输注.
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α-1,3半乳糖转移酶基因700C＞G点突变导致B型表型改变
目的:研究α-1,3半乳糖转移酶基因突变导致B型表型改变的血清学特点及分子机制.方法:分别使用单克隆标准血清、抗A1、抗H、多克隆人源抗A、人源抗B及ABO试剂红细胞、A2细胞、A2B细胞,进行血型血清学实验；采用PCR-RFLP方法进行基因分型,并扩增ABO基因第6和第7外显子进行克隆测序.结果:先证者αt-1,3半乳糖转移酶基因700C＞G点突变,基因型为B(A)700G/O,血型表型为AwB;其19名家系成员中,携带有该基因的成员共8名.结论:α-1,3半乳糖转移酶基因700C＞G点突变,可导致遗传学上为B型的人,其表型发生改变；临床上出现血型血清学实验不能确定的血型时,可采用分子生物学检测技术进行ABO血型分型,提高临床安全输血水平.
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高效液相色谱法测定α1,2岩藻糖基转移酶活性
目的:利用反相高效液相色谱技术建立α1,2岩藻糖基转移酶活性的测定方法.方法:反应混合物处理后进样,以90%的20 mmol/L KH<,2>PO<,4>(含5%四丁基溴化铵)和10%甲醇为流动相,254 nm波长下检测底物β-苯酰半乳糖苷的减少量.结果:方法回收率≥97%,变异系数为1.66%,准确度和精密度都较高.β-苯酰半乳糖苷峰单一,无其它杂峰干扰.反应管与对照管相比,β-苯酰半乳糖含量明显降低.结论:建立的反相高效液相色谱法测定α-1,2岩藻糖基转移酶方法可靠,适合于常规检测和体外表达研究.
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ABO亚型分析及基因测序研究方法的建立
目的:建立一种ABO血型基因的测序检测方法,对ABO血型的基因突变位点进行分析,并对ABO亚型进行准确分型.方法:采用PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)技术,选取特异性引物对ABO基因的第6、7外显子及第6内含子进行扩增,并用PCR直接测序方法对该序列进行分析,在此基础之上,用该方法对经血清学鉴定为亚型的样本进行检测.结果:建立的PCR产物直接测序方法,能够准确的对ABO基因的第6、7外显子序列进行分析,并通过此方法鉴定了1例B亚型,其基因型为B/O杂合,其中α-1,3半乳糖基转移酶基因在第7外显子上发生第721位C＞T突变,导致了多肽链Arg241Trp的替换.结论:建立了一种ABO血型基因产物的PCR直接测序方法,并对ABO亚型进行了分析,为以后血型鉴定及其亚型分子机制的研究奠定了基础.
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前列腺癌细胞系及组织中α-1,6岩藻糖基转移酶的表达及意义
目的 探讨α-1,6岩藻糖基转移酶(α-1,6 fucocyltransferase,FUT8)在不同前列腺癌细胞系、癌及癌旁组织中的表达差异及其意义.方法 培养前列腺正常上皮细胞(RWPE-1)、4种前列腺癌细胞(22RV1、LNCap、PC-3、DU145)及2种其他类型泌尿系统肿瘤细胞(T-24、786-O),收集15对前列腺癌及癌旁组织,提取总RNA,采用RT-PCR检测不同细胞系、癌及癌旁组织中FUT8 mRNA的表达,并进行差异比较.结果 FUT8 mRNA在前列腺癌细胞系中的表达高于前列腺正常上皮细胞系(RWPE-1)、膀胱癌细胞系(T-24)以及肾癌细胞系(786-O).雄激素非依赖性前列腺癌细胞系(PC-3、DU145)中FUT8 mRNA的表达高于雄激素依赖性前列腺癌细胞系(LNCap);前列腺癌转移灶细胞系(PC-3、DU145)中FUT8 mRNA的表达高于前列腺癌原发灶细胞系(22RV1).同时还发现,FUT8 mRNA在前列腺癌组织中的表达高于癌旁组织.以上差异均有统计学意义(P<0.01).结论 FUT8在不同前列腺癌细胞系、癌及癌旁组织中存在差异表达,可能参与前列腺癌的雄激素非依赖性转化及进展转移等过程.
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乳腺癌中α-1,6岩藻糖基转移酶表达的相关性研究及其临床意义
目的 探讨乳腺癌组织中α-1,6岩藻糖基转移酶mRNA和蛋白的表达水平及其临床意义.方法 应用蛋白免疫印迹法、实时荧光定量PCR法检测40例乳腺癌患者术后的癌组织、癌旁组织以及40名健康者的正常乳腺组织中α-1,6岩藻糖基转移酶在的表达情况,并分析其与乳腺癌之间的关系.结果 FUT8 mRNA和蛋白在乳腺癌组织中的表达水平高于癌旁组织和正常乳腺组织,差异有统计学意义(P＜0.05);Ⅲ期乳腺癌组织中FUT8蛋白表达水平明显高于Ⅰ-Ⅱ期,差异有统计学意义(P＜0.001);有淋巴结转移的乳腺癌组织中FUT8蛋白表达水平明显高于无淋巴结转移组,差异有统计学意义(P＜0.001).结论 高FUT8蛋白的表达与乳腺癌密切相关,其可能的调控机制及生物学效应有待进一步研究.
关键词： α-1 6岩藻糖基转移酶蛋白 乳腺癌 信使核糖核酸
