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棕榈酸诱导人绒毛滋养层细胞胰岛素抵抗模型的建立
目的 探讨人胎盘绒毛滋养层细胞HTR8-S/Vneo在高脂环境下是否会形成胰岛素抵抗. 方法 用MTT法测定棕榈酸和胰岛素不影响HTR8-S/Vneo细胞增殖的适浓度,在该适浓度下分为四组(对照组、棕榈酸组、胰岛素组、棕榈酸-胰岛素协同处理组)处理HTR8-S/Vneo细胞,检测不同处理条件及不同处理时间下,细胞葡萄糖摄取量和细胞内总糖量. 结果 用MTT法检测不同浓度棕榈酸及胰岛素处理的HTR8-S/Vneo细胞,发现棕榈酸浓度为0.125 mmol/L、胰岛素浓度为100 nmol/L时,对细胞增殖没有显著影响(P＞0.05),故选择该浓度的棕榈酸与胰岛素处理HTR8-S/Vneo细胞.在处理12h、18h、24 h、36h分别检测葡萄糖的消耗量和细胞内总糖量,发现与对照组相比,胰岛素处理后葡萄糖消耗量和细胞内总糖量呈上升趋势(P＜0.05),而棕榈酸处理后葡萄糖消耗量和细胞内总糖量无显著变化(P＞0.05);与棕榈酸单独处理组相比,棕榈酸-胰岛素协同处理组在12h和18h能显著增加细胞内总糖量(P＜0.05),但在24 h和36 h时这种显著差异消失(P＞0.05),且与单独胰岛素处理组相比,棕榈酸-胰岛素协同处理组显著降低了葡萄糖消耗量和细胞内总糖量(P＜0.05).结论 棕榈酸-胰岛素协同处理24 h,引起HTR8-S/Vneo细胞对胰岛素的敏感性降低,HTR8-S/Vneo细胞胰岛素抵抗模型建立;与文献报道模型相比,棕榈酸-胰岛素协同处理大大缩短了细胞出现胰岛素抵抗的时间.
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竹节参多糖对肝细胞损伤的影响
目的：探讨竹节参多糖对脂肪变性肝细胞的保护作用。方法制备竹节参多糖不同浓度(30%、60%及90%)乙醇洗脱部位,应用棕榈酸(PA)诱导HepG2脂肪变性的细胞模型,筛选药物的干预活性,采用MTT法观察细胞存活状况,油红O染色观察细胞脂肪变性情况,提取细胞总RNA检测相关因子的表达水平。结果 MTT法检测结果显示,30%醇沉组细胞存活率较模型组明显升高；油红 O 染色其细胞内泡状脂滴数目较模型组明显减少；RT-PCR检测结果显示,内质网应激相关基因葡萄糖调节蛋白、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白及炎性因子的表达较模型组明显降低。结论竹节参多糖30%乙醇洗脱部位能明显降低PA诱导的HepG2细胞脂肪变性,其机制可能是通过干预内质网应激反应实现。
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竹节参总皂苷对棕榈酸诱导HepG2细胞凋亡的保护作用研究
探讨竹节参总皂苷(TSPJ)对棕榈酸(PA)诱导的HepG2细胞凋亡的保护作用及分子机制.体外培养HepG2细胞,分为5组:对照组,模型组,竹节参参总皂苷高(50 mg·L-1)、中(25 mg·L-1)、低(12.5 mg·L-1)剂量组.5组细胞均培养24 h后,采用MTT法检测细胞活力,用Hoechst染色和Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡,用RT-PCR法检测TNF-α,IL-1β,BCL-2,CHOP和GAPDH mRNA表达水平,用Western blot法和流式检测BCL-2,CHOP和Toll样受体4(TLR4)蛋白表达量.结果表明,与正常组比较,模型组细胞数量显著减少(P＜0.01),凋亡细胞增多,与模型组比较,高,中剂量组细胞数量显著增多(P＜0.01),凋亡细胞减少;与正常组比较,模型组CHOP和TLR4蛋白表达量,TNF-α,IL-1β和CHOP mRNA表达水平显著升高(P＜0.01),BCL-2蛋白表达水平和mRNA表达水平显著降低(P＜0.01),与模型组比较,高剂量组CHOP和TLR4蛋白表达量,TNF-α,IL-1β和CHOP mRNA表达水平显著降低(P＜0.01),BCL-2蛋白表达量和mRNA表达水平显著升高(P＜0.01),提示竹节参总皂苷可以减轻PA诱导的炎症反应及凋亡,对肝细胞有一定的保护作用.
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棕榈酸诱导胰岛素瘤细胞MIN6细胞凋亡
目的 探讨蛋白激酶B及其磷酸化在棕榈酸诱导的胰岛素瘤细胞MIN6凋亡中的作用.方法 胰岛素瘤细胞MIN6分别在含有不同棕榈酸浓度(0～0.5 mmoL/L)的DMEM高糖培养基中孵育,培养基中加或不加PDK/PKB的阻断剂LY294002;TUNEL法观察凋亡并计数凋亡率;透射电镜观察MIN6细胞超微结构;Western blot检测蛋门激酶B(PKB)及其磷酸化蛋白p-PKB(Ser473)的表达;RT-PCR法榆测BAX、BCL-2 mRNA的表达.结果 MIN6细胞凋亡随着培养基中棕榈酸浓度的增加而增加,LY294002可增强其凋亡程度;棕榈酸抑制MIN6细胞的PKB在473位丝氨酸位点的磷酸化,抑制BCL-2 mRNA的表达并促进BAX mRNA的表达.结论 棕榈酸可能通过抑制PKB磷酸化的激活而诱导糖尿病时胰岛β细胞的凋亡.
关键词： 棕榈酸 蛋白激酶β 胰岛素瘤细胞株MIN6 凋亡 -
Ghrelin抑制棕榈酸诱导的大鼠内皮细胞凋亡及机制
目的 探讨ghrelin对棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡的作用及其与PI3K/Akt通路的关系.方法 大鼠主动脉内皮细胞在含0.3 mmol/L棕榈酸的DMEM培养基中孵育,培养基中加ghrelin及PI3K/Akt的阻断剂LY294002,流式细胞仪Annexin V/PI法检测凋亡,分光光度计检测caspase-3活性,Western blot检测总Akt及磷酸化Akt.结果 棕榈酸作用下大鼠主动脉内皮细胞凋亡率为30.30％±1.98％,显著高于对照组(5.01％±0.52％)(P＜0.01)；Ghrelin及棕榈酸共同作用下内皮细胞凋亡率为10.03％ ±0.90％,显著低予棕榈酸组(P＜0.01).Ghrelin引起Akt活化,PI3K/Akt阻断剂LY294002能阻断Akt活化并减轻ghrelin对内皮细胞凋亡的抑制作用.结论 Ghrelin能够抑制棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡,可能部分是通过PI3K/Akt通路起作用.
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突触孔蛋白和细胞色素C在棕榈酸诱导足细胞损伤中的表达及意义
目的 探讨细胞骨架蛋白突触孔蛋白(synaptopodin)和细胞色素C(Cyt C)在棕榈酸所致足细胞损伤中的表达及意义.方法 体外培养小鼠肾足细胞,分为正常对照组和棕榈酸组.各组细胞分别培养24h、72h和120h.应用MTT方法检测棕榈酸干预后足细胞活性的变化.应用免疫荧光及免疫印迹法检测棕榈酸干预后足细胞中synaptopodin和Cyt C蛋白的表达变化.结果 与正常对照组相比,棕榈酸组足细胞活性明显下降,且呈时间依赖性.棕榈酸可上调足细胞中Cyt C蛋白的表达,并下调synaptopodin的表达.结论 棕榈酸可诱导足细胞中Cyt C蛋白释放以及细胞骨架蛋白synaptopodin异常表达,可能参与了足细胞损伤.
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不同饱和度脂肪酸与足细胞损伤关系及损伤机制
目的：探讨不同饱和度脂肪酸与足细胞损伤的关系及相应的损伤机制。方法不同饱和度脂肪酸（棕榈酸、油酸、20碳5烯酸）分别干预足细胞，MTT法测足细胞存活率、免疫荧光检测足细胞骨架，从而判断足细胞是否损伤；Western印迹检测p38、细胞外信号调节激酶（ERK）1/2和氨基末端激酶（JNK）变化，RT?PCR检测COX?2和TNF?α，探讨相应损伤机制。结果经脂肪酸处理10 h，饱和脂肪酸棕榈酸组和对照组的细胞存活率分别为（66.96±2.41）%和（90.95±5.37）%（P<0.05）；棕榈酸组丝状肌动蛋白（F?actin）较其他实验组减少；棕榈酸组p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平升高，棕榈酸组与对照组的p?p38/p38、p?ERK/ERK和p?JNK/JNK差异均存在统计学意义（P<0.05）；棕榈酸组COX?2和TNF?α表达升高，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。4~8 h期间，单不饱和脂肪酸油酸可提高足细胞存活率。结论饱和脂肪酸棕榈酸可损伤足细胞，MAPK信号通路介导该损伤过程， MAPK信号通路中的p38、ERK1/2和JNK出现活化，并介导炎症因子COX?2和TNF?α产生；不饱和脂肪酸油酸可短期提高足细胞活力。
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芹菜素改善棕榈酸诱导的H9c2心肌细胞凋亡与氧化应激
目的 探讨芹菜素对棕榈酸诱导的H9c2心肌细胞凋亡的作用及其作用机制.方法体外培养大鼠H9c2心肌细胞,分为对照组、棕榈酸组、芹菜素组、棕榈酸+芹菜素组、c-Jun氨基末端激酶(JNK)激动剂组、JNK激动剂组+棕榈酸组,JNK激动剂+棕榈酸+芹菜素组.对照组加入0.5％二甲基亚砜(DMSO);棕榈酸组加入500μmol/L棕榈酸;芹菜素组加入20μmol/L芹菜素;棕榈酸+芹菜素组先加入20μmol/L芹菜素处理H9c2细胞2 h,之后再加入500μmol/L棕榈酸;JNK激动剂+棕榈酸+芹菜素组是在棕榈酸+芹菜素组的基础之上加用20 mg/kg JNK激动剂处理;JNK激动剂组只用20 mg/kg JNK激动剂处理;JNK激动剂+棕榈酸组用20 mg/kg JNK激动剂和500μmol/L棕榈酸共同刺激.经上述处理24 h后,光学显微镜下观察细胞形态;原位末端标记法(TUNEL)染色和分裂化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(C-caspase3)免疫荧光观察细胞凋亡;免疫印记检测凋亡相关蛋白和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路;RT-PCR检测超氧化物歧化酶(SOD1、2、3)的表达;DCFH-DA荧光探针检测活性氧簇(ROS)水平;氧化应激相关试剂盒检测丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性.结果光学显微镜下观察和TUNEL染色显示,相比对照组,棕榈酸显著诱导H9c2细胞凋亡,而芹菜素预处理可以显著降低棕榈酸诱导的细胞凋亡.免疫荧光染色显示,相比对照组,棕榈酸组C-caspase3聚积增加,而芹菜素可以抑制棕榈酸诱导的C-caspase3的聚积.免疫印记结果表明,和对照组相比,棕榈酸促进Bax和C-caspase3的表达(均P<0.05),而相对棕榈酸组,芹菜素提前干预2 h能抑制棕榈酸促进的Bax和C-caspase3的表达(均P<0.05).细胞内活性氧检测及实时定量PCR显示,和对照组相比,棕榈酸显著诱导细胞内ROS增加,转录水平SOD1、SOD2及SOD3减少,GPX产生减少,MDA产生增加(均P<0.05),和棕榈酸组相比,芹菜素+棕榈酸组,芹菜素预处理抑制了棕榈酸诱导的细胞内ROS的增加,抑制MDA的产生及恢复SOD和GPX的活性(均P<0.05).后借助JNK激动剂证实了相比对照组,棕榈酸增加JNK的磷酸化水平(P<0.05),而相比棕榈酸组,棕榈酸+芹菜素组,芹菜素预处理抑制了棕榈酸诱导的JNK的磷酸化(P<0.05).结论芹菜素可通过抑制JNK通路改善棕榈酸诱导的H9c2凋亡与氧化应激.
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高sn-2位棕榈酸配方乳对婴儿粪便脂肪酸及钙镁排泄的影响
目的 了解高sn-2位棕榈酸配方乳(HPIF)喂养对婴儿排便状况、粪便脂肪酸及钙镁排泄的影响.方法 采用前瞻性随机双盲对照研究,纳入2013年6月至2014年12月出生的健康、足月、单胎、适于胎龄儿共94例,于生后21 d内入组.配方乳喂养婴儿随机纳入普通配方乳(IF)组和HPIF组,同时以母乳喂养儿(BF)作为对照组,随访至日龄90 d.动态监测3组婴儿的生长指标和排便状况,同时检测粪便的脂肪酸以及钙镁含量.结果 3组婴儿在入组时、42 d和90 d时的头围、身长和体重比较差异均无统计学意义.配方乳组(IF组、HPIF组)在日龄42 d和90 d时的排便次数、糊状便次数均显著低于BF组婴儿;成形便的次数则显著高于BF组.日龄42 d时,IF组和HPIF组婴儿粪便棕榈酸(C16:0)含量[(31.1±9.8) mg/g和(30.9±10.7) mg/g干燥粪便]明显高于BF组婴儿[(10.8±8.8) mg/g干燥粪便];日龄90 d时,HPIF组婴儿粪便C16:0含量显著低于IF组婴儿[(24.3±9.8) mg/g比(29.9± 7.9) mg/g干燥粪便],但均明显高于BF组婴儿[(8.9±8.4) mg/g干燥粪便].日龄42 d时,HPIF组与IF组婴儿粪便钙含量[(38.3±14.0) mg/g比(38.8±15.5) mg/g干燥粪便]明显高于BF组婴儿[(21.3±13.7) mg/g干燥粪便];日龄90 d时,HPIF组婴儿粪便钙含量显著低于IF组婴儿[(31.1±11.2) mg/g比(45.9±16.5) mg/g干燥粪便],但仍显著高于BF组[(21.5±9.9)mg/g干燥粪便](P=0.045).HPIF组与IF组婴儿在42 d和90 d时婴儿粪便镁含量相仿,均显著高于BF组.3组婴儿粪便钙含量与粪便C16:0含量显著正相关(r=0.43,P＜0.01).结论 婴儿喂养应首选母乳.与普通配方乳喂养相比,HPIF喂养可显著减少婴儿肠道C16:0的丢失以及粪便钙的排泄,使之更接近于母乳喂养儿水平.
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棕榈酸对胰岛β细胞激素敏感性脂肪酶的影响
长期的高脂会造成胰岛β细胞胰岛素分泌障碍和三酰甘油(TG)的堆积,而过度堆积的TG是脂毒性的重要表现.激素敏感性脂肪酶(HSL)是催化TG水解的限速酶,在胰岛B细胞内表达和活化,并可能与胰岛素分泌及B细胞TG堆积有关.但是高脂对HSL的影响并不十分清楚.因此,本实验以不同浓度棕榈酸培养胰岛B细胞,观察其HSL的变化.
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N-乙酰半胱氨酸对脂毒性条件下INS-1细胞胰岛素信号分子基因表达影响的观察
目的 观察棕榈酸(PA)对INS-1细胞胰岛素分泌功能及胰岛素信号分子基因表达的影响及抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预的效果,探讨氧化应激(OS)的作用及机制. 方法 INS-1细胞分为对照(NC)组、棕榈酸(PA)组及PA+ NAC (PA+NAC)组,分别用0.2mmol/L PA和、或0.2 mg/ml NAC进行干预,48 h后进行相关检测:(1)行胰岛素释放试验,检测INS-1细胞胰岛素分泌功能；(2)测定细胞内硝基酪氨酸(NT)含量,评价OS水平；(3)实时荧光定量PCR反应,检测各组细胞胰岛素受体底物1(IRS-1)、胰岛素受体底物2(IRS-2)以及葡萄糖转运子2(Glut-2)基因表达的变化. 结果 (1)PA组IRI降低,PA+NAC组较PA组升高[(1.16±0.11)vs(0.84±0.12),P＜0.05];(2)PA干预细胞内NT水平增加,NAC干预水平降低；(3)与NC相比,PA组IRS-1,IRS-2以及Glut-2 mRNA表达分别降低19.9％,29.8％,42.3％.PA+ NAC组以上指标表达分别较PA组增加22.4％,47.1％,80.0％. 结论 FFA长期刺激可使INS-1细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)功能下降,IRS-1,IRS-2以及Glut-2 mRNA表达降低,NAC抗氧化干预能改善INS-1细胞胰岛素信号传导,部分逆转脂毒性导致的胰岛β细胞分泌功能异常,其机制可能与NAC纠正氧化及抗氧化失衡有关.
关键词： 棕榈酸 N-乙酰半胱氧酸(NAC) INS-1细胞 氧化应激 -
过表达NR2E1对棕榈酸诱导的NIT1细胞凋亡及内质网应激的影响
目的 研究孤儿核受体NR2E1对棕榈酸(PA)诱导的胰岛β细胞凋亡及内质网应激的影响. 方法 建立过表达NR2E1小鼠胰岛细胞系NIT1细胞株,予500 μmol/L PA处理24 h,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR检测C/EBP同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)mRNA表达变化,Western blot检测磷酸化真核翻译起始因子2a(p-eIF2α)的水平. 结果 过表达NR2E1能减少PA诱导的NIT1细胞凋亡率[(27.5±0.4)％vs(11.9±0.4)％]和CHOP mRNA表达[(10.54±1.98)vs (3.03±0.49)],增加GRP78 mRNA表达[(3.28±0.20)vs(5.28±0.49)]和eIF2α磷酸化水平[(1.26±0.13)vs(1.67±0.06)](P＜0.05). 结论 过表达NR2E1能减轻PA诱导的胰岛β细胞凋亡,其机制可能与调节内质网应激有关.
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Ghrelin对棕榈酸诱导的THP-1巨噬细胞上TLR4/NF-κB信号通路活化的作用
目的 探讨酰基化Ghrelin对棕榈酸(PA)诱导的人源单核巨噬细胞(THP-1巨噬细胞)上TLR4-NF-κB信号通路的作用. 方法 用不同浓度的PA孵育THP-1巨噬细胞株12 h；用不同浓度的酰基化Ghrelin孵育THP-1巨噬细胞株4h后,再加入PA(200μmol/L)孵育12 h.用实时定量PCR检测THP-1巨噬细胞上TLR4 mRNA的表达水平；用Western印记检测TLR4蛋白和细胞内NF-κB p65磷酸化蛋白水平；用ELISA方法检测细胞上清液中IL-1β和TNF-α的浓度. 结果 与对照组比较,PA 呈剂量依赖性增强THP-1巨噬细胞TLR4 mRNA和蛋白的表达水平,以及NF-κB p65磷酸化蛋白水平和分泌TNF-α、IL-1β的能力(P均＜0.05).与PA(200 μmol/L)组比较,酰基化Ghrelin呈剂量依赖性抑制THP-1巨噬细胞TLR4 mRNA (P均＜0.05)、TLR4蛋白和NF-κB p65磷酸化蛋白的水平(P均＜0.01),以及降低THP-1巨噬细胞分泌TNF-α水平(P均＜0.05)和IL-1β的水平(P均＜0.01). 结论PA可剂量依赖性诱导THP-1巨噬细胞TLR4/NF-κB信号通路的活化；酰基化Ghrelin可剂量依赖性抑制PA诱导的THP-1巨噬细胞TLR4/NF-κB信号通路的活化.
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Exendin-4通过抑制氨基末端激酶信号通路拮抗βTC6细胞脂性凋亡的研究
目的 研究Exendin-4对棕榈酸(PA)诱导的小鼠胰岛βTC6细胞c-jun氨基末端激酶(JNK)信号转导通路活化及凋亡的影响. 方法 不同浓度PA(0.125、0.25、0.5mmol/L)干预βTC6细胞12、24和48 h,cck-8法检测增殖活性；将βTC6细胞分为对照组、PA组、PA+SP 600125组和PA+Exendin-4组,观察细胞形态学变化；TUNEL法测细胞凋亡；Western blot法测p-JNK,JNK、p-c-jun,c-jun蛋白表达. 结果 (1)随PA浓度升高及干预时间延长,细胞增殖活性逐渐降低.(2)0.5 mmol/LPA干预24 h后,βTC6细胞凋亡增加(29.3±2.5)％,JNK,c-jun磷酸化增多.加用SP 600125或Exendin-4后,凋亡减少(22.5±3.2)％和(18.3±2.9)％.PA+ Exendin-4组p-JNK与p-c-jun表达有所下降. 结论 PA所致的β细胞内JNK及其底物蛋白c-jun磷酸化活化可能是β细胞脂性凋亡的重要环节.Exendin-4可通过抑制β细胞内JNK活化拮抗脂性凋亡.
关键词： 棕榈酸 βTC6细胞 细胞凋亡 c-jun氨基末端激酶信号转导通路 -
非诺贝特减轻棕榈酸诱导的胰岛素分泌功能损害
RIA法和RT-PCR法检测非诺贝特(FF)对棕榈酸(PA)诱发的胰岛素分泌、解偶联蛋白2(UCP-2)和PPAR-α mRNA异常的影响. 结果10-5～10-6mol/L FF改善PA诱导的基础胰岛素释放(BIS)异常升高及高糖刺激后胰岛素释放(GSIS)/BIS降低.PA 上调UCP-2表达而不影响PPAR-α;FF上调PPAR-α但不改变PA对UCP-2的作用.
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细胞内脂肪堆积和β细胞增殖的关系
目的研究脂肪酸(FA)对β细胞增殖抑制与细胞内的脂肪堆积的关系及相关的葡萄糖(Glu)浓度的影响. 方法培养胰岛β细胞株Ins-1E细胞,用3H-胸腺嘧啶和 3H-棕榈酸掺入的方法分别研究β细胞增殖及β细胞内脂肪堆积.利用RT-PCR方法测定肉毒碱棕榈酰转移酶1(CPT-1)基因表达. 结果与3.3 mmol/L Glu比较,24小时后6.6 mmol/L 和11 mmol/L Glu使细胞增殖增加2.27和3.04倍 (P<0.05);加入0.4 mmol/L棕榈酸后细胞增殖降为1.1和0.86倍(与无棕榈酸相比P<0.05).高浓度的Glu使细胞内脂肪堆积增加15%～92%.Triacsin C或Wy14 643能减少13%～54%的脂肪堆积,同时缓解FA对细胞增殖的抑制作用48%～71%.FA刺激CPT-1基因的表达,Glu对其有剂量依赖性的抑制,20 mmol/L Glu使CPT-1基因的表达减少50%(P<0.05). 结论 FA对β细胞增殖的抑制与脂肪在细胞内堆积有关,Glu可能通过抑制FA刺激CPT-1基因的表达,增加FA堆积从而介导FA对细胞增殖的抑制作用.
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内质网应激介导棕榈酸诱导的成骨细胞凋亡
目的 建立棕榈酸诱导成骨细胞凋亡的模型,探讨内质网应激在棕榈酸诱导成骨细胞凋亡中的作用.方法 选取小鼠成骨细胞MC3T3-El 14为研究对象,分组方法如下:(1)根据棕榈酸(palmitate,PA)作用浓度分为对照组(0μmol/L PA)、100 μmol/L PA组、250 μmol/L PA组和500 μmol/L PA组,分别孵育24 h;随后选择棕榈酸作用敏感浓度500 μmol/L,孵育成骨细胞不同时间(0、6、12、24 h).(2)应用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)进一步验证棕榈酸对成骨细胞增生和凋亡的影响.选择4-PBA作用敏感浓度5mmol/L,根据是否经4-PBA预处理分为对照组(0 μmol/L PA,0 mmol/L 4-PBA)、4-PBA组(0μmol/L PA,5 mmol/L 4-PBA)、4-PBA+ PA组(500μmol/L PA,5 mmol/L 4-PBA)和PA组(0 mmol/L 4-PBA,500 μmol/L PA)干预24 h.培养结束后,采用CCK-8法检测细胞增生活力;Annexin V/PI双染色法流式细胞术检测细胞凋亡率;Realtime quantitative PCR检测各组细胞内质网应激相关基因GRP78、CHOP、caspase-12 mRNA的表达.结果 与对照组相比,250和500 μmol/L棕榈酸干预成骨细胞24 h可明显降低细胞增生活力(A值:1.015±0.068,0.816±0.108,0.479±0.050,P＜0.05),细胞凋亡率则分别增高了6.70％±1.40％,15.30％±1.28％ (P＜0.05),CHOP和GRP78mRNA的表达水平呈剂量依赖性增高(均P＜0.05),而caspase-12 mRNA的表达水平则有所降低(P＜0.05);100μmol/L PA组增生活力、凋亡率及各基因表达量差异均无统计学意义(P＞0.05).与对照组相比,用500 μmol/L棕榈酸干预成骨细胞6、12、24 h后,细胞增生活力呈时间依赖性下降(A值:0.952±0.064,0.788±0.043,0.683±0.044,0.482±0.052,P＜0.05);凋亡率则分别增高3.63％±1.45％,9.0％±2.31％,15.7％±0.61％(均P＜0.05);CHOP mRNA表达水平呈时间依赖性增高(P＜0.05),GRP78 mRNA的表达水平在12h开始升高,24 h达到峰值(P＜0.05),caspase-12 mRNA表达水平则在12h达到峰值,24 h后开始下降(P＜0.05).与PA组相比,4-PBA+ PA组成骨细胞增生活力升高(A值:0.355 ±0.029 vs.0.451 ±0.049,P＜0.05),凋亡率降低8.6％±2.05％ (P ＜0.05),GRP78、CHOP和caspase-12mRNA的变化水平则呈现与单纯棕榈酸干预组相反趋势(均P＜0.05).结论 棕榈酸可能通过内质网应激途径诱导成骨细胞凋亡,4-PBA可以通过抑制内质网应激在一定程度上减少棕榈酸诱导的成骨细胞凋亡.
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软脂酸通过丝裂原活化蛋白激酶通路促进血管内皮细胞凋亡
目的 探讨软脂酸(PA)诱导的血管内皮细胞凋亡中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的作用.方法 将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分对照组、PA组、MAPK通路干预组[分别先用p38抑制剂SB203580、氨基末端激酶(JNK)抑制剂PD98059、细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂SP600125干预]再分为PA+SB组、PA+PD组、PA+SP组.流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot法检测caspase-3、磷酸化p38、JNK和ERK1/2表达水平;分光光度法检测caspase-3的活性.结果 与对照组比较,PA组、PA+ SB组、PA+PD组、PA+SP组HUVEC凋亡及caspase-3表达和活性明显增加,PA组磷酸化p38MAPK表达明显增加(P＜0.05).与PA组比较,PA+ SB组HUVEC细胞凋亡率、caspase-3表达和活性明显降低(P＜0.05);而PA+ PD组和PA+ SP组HUVEC凋亡率、caspase-3表达和活性无明显变化(P＞0.05).结论 PA通过p38MAPK通路促进内皮细胞凋亡.
关键词： 棕榈酸 丝裂原激活蛋白激酶类 p38丝裂原活化蛋白激酶类 内皮 血管 细胞凋亡 转录因子 -
软脂酸通过上调还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶表达促进血管内皮细胞凋亡
目的 探讨软脂酸(PA)诱导的血管内皮细胞凋亡中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的作用.方法 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)贴壁培养后分为对照组；PA(200、400、800 μmol/L)浓度组(分别为PA200组、PA400组、PA800组)；NADPH氧化酶抑制剂apocynin(50、100、200 mol/L)干预组(分别为apo50+PA400组、apo100+PA400组、apo200+PA400组).采用流式细胞仪检测细胞凋亡率；提取细胞蛋白,采用Western blot技术检测NADPH氧化酶亚基p47phox蛋白表达的水平.倒置共聚焦荧光显微镜检测活性氧的产生.结果 PA呈浓度依赖性诱导HUVEC凋亡；与对照组比较,PA400、PA800组HUVEC凋亡率明显升高,P47phox蛋白表达明显增强(P＜0.05),PA400组活性氧产生明显升高(P＜0.05)；与PA400组比较,apo100+PA400组、apo200+ PA400组HUVEC凋亡率明显降低,p47phox蛋白表达明显减弱,活性氧产生明显降低(P＜0.05).结论PA呈浓度依赖性诱导HUVEC凋亡,apocynin能部分抑制PA的上述作用,其机制与下调NADPH氧化酶亚基p47phox蛋白表达及活性氧产生有关.
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固醇调节元件结合蛋白1c抑制骨骼肌胰岛素受体底物1基因表达的分子机制
目的 探讨固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)抑制骨骼肌细胞胰岛素受体底物1 (IRS-1)基因转录的具体分子机制.方法 将SREBP-1c表达质粒、IRS-1启动子荧光素酶报告质粒及海肾质粒胸腺嘧啶核苷激酶启动子(pRL-TK)采用Lipofectamin 2000共转染L6细胞,以pCDNA3.1空质粒为对照,36 h后裂解细胞按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测荧光素酶.将表达SREBP-1c的腺病毒感染L6肌管细胞,以表达绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒作对照,感染48 h后收取细胞抽提核蛋白,进行凝胶迁移滞后实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀(CHIP)实验,分析SREBP-1c转录因子与IRS-1启动子区域的相互作用.组间比较采用双因素方差分析.结果 荧光素酶截断实验显示IRS-1启动子区域-450~-210 bp为SREBP-1c的作用范围.序列分析显示IRS-1启动子-302~-292 bp处存在SREBP-1c潜在的结合序列GCCTCCCGAG,该序列突变为TGTTAAATTA,荧光素酶实验显示SREBP-1c抑制野生型IRS-1启动子活性,而对突变型IRS-1启动子无抑制作用(分别为7.03± 1.28比19.09±2.45、3.55±1.68比3.96±1.09,F=114.437、0.251,均P>0.05);EMSA结果显示SREBP-1c蛋白与野生型探针直接结合,而不被突变探针所竞争.CHIP结果显示SREBP-1c可直接结合到IRS-1的启动子区域,定量分析显示PA组细胞SREBP-1c结合到IRS-1启动子区域的量为对照组的2倍, SREBP-1c过表达组为GFP组的5倍(分别为2.15±0.03比1.07±0.24,5.48±1.28比0.86±0.19,t=6.8775、5.495,均P<0.05).结论 SREBP-1c通过直接结合到IRS-1启动子区域的非典型固醇反应元件序列抑制IRS-1基因转录表达,继而影响胰岛素信号通路的转导.
关键词： 固醇调节元件结合蛋白1C 棕榈酸 骨骼肌 胰岛素受体底物1 分子机制
