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硫酸镍诱导小鼠卵巢细胞P53、P16、Bcl-2蛋白表达的研究
以前研究中我们得知,腹腔注射硫酸镍(NiSO4)致雌性小鼠卵巢损伤作用与NiSO4调控细胞周期诱导细胞凋亡有关[1].本研究用免疫组化法测定NiSO4.
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应用转瓶和生物反应器培养表达HBsAg的哺乳动物细胞系的比较研究
大规模培养哺乳动物细胞是生产具有重要医用价值的生物制品,如疫苗、生长因子、单抗等的重要方法.哺乳动物细胞的大规模培养方式主要有传统的转瓶和现代的各种生物反应器.目前,我国乙型肝炎疫苗(转基因中华地鼠卵巢细胞产品)的生产采用转瓶培养方式.但近年来,应用载体和生物反应器大规模培养哺乳动物细胞已成为国际上细胞培养工业化有发展前途的技术[1].本室引进了国外新的篮式载体型生物反应器系统用于哺乳动物细胞系的大规模培养研究.
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金纳米粒子对CHO-K1细胞毒性的谷胱甘肽作用机制
目的 探讨金纳米粒子(AuNP)对卵巢细胞CHO-K1的毒性作用及谷胱甘肽(GSH)的对抗作用.方法 AuNP 10～100 μmol·L-1作用卵巢细胞CHO-K1 72 h,MTT比色法检测细胞存活.AuNP 10 μmol·L-1,丁硫氨酸-亚砜亚胺(BSO)20 μmol·L-1及GSH 1 mmol·L-1单独或联合作用细胞72 h,MTT比色法检测细胞增殖,倒置相差显微镜观察细胞形态,AnnexinⅤ-FITC和PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡;AuNP 10 μmol·L-1,BSO 20 μmol·L-1及GSH 1 mmol·L-1单独或联合作用细胞48 h,共聚焦显微镜检测细胞骨架微丝,JC-1染色流式细胞仪检测线粒体膜电位.结果 AuNP 10～100 μmol·L-1对正常的CHO-K1细胞存活无明显影响.与正常对照组相比,AuNP 10 μmol·L-1 和BSO 20 μmol·L-1联合作用,可明显抑制CHO-K1细胞存活,抑制率为(80±2)%(P<0.01),胞体皱缩、变圆,细胞骨架微丝破坏;凋亡率为(66±6)%(P<0.01);细胞线粒体膜电位显著增加(P<0.01);加入外源性的GSH可逆转AuNP对因细胞GSH水平受抑而产生的细胞毒性.结论 AuNP对CHO-K1细胞损伤可能与GSH水平降低有关.
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简便微囊制备法——卵巢细胞微囊化的制备与功能检测
目的 探讨微囊化制备在卵巢细胞体外增殖培养研究中的作用.方法 将卵巢细胞分离培养并使用简便微囊制备法将卵巢细胞微囊化,观察细胞体外增生及测定培养液中雌激素和孕酮的含量,以检测卵巢细胞的内分泌功能和微囊的通透性能.结果 增生培养至第6代与原代卵巢细胞雌、孕激素的分泌量相近,而且微囊化后雌、孕激素的分泌量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 体外培养的卵巢细胞有内分泌功能,微囊化后不影响其分泌物的释放.
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组织工程技术再生卵巢的初步研究
目的:构建生物材料支架-卵巢细胞的移植体,观察动物体内移植后移植体的结局.方法:酶消化分离卵巢细胞,用细胞示踪剂CellTrackerTM CM-DiI标记,体外观察荧光标记细胞的动态变化;卵巢分离的细胞直接行荧光标记,种植于含孔隙的生物材料胶原海绵中,短时培养形成细胞-支架移植体,移植到小鼠背部皮下.1、3周收获移植体,分别进行冰冻和石蜡切片染色观察.结果:细胞荧光示踪剂CM-DiI标记卵巢细胞效率较高,24 h观察可达98.3％;1周后为66.4％,镜下荧光信号明亮,可作为卵巢细胞体内示踪的标记物.卵巢细胞-生物支架移植体移植后1、3周,移植卵巢细胞可在生物支架内存活,支架孔隙内可见大量细胞生长,并有类似血管样结构形成.结论:生物材料胶原海绵支持卵巢来源细胞体内生长,可作为构建三维人工卵巢的生物材料.
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硫酸镍致雌性小鼠卵巢损伤作用
目的 探讨硫酸镍致小鼠卵巢细胞凋亡的毒作用及其机制,为防治镍毒性导致的卵巢早衰提供科学依据.方法 健康昆明种雌性小鼠以每次以10.0,5.0,2.5mg/kg硫酸镍(NiSO4)腹腔注射染毒,0.2ml/(10 g·bw),1次/d,连续12 d.阴道脱落细胞学观察动情周期.摘取小鼠卵巢,制备卵巢贴片观察卵巢细胞的形态学变化,并利用流式细胞仪测定卵巢细胞细胞周期及DNA含量.结果 (1)染毒组小鼠动情间期延长且不规则.(2)光学显微镜可观察到细胞凋亡的形态学变化.(3)细胞周期分析显示随染毒剂量增加,小鼠卵巢细胞呈现G0/G1期细胞阻滞且G1峰前出现Ap峰(凋亡峰,亚二倍体峰),G2/M、S期细胞比例下降;细胞凋亡率增加;细胞增殖指数(PI)降低;异倍体指数(DI)增加.结论 腹腔注射硫酸镍可导致雌性小鼠卵巢损伤,其损伤作用与NiSO4调控细胞周期和诱导卵巢细胞凋亡有关.
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海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化大鼠卵巢细胞腹腔异体移植以及对肾上腺的影响
背景:应用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊技术包裹细胞进行异体移植,被证明是一种可避免受体产生免疫排异的有效方法.目的:观察海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化卵巢细胞种植于去卵巢大鼠腹腔后对受体大鼠肾上腺的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-03/2008-09在首都医科大学生殖医学研究中心完成.材料:取Wistar大鼠卵巢分离培养卵巢细胞,进行微囊化处理,制备包裹卵巢细胞的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊.方法:将40只雌性Wistar大鼠随机分为4组:去势组于无菌条件下切除双侧卵巢;微囊移植组手术摘除双侧卵巢后腹腔移植包裹卵巢细胞的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊;雌激素替代治疗组手术摘除双侧卵巢后腹腔注射乙烯雌酚 0.2 mg/kg,每3 d注射1次.正常对照组不进行任何处理.主要观察指标:干预后30 d放射免疫法检测大鼠血清中雌激素水平,观察肾上腺切片的形态学特点,并利用免疫组织化学SP法检测各组大鼠肾上腺皮质各层增殖细胞核抗原表达变化.结果:①放射免疫法检测正常对照组,雌激素替代治疗组以及微囊移植组雌激素水平明显高于去势组,而正常对照组,微囊移植组,雌激素替代治疗组之间雌激素水平差异无显著性意义.②去势组肾上腺皮质网状带增厚,网状带与球束状带比值增大,束状带和网状带增殖细胞核抗原阳性表达都增加;而微囊移植组及雌激素替代治疗组增殖细胞核抗原阳性细胞明显低于去势组,差异具有显著性意义.结论:微囊化大鼠卵巢细胞异体移植后,可在受体大鼠体内继续合成和分泌雌二醇,所分泌的雌激素可以纠正肾上腺皮质因卵巢摘除而导致的形态改变,并与雌激素替代治疗疗效相近.
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乙肝基因疫苗的免疫保护效果观察
我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染高发区,HBV携带者约有1亿多[1].为了保护易感人群,对乙肝表面抗原(HbsAg)阴性者进行乙肝疫苗注射,以提高自身免疫力.我国自行研制了地鼠卵巢细胞乙肝基因工程疫苗(CHO乙肝疫苗)[2],为了解接受国产乙肝疫苗后人群携带HbsAg及乙肝表面抗体(抗-HBs)状况,我们对人群乙肝疫苗免疫效果进行血清学调查,现报道如下.
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抗卵巢抗体检测在不孕症诊断的临床意义
自身免疫性抗体引起不孕在临床上已受到广泛关注,但是有关抗卵巢抗体(antiovarian antibodies, AoAb)在免疫因素所致不孕不育中的报道则很少.抗卵巢抗体早由Coulam等在研究早期绝经综合征时发现[1].它是有自身免疫系统将患者卵巢组织作为抗原而引起的自身免疫反应,从而产出抗体.近年来证实AoAb可多方面影响卵巢功能,包括:(1)包裹卵细胞,影响其排出或阻止精子穿入;(2)AoAb在补体作用下产生细胞毒作用,破坏卵巢细胞,还能干扰孕卵破壳而妨碍着床;(3)影响卵巢内分泌功能;(4)使T淋巴细胞浸润导致卵巢局部类促性腺样物质增多,引起下丘脑-垂体-卵巢轴功能紊乱,间接影响卵泡发育[1～4].
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用中国仓鼠卵巢细胞测定甲状腺刺激性抗体实验条件的探讨
目的 探讨用中国仓鼠卵巢促甲状腺素受体细胞(Chinese hamster overy-thyrotropin receptor cell,CHO-TSHR细胞)测定甲状腺刺激性抗体(TSAb)的实验条件.方法 参照文献方法,观察不同培养稀释液、细胞浓度、细胞培养时间、IgG浓度及IgG刺激时间对CHO-TSHR细胞cAMP生成的影响.结果 无NaCl的Hanks液可提高cAMP的生成量;细胞浓度为1×105孔-1、细胞培养48h、IgG浓度为1.0g·L-1、IgG刺激时间为3h时cAMP生成量大.结论 用CHO-hTSHR细胞作TSAb测定的合适条件为:(1)采用无NaCl的Hanks液做培养稀释液;(2)细胞浓度为1×105孔-1;(3)细胞培养时间为48h;(4)IgG用量为1.0g·孔-1;(5)IgG刺激时间为3h.
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FSH和IGF-1对大鼠卵巢细胞微囊化前后的影响
目的:观察微囊化卵巢细胞的形态变化及卵包刺激素(FSH)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对其增殖功能的影响,探讨微囊化卵巢细胞作为内源性雌激素来源的可行性.方法:分离21d龄雌性SD大鼠卵巢细胞,将培养至第一代的卵巢细胞微囊化包裹后接种于96孔板,加入含不同浓度的FSH和IGF-1(浓度分别为0、6.3、12.5、25、50、100 ng/mL)的无血清培养液;另将正常培养的卵巢细胞培养24 h后换无血清培养液进行相同的处理,培养44 h后,加入WST-1试剂,继续孵育4 h.全自动酶标仪测定光密度.结果:卵巢细胞在微囊内呈圆形均匀分布,48 h后形态无显著变化.FSH对培养的卵巢细胞和微囊化的卵巢细胞的增殖刺激作用均呈剂量依赖性,卵巢细胞的增殖刺激作用在FSH 50 ng/mL时,达到高峰(P＜0.05);对微囊化卵巢细胞的刺激作用在FSH 100 ng/mL时,细胞的增殖活性达到高峰(P＜0.05);IGF-1对卵巢细胞的刺激增殖作用在低剂量组不显著(6.3、12.5、25 ng/mL,P＞0.05),在高剂量组(50、100ng/mL)对卵巢细胞的剌激作用与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).IGF-1对微囊化卵巢细胞的刺激增殖作用呈剂量依赖性(P＜0.05),在IGF-1 50 ng/mL和100ng/mL组.微囊化卵巢细胞的OD值与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:卵巢细胞在微囊化后,可以在微囊内存活并保持其生物学活性,并且可以对外源性的FSH和IGF-1的刺激产生反应.
关键词： 微囊化 卵巢细胞 卵泡刺激素 胰岛素样生长因子-1 大鼠 -
通过噬菌体筛选表达人CD59的CHO细胞结合的内化短肽
目的筛选并鉴定与表达人CD59的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞特异结合的内化短肽,为设计具有拮抗CD59肿瘤逃逸活性的短肽药物奠定基础.方法以高表达人CD59的CHO细胞为靶,对噬菌体随机十二肽库进行5轮亲和筛选,并进行竞争结合实验,用ELISA法筛选噬菌体阳性克隆并对其进行DNA序列分析.结果随机挑选的10个克隆中有6个与人CD59结合力高,测序后得到2个高度同源的氨基酸序列. 结论获得了与高表达人CD59的CHO细胞结合的内化短肽序列,为进一步设计与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供了参考依据.
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不同雷公藤单体对仓鼠卵巢细胞凋亡的影响
目的:观察雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素及雷公藤内酯甲对仓鼠卵巢细胞凋亡的浓度及时间效应.方法:采用体外细胞培养,用不同质量浓度的雷公藤单体干预及相同质量浓度干预不同时间,显微镜下观察细胞形态及数量变化,AnnexinV-FITC/Pl法检测细胞凋亡率及蛋白印迹法检测细胞ERK磷酸化及c-fos表达水平.结果:不同单体干预的细胞凋亡率、ERK磷酸化及c-fos表达水平不同,以雷公藤甲素、雷酚内酯、雷公藤红素、雷公藤内酯甲显著.雷公藤甲素质量浓度在30 μg·L-1时细胞凋亡率高,其后质量浓度增加,细胞凋亡率并不增加;雷酚内酯干预后细胞凋亡呈浓度效应即随质量浓度增加细胞凋亡率升高;雷酚内酯、雷公藤红素、雷公藤内酯甲干预后随干预时间延长细胞ERK磷酸化及c-fos表达增加.结论:不同雷公藤单体引起细胞凋亡的质量浓度有差异,雷公藤甲素促进细胞凋亡的佳质量浓度是30 μg·L-1,而雷酚内酯在10～200μg· L-1范围内随质量浓度增加,引起细胞凋亡增加的现象.此外雷酚内酯、雷公藤红素、雷公藤内酯甲引起细胞凋亡相关蛋白的表达有时间效应.
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吗啡对μ阿片受体介导的ERK磷酸化的影响
目的：利用表达μ阿片受体的中国仓鼠卵巢细胞，研究吗啡急慢性处理下对细胞外信号调节激酶（ ERK）磷酸化的影响。方法免疫印迹检测磷酸化ERK水平，获取1 h急性处理的ERK磷酸化变化时程和36 h慢性处理以及纳洛酮催促下的ERK磷酸化变化。结果1μmol·L-1吗啡可以快速诱导ERK磷酸化水平短暂升高，5 min时达峰（ P〈0.01），吗啡诱导的ERK磷酸化水平升高具有显著的浓度依赖性。10μmol·L-1吗啡慢性处理36 h后ERK磷酸化水平与对照组比较，差异无统计学意义，但纳洛酮急性催促5或10 min均导致ERK磷酸化显著下降（与对照比较，P〈0.01）。结论吗啡急慢性刺激下以及纳洛酮催促下ERK磷酸化表现出不同的变化形式，提示μ阿片受体介导下ERK相关的信号通路发生了代偿。
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超声介导白蛋白微泡破裂法促进增强型绿色荧光蛋白C3基因在中国仓鼠卵巢细胞的表达
基因治疗的研究已取得不少进展,但要成功地应用于临床仍存在许多困难,安全、有效的基因载体及良好的靶向性就是其中重要的难点之一.本研究根据超声介导白蛋白微泡破裂可以增加真核细胞膜对大分子(如DNA)通透性的原理,探讨一种新的转基因方法,以便安全有效和定向地转移目的基因.实验中选择绿色荧光蛋白C3基因为标记基因,以白蛋白微泡为载体,用超声介导微泡破裂的方法在体外进行中国仓鼠卵巢细胞的基因转化,同时以脂质体为对照,激光共聚焦显微镜和流式细胞计数仪分别定性和定量观察细胞转化效率.台盼蓝染色观察细胞的活性.体外试验发现0.8 MHz、1.0 W/cm2、10%脉冲周期、60 s超声介导10%白蛋白微泡破裂可以有效稳定转化增强的绿色荧光蛋白C3基因在中国仓鼠卵巢细胞表达, 平均转化阳性率可达56.2%,活性实验证明对细胞无毒副作用,提示超声介导白蛋白微泡破裂法有应用于临床基因治疗的广阔前景.
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雷公藤甲素对中国仓鼠卵巢细胞凋亡的影响及黄体酮的干预效果
目的 探讨雷公藤甲素对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞凋亡的影响及黄体酮的干预效果.方法 将CHO细胞分为对照组、雷公藤甲素组、黄体酮组、雷公藤甲素+黄体酮组,分别给予等量培养液、0.05μg/μl雷公藤甲素、0.05μg/μl黄体酮、0.05μg/μl雷公藤甲素联合0.05μg/μl黄体酮干预.分别于干预后6 h及12 h检测4组CHO细胞凋亡率、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)磷酸化及即早基因c-fos表达水平.结果 雷公藤甲素组干预后6 h及12 h的细胞凋亡率均高于对照组和黄体酮组(均P<0.05),但两个时间点的细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05).雷公藤甲素+黄体酮组干预后6 h的细胞凋亡率高于对照组和黄体酮组,而低于雷公藤甲素组(均P<0.05),且干预后12 h的细胞凋亡率低于干预后6 h(P<0.05).雷公藤甲素组的ERK磷酸化水平低于对照组,c-fos水平高于对照组,雷公藤甲素+黄体酮组的ERK磷酸化水平和c-fos水平均低于对照组和雷公藤甲素组(均P<0.05).结论 雷公藤甲素可促进CHO细胞凋亡,可能与其引起ERK/c-fos异常表达有关,但干预时间延长并不增加细胞凋亡程度.黄体酮对雷公藤甲素所致仓鼠卵巢细胞损害具有保护功能.
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卵巢移行细胞癌4例分析
卵巢移行细胞癌(transitional cell carcinoma,TCC)是一类原发于卵巢细胞的具有移行上皮的特点,且组织中无良性、化生性或增生性Brenner瘤上皮成分的恶性肿瘤,是卵巢上皮性癌中较少见的类型.近年来临床报道增加,现将我院2010年1月-2011年6月间收治的4例卵巢TCC患者的临床资料进行分析.1 资料与方法1.1 一般资料 2010年1月-2011年6月我院收治经病理证实为卵巢TCC的患者4例(其中2例在外院行手术,术后病理经我院会诊证实),占同期新发恶性卵巢上皮性肿瘤的2.2％,平均年龄49岁(40～61岁).临床表现以腹块、腹痛、腹胀、腹水及消瘦为主,所有患者术前B超或CT提示有盆腔包块,3例为单侧.
