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小鼠淋巴瘤细胞经有限代次培养后Tk基因及相邻位点的基因型分析
小鼠淋巴瘤细胞胸腺嘧啶激酶基因突变测试(mouse lymphoma assay,MLA),现已广泛应用于化学物质的潜在遗传毒性检测[1-2].我国也已将该检测方法纳入保健食品毒理学测试规范和安全性评价程序[3].
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TK6和WTK1细胞tk位点突变敏感性的比较研究
目的比较研究2种起源于人类的tk+1-杂合子细胞TK6和WTK1细胞对化合物--甲基磺酸甲酯(MMS)诱发tk位点突变的敏感性,为tk位点突变敏感细胞株的筛选提供实验依据.方法用标准诱变剂MMS处理TK6和WTK1细胞,对培养物进一步作tk位点突变测试,以及细胞p53基因蛋白表达水平的检测.结果 MMS可诱导TK6和WTK1细胞tk位点的突变,其诱发突变分别是自发突变的2～7倍和3～10倍.WTK1细胞对MMS的细胞毒作用具有较大的抗性.MMS的作用下,WTK1细胞的突变频率分别是TK6细胞的15.7、19.0和20.4倍.在tk位点诱发了2种不同表型的突变集落,但以慢生长突变体为主.无论是自发突变还是MMS的诱发突变,WTK1细胞的突变频率均显著地高于TK6细胞.经MMS处理后,TK6细胞p53蛋白的表达水平增高更为明显.结论 WTK1细胞是更为敏感的tk基因突变试验检测细胞株.MMS诱发的突变有染色体畸变和基因突变,但以染色体畸变为主.
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从伪狂犬病病毒中删除Cre/LoxP介导的报告基因
根据pEGFP-C1序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出两端各含一个同向LoxP位点的GFP表达盒,克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-G-LoxP.通过经典同源重组方法,得到表达GFP的TK基因缺失伪狂犬病毒重组毒株S03109.该重组病毒在转染了pOG231(表达Cre重组酶)的293T细胞上连续传代,筛选得到重组病毒株S0419.荧光显微镜观察、Western blot及PCR检测结果表明,S03109感染细胞后持续表达GFP,而S0419不表达GFP.PCR 证实S0419为含单个LoxP位点的TK基因缺失病毒,并且在细胞培养上遗传稳定,测序结果(GenBank登录号AY822465)表明,在Cre重组酶的作用下,两个同向LoxP序列之间的GFP表达盒被正确除去.对BALB/c小鼠的半数致死量(LD50)及免疫保护实验结果表明,S03109和S0419对BALB/c小鼠的LD50值均大于3×105PFU,免疫BALB/c小鼠,攻毒后平均存活率分别为67.5%与70%.以上结果表明,利用Cre/LoxP位点特异性重组系统,成功去除了插入重组伪狂犬病病毒基因组中的GFP报告基因.
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TK基因联合mIL-2基因治疗胃癌的实验研究
目的通过转基因方法观察自杀基因TK对小鼠胃癌的杀伤作用,并联合mIL-2基因,观察免疫反应在增强TK杀伤性中的作用.方法应用逆转录病毒方法转导自杀基因TK,应用脂质体方法转导细胞因子基因mIL-2.通过体外实验观察TK基因对小鼠胃癌MFC细胞的杀伤性和旁观者效应;体内实验中首先在615小鼠建立胃癌模型,然后分组将病毒上清注入瘤体内,并结合应用前药和mIL-2基因,分别观察它们对肿瘤的杀伤作用.通过病理切片观察组织病理变化;应用免疫组化方法观察T淋巴细胞亚群在局部的聚集情况.结果 TK基因在体外即显出明显的杀伤作用,20%的转基因细胞可以杀伤70%～80%以上的肿瘤细胞.体内实验表明TK基因结合前药GCV可显著杀伤肿瘤,而TK基因本身并无杀伤作用(P=0.046).联合mIL-2后抗肿瘤作用进一步加强,部分肿瘤完全消退(P=0.005).免疫组化显示CD ,CD 细胞在局部聚集.结论自杀基因TK联合前药GCV对小鼠胃癌产生显著杀伤作用,不仅转基因细胞被杀死,而且通过旁观者效应杀伤大量周围细胞.细胞因子基因mIL-2可增强TK的抗肿瘤作用.
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脂质体介导的TK/GCV系统联合多柔比星对骨肉瘤细胞体外杀伤作用研究
目的 研究脂质体介导的TK/GCV系统联合普通化疗用于治疗骨肉瘤细胞的可行性,初步研究GCV联合常用化疗药物多柔比星对骨肉瘤mg-63细胞的杀伤作用.方法 订购重组质粒pIRES-EGFP-tk,培养和转染骨肉瘤细胞株mg-63,流式细胞仪分析和荧光倒置显微镜下观察细胞生长状态,观察GCV与多柔比星联合应用对mg-63的杀伤作用.结果 成功将tk导入mg-63,并能稳定表达.荧光显微镜下观察mg-63(tk+)呈现绿色荧光.GCV(10mg/L)可明显抑制mg-63(tk+)的生长,多柔比星低有效浓度为(1mg/L)；联合应用GCV5mg/L与多柔比星0.25mg/L,即能表现出对mg-63细胞生长明显的抑制作用.结论 脂质体介导的TK/GCV可对骨肉瘤细胞产生杀伤作用,与多柔比星联合应用可显著增强多柔比星对转化骨肉瘤细胞的杀伤作用,这将为骨肉瘤的新辅助化疗做出贡献.
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含HSV-TK基因及IL-18基因复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定
目的：分别构建含TK及IL-18基因的重组腺病毒载体，并进行鉴定。方法：通过DNA重组技术，构建含有目的基因的复制缺陷型腺病毒AdCMV-TK及AdCMV-IL-18；将上述重组腺病毒液感染293细胞，提取DNA，进行PCR鉴定；将病毒液感染293细胞，扩增病毒，用OD260法测定病毒滴度。结果：经PCR鉴定，鉴定正确的腺病毒命名为AdCMV-TK及AdCMV-IL-18，测定病毒滴度AdCMV-TK=1.28×109 PFU/mL；AdCMV-IL-18=1.28×109 PFU/mL。结论：成功构建了含HSV-TK基因及IL-18基因重组腺病毒载体，为肿瘤的基因治疗提供了理论依据及实验数据。
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乙基亚硝基脲诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因杂合性缺失
目的 探讨tk基因分子突变的类型,对不同剂量乙基亚硝基脲(ENU)诱导小鼠淋巴瘤L5178Y3.2.7c-tk+/-细胞tk基因突变的杂合性缺失(LOH)进行分析,为环境致突变荆检测和突变机制研究提供依据.方法 使用乙基亚硝基脲10μg/mL和100μg/mL剂量对L5178Y细胞进行梯度染毒,分别测定细胞毒性、细胞接种效率、相对存活率、相对悬浮生长率和突变频率等.挑选经ENU诱导的tk基因突变子(tk-/-)和自发突变体,提取基因组DNA,应用等位基因特异性PCR扩增、杂合性缺失分析等技术,分析其杂合性缺失的发生.结果 低剂量和高剂量诱导突变体的tk基因LOH发生率分别为73.5%和69.1%.LOH分析结果 显示,诱导突变体的LOH在大集落与小集落之间差异具有显著性(P＜0.05).结论 功能性等位基因缺失是ENU诱导tk基因分子突变的重要形式之一,不同剂量可能具有不同的突变机制.
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大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用
目的 评价大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用.方法 小鼠淋巴瘤细胞在代谢活化或非代谢活化条件下暴露于50、200、350、500 μg/mL.大黄酸3 h,处理后第2天将细胞接种于含有突变选择剂三氟胸苷的96孔板中,计数各剂量组的突变细胞集落数.通过计算第0天的相对存活率(relative survival,RS)、相对悬浮增长率(relatire suspension growth,RSG)和相对总增长率(relative total growth,RTG)确定细胞毒性.用MUTANT软件包计算各种细胞毒性参数和突变率,并对突变率数据进行统计分析.结果 在非代谢活化条件下,50、200、350、500 μg/mL的大黄酸均未见诱导L5178Y细胞的突变率增加,阳性对照组诱导的突变率显著增加;在代谢活化条件下,大黄酸350 μg/mL,剂量组诱导L5178Y细胞的突变率增加,阳性对照组诱导的突变率显著增加.结论 在非代谢活化条件下大黄酸各剂量组对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因无致突变作用;在肝微粒体酶系S9代谢活化条件下,出现了弱致突变性.
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HSV-TK基因重组腺病毒旁杀伤效应机制初探
目的:探讨HSV-TK基因重组腺病毒(AdTK)旁杀伤效应的机制.方法:用MTT法计算细胞抑制率,数据采用单因素方差分析.结果:病毒感染过的肿瘤细胞和经AdTK/GCV系统处理的肿瘤细胞培养上清液与未感染的肿瘤细胞按不同比例混合均显示出对肿瘤细胞的抑制作用.前者的抑制率随感染AdTK细胞比例的增加而增高,后者随上清液浓度的增加而升高.结论:旁杀伤效应在TK自杀基因的治疗中起非常重要的作用.旁杀伤效应可能是基于多个环节的共同作用.
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全反式维甲酸联合TK基因治疗对骨肉瘤旁观者效应的研究
目的 观察全反式维甲酸(ATRA)联合脂质体介导的自杀基因/丙氧鸟苷(TK/GCV)系统对人骨肉瘤U-2细胞旁观者效应的影响.方法 重组质粒plRES-EGFP-TK培养和转染人骨肉瘤U-2细胞,荧光倒置显微镜和流式细胞仪观察转染后的细胞生长状态,MTT法检测plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞的杀伤力.ELISA检测细胞培养液中连接蛋白(CX)43的表达情况.结果 plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞旁观者效应在TK+∶TK-细胞比例为5∶5时明显出现(P＜0.05),而联合ATRA后,在TK+ ∶TK-细胞比例为3∶7时明显出现(P＜0.05),且在细胞生存率均在50%时,TK+细胞比例下降20%.ATRA(10-6 mol/L)处理人骨肉瘤U-2细胞 24 h、48 h、72 h后,CX43蛋白的浓度分别为(0.559±0.018)ng/mL、(0.654±0.023)ng/mL、(0.826±0.065)ng/mL,均P＜0.01.结论 全反式维甲酸可能通过增强CX43的表达,提高plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞的杀伤效应.
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转铁蛋白受体介导的肝癌靶向性HSV-tk/GCV系统的构建及体外效应研究
目的:构建肝癌靶向性HSV-tk/GCV基因转移系统,并研究其在体外对肝癌细胞的杀伤效应.方法:体外培养通过基因重组技术构建和表达抗转铁蛋白受体(TfR)人-鼠嵌合抗体的转染瘤细胞D2C5.6,诱导裸鼠(Balb/c,nu/nu)产生腹水并纯化;以蛋白质连接因子-水溶性碳二亚胺(EDC)介导TfR的抗体与多聚左旋赖氨酸的连接(Ab-PLL),与pEBAF/ tk按比例混匀,得到Ab-PLL-pETAF/tk基因转移系统;分别转染不同的细胞株进行体外效应研究:人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721,人肺癌细胞株549,观察给予不同浓度的更昔洛韦(GCV)随时间延长的细胞改变情况,用MTT法检测GCV对不同细胞的杀伤作用.结果:分析型酸性尿素凝胶电泳证实抗TfR的抗体与PLL成功连接;体外杀伤实验显示:经Ab-PLL-pETAF/tk基因转移系统处理的3种细胞对GCV表现出不同的敏感性.HepG2细胞(CD71,AFP)对GCV很敏感,低浓度的GCV(1mg/L)处理3d,即可使细胞生长抑制率达到74.8%,SMMC7721细胞(CD71,AFP+)对GCV低度敏感,A549(CD71-,AFP-)对GCV不敏感.结论:TfR介导的肝癌靶向性HSV-tk/GCV基因转移系统构建成功;有可能用以肝癌细胞为靶细胞的基因治疗的研究.
关键词： 肝癌细胞 基因治疗 Tk基因 靶向性 抗CD71人-鼠嵌合抗体 -
TK自杀基因的构建及鉴定
目的 利用分子生物学技术,构建胸苷激酶基因(TK)自杀基因并测定其结构,为该自杀基因的进一步研究提供良好的实验基础.方法 以人类单纯疱疹病毒Ⅰ(HSV1)基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应(PCR)法,扩增出约为1 100 bp TK基因,定向克隆到载体PEGM-T,构建克隆载体.两端分别引入限制性内切酶Not Ⅰ、Xhol Ⅰ酶切位点,经PCR及酶切鉴定初步证实为重组体后,测序认证.结果 经PGR、酶切鉴定和测序鉴定完成TK基因的构建,同源性高达98.70%,完全具备表达该目的 基因的要求.结论 成功扩增出TK基因,为继续研究打下基础.
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L5178Y细胞tk基因突变试验评价芥子气致突性
目的 应用L5178Y细胞检测芥子气(Mustard gas,MG)诱发tk位点突变.方法 采用96孔微孔板接种法检测平板接种效率和突变频率.结果 芥子气诱发了LS178Y3.7.2-tk+/-细胞tk位点的突变,诱发突变是自发突变的2～15倍.在tk位点诱发了大克隆和小克隆两种不同表型的突变集落,但以小克隆为主.结论 L5198Y细胞检测MG诱发非位点突变可应用于化学战剂诱变性的检测.为tk基因突变试验评价化学战剂诱变性提供了实验方法.
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单纯疱疹病毒胸苷激酶基因真核表达载体的构建及其在食管癌细胞中的表创
目的:构建含单纯疱疹病毒胸苷激酶(HsV-tk)基因的真核表达载体(pcDNA3-tk),并观察能否在食管癌细胞株中表达.方法:将HsV-tk的cDNA亚克隆于真核表达载体pcDNA3上,构建pcDNA3-tk.后者经脂质体介导转染食管癌细胞株Eca-109,通过高剂量的G418选择培养,筛选出抗性克隆.经RT-PCR检测确定HsV-tk基因是否能在转染细胞内转录.结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3-tk,并且在pcDNA3-tk转染的食管癌细胞内发现tk基因的mRNA.结论:含HsV-tk基因的真核表达载体能在食管癌细胞中表达.
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运用套式PCR检测传染性喉气管炎病毒核酸
选择鸡传染性喉气管炎病毒保守TK基因的蛋白编码区域,设计并合成了一对外引物和一对内引物,建立并优化了检测鸡传染性喉气管炎病毒DNA的套式PCR法.通过检测ILTV感染的鸡胚绒毛尿囊膜、实验室病料和临床病料,结果表明,套式PCR法能检测出ILTV感染后的非免疫鸡胚和SPF鸡胚绒毛尿囊膜研磨液中的被稀释了105倍的病毒(约1fg的ILTV DNA),攻毒后第10天还能从非免疫鸡和SPF鸡气管拭子中检出ILTV,第10天非免疫鸡气管拭子中ILTV的大检出率为7/10,第10天SPF鸡气管拭子中ILTV的大检出率为8/10.对非免疫鸡和SPF鸡的气管拭子中ILTV佳检出时间均在攻毒后第5天.对临床样品中的ILTV的大检出率为7/7.经过核酸杂交验证,套式PCR法具有很高的特异性和敏感性,为从分子水平探讨ILTV的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段.
关键词： 鸡传染性喉气管炎病毒 Tk基因 套式PCR 检测 -
tk基因治疗脑胶质瘤时的免疫反应与旁观者效应的关系
目的探讨tk基因(thymidine kinase gene)治疗脑胶质瘤时的免疫反应与旁观者效应的关系.方法将C6tk+与C6tk- 按0%tk+, 10%tk+, 30%tk+, 50%tk+, 100%tk+5种比例混合,接种于SD鼠右侧顶叶,7d后腹腔注射GCV(更昔洛韦),剂量为30mg/kg/d,共10d.细胞接种3周后,处死动物,计算成瘤率,作病理检查,并作CD4+、CD8+的免疫组化染色.结果 50%及100%C6tk+组的成瘤率明显小于其余3组(P<0.05),病理检查发现50%及100%tk+组有淋巴细胞及浆细胞浸润.免疫组化显示每一组之间均有差异,提示有免疫反应存在.结论 tk基因治疗脑胶质瘤时,可激起机体内的免疫反应,增强抗肿瘤作用,它是旁观者效应的作用机制之一.
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HSV-tk基因/GCV系统治疗脑胶质瘤时的免疫反应
目的探讨tk基因治疗脑胶质瘤时的免疫反应与旁观者效应的关系.方法将C6tk+与C6tk-按0%tk+,10%tk+,30%tk+、50%tk+、100%tk+五种比例混合,接种于SD鼠右侧顶叶,7天后腹腔注射GCV(更昔洛韦),剂量为30 mg/kg/day,共10天.细胞接种3周后,处死动物,计算成瘤率,作病理检查,并作CD4+、CD8+的免疫组化染色.结果 50%及100%C6tk+组的在瘤率明显小于其余3组(P＜0.05),病理检查发现50%及100%tk+组有淋巴细胞及浆细胞浸润.免疫组化显示每一组之间均有差异,提示有免疫反应存在.结论 tk基因治疗脑胶质瘤时,可激起机体内的免疫反应,增强抗肿瘤作用,它是旁观者效应作用机制之一.
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鼻咽癌细胞中增强型表达载体调控TK基因与端粒酶活性关系的研究
目的:探讨人端粒酶催化亚单位(hTERT)基因核心启动子和原核增强子CMV联合调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦系统对TK基因的活性改变及与鼻咽癌细胞中端粒酶活性的关系.方法:将改良构建后的增强型载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp-CMV enhancer及单启动子载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp(作为对照组)分别转染端粒酶阳性的人鼻咽癌5-8F细胞株及对照组细胞人乳腺癌MCF-7细胞(端粒酶阳性)及正常人血管内皮ECV细胞(端粒酶阴性),采用荧光显微镜下观察其TK基因绿色荧光蛋白表达,实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中TK基因mRNA定量表达差异,TRAP银染法检测肿瘤细胞转染前后端粒酶活性改变并分析TK基因表达与端粒酶活性之间的关系.结果:①增强型表达载体转染鼻咽癌5-8F细胞及乳腺癌MCF-7细胞均有很强的荧光表达及TK基因的mRNA表达,比单启动子pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp及ECV细胞绿色荧光要强.实时荧光定量PCR显示,增强型载体组A值亦较对照组明显增高.②转染增强型载体(加GCV)后TRAP银染法检测鼻咽癌5-8F细胞端粒酶活性较转染前明显降低,但转染正常对照细胞后活性无变化.③加入GCV后,pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp-CMV enhancer对鼻咽癌5-8F细胞及乳腺癌MCF-7细胞体外增殖均有明显抑制作用,高于单启动子组pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp及空载体组pGL3-basic- EGFP3及空白对照组,而pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp-CMV enhancer转染ECV细胞无明显抑制作用.结论:hTERT启动子及CMV增强子可明显增强TK基因活性,并可导致该种肿瘤细胞端粒酶活性降低,靶向杀灭该种肿瘤细胞,但这种由TK基因介导的端粒酶活性抑制机制尚不清楚.
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腺病毒-tk基因同源重组系统构建的研究
目的 研制能快速高效地构建携带外源目的基因tk的重组腺病毒细菌内同源重组系统.方法 将pBluescriptⅡKDR-tk、ptrack与ptrackCMV质粒转化感受态细菌后扩增,通过PmeⅠ酶线性化穿梭载体ptrackCMV-tk,然后将线性化的穿梭载体ptrackCMV-tk与pAdeasy-1进行重组构建成重组腺病毒质粒;利用整合入重组病毒质粒中的绿色荧光蛋白分别筛选重组后的腺病毒质粒.结果 PCR和RT-PCR分析外源基因的表达证实tk基因在DNA和mRNA水平上均能有效表达;荧光显微镜下观察计数GFP阳性细胞数,计算病毒滴度为1.1 × 1011pfu/L.结论 细菌内同源重组系统能快速高效地构建携带外源目的基因tk的重组腺病毒;绿色荧光蛋白方便早期证实腺病毒的产生.
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腺病毒介导TK/GCV基因系统联合肿瘤坏死因子对膀胱癌细胞的体外杀伤作用
目的 研究腺病毒介导TK/GCV系统联合肿瘤坏死因子(TNF-?)对膀胱癌细胞的体外杀伤作用.方法 采用含有TK基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒(adv+)转染MB49细胞,观测转染率,RT-PCR检测转染细胞TK基因产物.以MB49细胞为对照,测定不同浓度TNF-?作用下MB49细胞、不同浓度GCV作用下MB49/TK细胞的存活率,采用GCV联合低浓度TNF-?对MB49/TK细胞进行体外杀伤研究;流式细胞仪检测TK/GCV、TNF-?、TNF-?+TK/GCV对MB49细胞作用8 h后细胞凋亡情况.结果 随着浓度的增高GCV对MB49/TK细胞、TNF-?对MB49细胞的生长抑制率逐渐增高.GCV联合TNF-?对细胞杀伤率均较同浓度下单纯GCV及单纯TNF-?作用时的细胞杀伤率有明显增强,且随TNF-?浓度增高联合治疗组杀伤效率增强:单纯50 ?g/ml GCV组、5 ?g/ml TNF-?+50 ?g/ml GCV组、20 ?g/ml TNF-?+50 ?g/ml GCV组杀伤率分别(24.39±1.10)％、(40.05_+0.97)％、(65.47±0.67)％.流式细胞仪检测细胞周期示TK/GCV、TNF-?、TK/GCV+TNF-?组作用细胞8 h均可见典型sub-G1期细胞凋亡峰,联合作用组凋亡率高.结论 TNF-?能明显增强TK/GCV自杀基因系统对膀胱癌的杀伤作用,两者联合能够有效促进膀胱癌细胞的凋亡.
