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siRNA对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制
为了探索CML的治疗新思路研究了siRNA(small interfering RNA)对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制作用.制备特异性对应bcr-abl融合基因的siRNA,转染K562细胞株,采用RT-PCR法测定bcr-abl融合基因mRNA的表达.结果表明:siRNA对bcr-abl基因表达的抑制作用随浓度的增加而增强,0.2μg siRNA能使bcr-abl融合基因mRNA的表达在24和48小时分别降低至对照组的19.9%和26.6%,但72小时时恢复到原水平,同时转染siRNA后细胞生长受到抑制.结论:siRNA可以有效的抑制K562细胞株中bcr-abl融合基因的表达.
关键词： siRNA bcr-8bl融合基因 K562细胞 -
汉防己甲素联合屈洛昔芬逆转K562/A02细胞耐药与诱导凋亡相关性的研究
本研究旨在探讨汉防己甲素(tetrandrine,Tet)联合屈洛昔芬(droloxifene,DRL)对耐药细胞系K562/A02的逆转作用与诱导凋亡有无相关性.采用Annexin V/PI法测定耐药调节剂汉防己甲素、屈洛昔芬单独或联合应用后细胞凋亡的情况.结果发现0.62μg/ml汉防己甲素或1.94 μg/ml屈洛昔芬单独作用于K562细胞48小时后均可诱导一定比例的细胞凋亡,作用呈时间依赖性,两者联合应用作用增强.0.62μg/ml汉防己甲素或1.94μg/ml屈洛昔芬单独作用于K562/A02细胞均不能诱导细胞凋亡,两者联合应用72小时可诱导小部分细胞凋亡.结论:汉防己甲素,屈洛昔芬逆转耐药的机理与诱导K562/A02细胞凋亡无关.
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塞来昔布联合干扰素α对K562细胞增殖、凋亡、细胞周期和CD117表达的影响
本研究探讨塞来昔布(Celecoxib)对K562细胞增殖、凋亡、细胞周期和CD117表达的影响及其与干扰素α(IFN-α)联用的协同作用.通过以不同浓度组合的Celecoxib和IFN-α作用于培养的K562细胞,用MTT比色法观察各组的细胞生长抑制情况,流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡和CD117膜抗原表达情况.结果显示:Cele-coxib可明显抑制K562细胞增殖,抑制效应呈浓度依赖性(r=-0.91).K562细胞培养72小时后,空白对照组、IFN-α组、Celecoxib组和Celecoxib联合IFN-α组的细胞增殖率分别为(96.1±0.5)%、(90.2±0.4)%、(57.2±0.9)%和(21.9±0.3)%;细胞凋亡率分别为(5.5±0.8)%、(6.3±0.6)%、(26.4%±3.9)%和(57.3±4.5)%;K562细胞膜CD117表达率分别为54.7%、10.5%、36.3%和7.3%.两药联用还可使K562细胞阻滞于G0/G1期.结论:Celecoxib和IFN-α不同程度地抑制K562细胞增殖和诱导细胞凋亡、产生G0/G1期阻滞和降低CD117表达,两药联用对上述效应具有协同作用.
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细胞内钙与K562/A02细胞多药耐药相关性的研究
本研究旨在探讨白血病耐药细胞的发生及其逆转机制与细胞内钙离子浓度的关系.用甲基四唑蓝法(MTT)测定柔红霉素(daunomycin,DNR)的细胞毒性,用Fura-2/AM方法测定耐药细胞株K562/A02及其敏感株K562的静息[Ca2+]i水平,并观察了柔红霉素及耐药调节剂汉防己甲素(Tetrandrine,Tet)、屈洛昔芬(droloxifene,DRL)单独或联合应用后细胞内游离钙离子浓度的变化.结果表明:1μmol/L Tet,5μmol/L DRL均能增加DNR 对耐药细胞系K562/A02的细胞毒作用,IC50(半数抑制量)分别为(7.28±2.06)μg/ml,(7.58±3.44)μg/ml,逆转倍数为2.94和2.82倍.两药联合作用明显增强,IC-50为(1.66±0.41)μg/ml,逆转倍数达12.9倍.静息状态下K562/A02细胞的游离钙离子浓度显著高于K562细胞.1 μmol/L Tet,5μmol/L DRL单独作用于K562/A02细胞引起[Ca2+]i的明显升高,两者联合应用有拮抗作用.结论:K562/A02细胞内Ca2+浓度的增高可能是导致其耐药的原因之一,但耐药调节剂Tet,DRL对耐药细胞[Ca2+]i的影响在其逆转耐药中的作用有待进一步研究.
关键词： [Ca2+]i多药耐药 汉防己甲素 屈洛昔芬 K562细胞 A02细胞 -
STI571诱导慢性髓系白血病K562细胞凋亡信号通路的研究
本研究应用基因芯片探讨酪氨酸激酶抑制剂(STI571)对K562细胞生长、增殖的影响,研究STI571诱导细胞凋亡过程中基因表达的变化及STI571诱导K562细胞凋亡的机制.用RD-PCR技术制备基因芯片探针,然后制成K562细胞表达谱芯片;用相差显微镜观察K562细胞在STI571处理前后的形态变化;用MTF法检测K562细胞的凋亡,用制备的K562细胞表达谱芯片分析基因表达水平.结果表明,在体外培养条件下用1.0 μmol/L的STI571处理K562细胞达到一定时间(24小时)后,K562细胞生长明显变缓,出现凋亡细胞的特征.用自制的K562细胞基因表达谱芯片检测显示,STI571诱导K562细胞凋亡前后的基因表达有差异.杂交检测后发现,经STI571诱导后基因表达下调的基因有9个,表达上调的基因有4个.这些表达变化的基因主要包括细胞周期相关基因、细胞代谢通路相关基因、信号转导和转录调节相关基因及抗凋亡基因.结论:STI571能有效抑制K562细胞生长,诱导K562细胞凋亡;筛选获得的靶基因在K562细胞恶性转化过程中发挥了重要作用,这为药物靶基因的筛选提供了理论基础.
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脂质体转染反义脱氧寡核苷酸对K562细胞α珠蛋白基因表达及细胞增殖的影响
本研究查明脂质体转染反义脱氧寡核苷酸(ASON)对K562细胞α珠蛋白基因表达的抑制作用及对细胞增殖的影响,探讨基因调控治疗β地中海贫血的新思路.设计合成靶向α珠蛋白基因的ASON,并与正义寡核苷酸(SON)和空白对照进行比较.采用脂质体转染技术将ASON、SON与K562细胞共同培养,用荧光显微术、流式细胞术检测脂质体转染效率,用实时荧光定量RT-PCR法检测K562细胞中α珠蛋白基因表达情况,并通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)法观察脂质体转染ASON技术对细胞增殖的影响.结果表明:脂质体转染效率在ASON作用24h达到高,脂质体转染ASON组的α珠蛋白基因表达水平显著低于SON和空白对照组(p＜0.01),并对细胞的增殖有明显的抑制作用,上述效应呈浓度依赖性.结论:脂质体转染ASON能特异性的抑制K562细胞中α珠蛋白基因表达,可能会成为β地中海贫血基因治疗的一个新靶点.
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转染反义VEGF121 cDNA恢复K562细胞β1整合素的活化功能
为了探索血管内皮细胞生长因子(VEGF)在K562细胞β1整合素活化功能中的作用,利用转染正义(S)、反义(As)VEGF121 cDNA及空载体(V,pcDNa3)的不同K562细胞株,通过流式细胞术检测其粘附分子VLA-4(CD49d/CD29)和VLA-5(CD49e/CD29)表达及β1整合素的可活化性.结果显示:K562/V,K562/S和K562/As细胞β1整合素VLA-4(CD49d/CD29)与VLA-5(CD49e/CD29)的表达率均在92%以上,但经β1整合素活化剂8A2抗体激活后,K562/As细胞可活化表9E9EG7表达率较K562/V细胞明显提高(75.6±10.5vs41.2±2.1%,P＜0.01).结论:转染反义VEGF121cDNA能增加K562细胞β1整合素的可活化性.
关键词： K562细胞 血管内皮生长因子 β1整合素 慢性髓性白血病细胞系 -
柚皮素诱导K562细胞凋亡与Caspase-3/Caspase-8酶活性及FAS/FASL蛋白表达的关系
本研究旨在探讨柚皮素(naringenin)在体外诱导K562细胞凋亡及其相关机制.采用体外培养K562细胞,用不同浓度的柚皮素处理;用MTT法测定细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测柚皮素作用后细胞凋亡率;透射电子显微镜观察柚皮素对K562细胞形态学的影响;caspase分光光度计法检测柚皮素作用后细胞内caspase-3和csapare-8活性的改变;细胞免疫化学染色检测柚皮素作用后细胞内FAS和FASL的表达.结果表明:柚皮素对K562细胞具有增殖抑制作用,并呈浓度和时间依赖性(p<0.05);在柚皮素作用下,出现典型亚G1峰,细胞凋亡率随柚皮素浓度的增高而增高(P<0.05);电子显微镜下细胞形态呈现凋亡征象;随着柚皮素浓度的增高,细胞内caspase3和caspase-8酶活性增高(P<0.05),FAS表达上升,FASL表达下降(p<0.05).结论:柚皮素在体外对K562细胞有诱导凋亡作用,而提高FAS的表达,降低FASL的表达,诱导caspase-3和caspase-8活化,可能是其作用机制.
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硝普钠诱导K562细胞凋亡过程中STAT3/P38MAPK活化及端粒酶hTERT-mRNA表达的研究
为了研究外源性一氧化氮供体硝普钠(SNP)诱导K562细胞凋亡过程中STAT3及P38MAPK活化及端粒酶hTERT-mRNA表达的变化,探讨硝普钠诱导K562细胞凋亡机制,用Annexin-V/PI双标记、DNA片段原位末端标记法、DNA凝胶电泳、DNA含量及细胞周期分析等方法检测细胞凋亡.用流式细胞术测定经硝普钠干预后K562细胞磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3的表达,同时利用实时荧光PCR定量检测端粒酶hTERT-mRNA表达的变化.结果表明: K562细胞经硝普钠作用后出现典型的细胞形态改变,DNA片段化,显现亚G1峰Ⅱ并显著增加.Annexin-V/PI和DNA片段原位末端标记表达增加.这些均证实NO能诱导K562细胞凋亡,大部分细胞阻滞于G0/G1期.SNP诱导K562细胞凋亡过程中,磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3的表达随SNP浓度的增加而表现为先增强后下降;K562细胞与2.0 mmol/L SNP孵育不同的时间内,磷酸化P38MAPK的表达在12小时时达到高峰并持续至48小时,72小时后表达下降;磷酸化STAT3的表达在24小时时达高峰,48小时后表达即显著下降;端粒酶hTERT-mRNA的表达随SNP作用的浓度增加和时间延长而显著下调.结论:SNP能诱导K562细胞凋亡,其机制可能与P38MAPK的活化、抑制端粒酶逆转录酶和STAT3的活化有关.
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右旋柠烯对HL-60、K562白血病细胞体外作用的研究
本研究观察右旋柠烯(d-limonene, D-L)对HL-60和K562白血病细胞增殖凋亡的影响,并进一步探讨其作用机制.首先采用碘化丙锭染色法观察右旋柠烯对HL-60、K562细胞增殖的影响,再通过细胞形态学观察、流式细胞术分析、免疫细胞化学半定量测定突变型p53、bcl-2、bax基因的表达水平,系统观察D-L对HL-60、K562细胞体外诱导凋亡的情况.结果表明: D-L抑制HL-60和K562细胞的增殖,IC50均为0.75 mmol/L,呈剂量时间依赖关系;D-L诱导HL-60、K562细胞凋亡;D-L在诱导HL-60细胞凋亡过程中随作用浓度增加,bcl-2的表达下降;D-L在诱导K562细胞凋亡过程中随作用浓度增加,突变型p53及bcl-2的表达下调,而bax的表达上调.结论: D-L抑制HL-60和K562细胞增值并诱导其凋亡;突变型p53,bcl-2,bax参与了D-L诱导凋亡的基因调控.
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质粒介导RNAi靶向hTERT抑制K562细胞端粒酶活性的研究
本研究探讨质粒载体介导的RNAi靶向hTERT对白血病细胞株K562 hTERT基因封闭、端粒酶活性抑制的作用.针对hTERT mRNA化学合成3条siKNA链转染K562细胞,筛选2条高效特异的siRNA链,构建靶向hTERT mRNA的质粒载体pSUPER-U6-Kan r-hTERT-1、pSUPER-126.Kan r-hTERT-2,在脂质体介导下转染K562细胞;48、72小时后分析靶基因hTERT mRNA的表达量,检测细胞端粒酶活性,同时检测细胞凋亡率.结果表明:3条siRNA链中,48小时目的基因表达抑制,但抑制率有差异,72小时后抑制作用渐消失;转染质粒pSUPER-U6-Kan r-hTERT-1(P-1组)、pSUPER-U6-Kan r-hTERT-2(P-2组)的K562细胞hTERT rnRNA表达均下降,P-1组48小时时为0.39±0.13,72小时时为0.57±0.32,P-2组48小时时为0.55±0.20,72小时时为0.88±0.23;端粒酶活性P-1组48小时时为0.42±0.07,72小时时为0.31±0.08;P-2组48小时时为0.49±0.27,72小时时为0.39±0.03;两组均较阴性对照明显下降,且以P-1组作用明显.48小时细胞凋亡率P-1组为18.39±3.08%,P-2组为15.5±3.59%.与阴性对照组7.64±3.73%相比有显著性差异,72小时细胞凋亡率P-1组为13.2±1.18%、P-2组为12.86±3.09%,与阴性对照组8.07±0.19%相比无统计学差异.结论:靶向hTERT的RNAi可抑制目的基因hTERT mRNA表达,进而抑制端粒酶活性.此抑制作用与靶位点选择密切相关,实验中si-hTERT-1优于si-hTERT-2;si-hTERT-3几乎无作用.由质粒载体介导RNAi作用时间明显长于化学合成siRNA,前者72小时甚至更长,后者仅48小时.端粒酶活性被抑制后,48小时的细胞凋亡较对照组有所增加,72小时时与对照组无差别,推测端粒酶活性下调后部分细胞可能被诱导分化.
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蛋白磷酸酶2A催化亚基β(PPP2Cβ)过表达慢病毒载体系统的构建及对K562红系分化的影响
目的:构建蛋白磷酸酶2A的催化亚基PPP2Cβ慢病毒表达载体,获得较高滴度慢病毒颗粒,感染K562细胞建立稳定株,检测过表达PPP2Cβ对K562红系分化的影响.方法:将PPP2Cβ的CDS序列插入到第二代慢病毒表达载体FUGW,并与包装质粒pMD2G和psPAX2共转染293T细胞,36、48h分两次收集慢病毒上清,应用流式细胞术检测病毒滴度.获得的病毒感染K562细胞,应用Western blot检测过表达效果.采用联苯胺染色以及实时定量PCR检测过表达PPP2Cβ对K562红系分化的影响.结果:成功构建了PPP2Cβ慢病毒表达载体,利用慢病毒系统包装PPP2Cβ的慢病毒,获得了高滴度的慢病毒颗粒,并成功建立了PPP2Cβ的K562细胞稳定株,促进了K562向红系分化.结论:过表达PPP2Cβ能使K562细胞自发的向红系分化.
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不同浓度硼替佐米对柔红霉素诱导的K562耐药细胞株ERK、JNK及P38表达的影响
本研究旨在观察蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib,PS-341)对柔红霉素(daunorubicin,DNR)诱导的K562白血病耐药细胞株ERK、YNK及P38表达的影响,探讨硼替佐米逆转耐药的分子机制.用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)进行耐药细胞株和硼替佐米细胞毒性的判定.以100 nmol/L DNR单用或联合应用1及10 nmol/L PS-341作用于K562耐药细胞株36小时,检测各组ERK、INK及P38的表达情况,检测各组细胞凋亡率.结果表明:与DNR组相比,PS-341联合DNR可抑制ERK和P38的表达,增加JNK的表达(p＜0.05).结论:PS-341可显著抑制K562耐药细胞株ERK和P38的表达,增加JNK的表达;PS-341通过MAPK途径逆转细胞耐药,促进细胞凋亡.
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双自杀基因慢病毒转移载体系统的构建及其对K562细胞的杀伤作用
为了探讨双自杀基因慢病毒转移载体系统对K562细胞的杀伤作用,采用分子生物学方法构建了含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(E.coli CD)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的双自杀基因慢病毒转移载体,将慢病毒基因转移系统中的3种成分质粒(目的基因转移载体、包装结构及包膜结构质粒)用脂质体分为2组(实验组、对照组)共转染入病毒包装细胞293T,在荧光显微镜下观察转染效果,在透射电镜下观察上清中的病毒颗粒.大量收集病毒上清,浓缩后感染K562细胞,荧光显微镜下观察感染效果,RT-PCR鉴定目的基因在K562细胞中的整合转录.给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和(或)无环鸟苷(GCV)后,用MTT法测定体外杀伤效应,扫描电镜下观察使用前体药物后K562细胞的变化.结果表明:成功构建了双自杀基因慢病毒转移载体,脂质体法可有效将上述慢病毒表达质粒转入293T细胞.荧光显微镜下观察到对照组大量绿色荧光蛋白(green fluorescenceprotein,GFP)表达.透射电镜下观察到大量浓缩后病毒颗粒.荧光显微镜下观察到此基因转移载体系统对293T细胞及K562细胞的感染率均很高,单独使用GCV或5-FC对转染自杀基因的K562细胞的生长抑制率(growth inhibition ration,GIR)分别为48.73%、50.16%,与未转染K562细胞比较明显升高,有显著性差异(P＜0.01),联合使用5-FC和GCV时K562细胞的GIR为87.69%,比单独使用5-FC或GCV时明显升高,有显著性差异(P＜0.01).结论:双自杀基因慢病毒基因转移载体系统可将双自杀基因高效转移至K562细胞,是一种有效的基因转移载体系统.
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人外周血NK细胞在细胞因子刺激下扩增后穿孔素、颗粒酶B基因表达的变化
目的 探讨经过纯化及在多种细胞因子的作用下扩增后的NK细胞,其穿孔素(per-furin)、颗粒酶B(granzyme B)表达水平的改变与细胞杀伤率的关系.方法 应用竞争性定量RT-PCR方法 检测了8例供者纯化、扩增后NK细胞的穿孔素、颗粒酶B基因表达水平,同时检测其对K562细胞的杀伤率.结果 经纯化、扩增后的NK细胞,在多种细胞因子作用下穿孔素和颗粒酶B的基因表达水平明显提高,且.IL-2+IL-15组、IL-2+IL-12+IL-15组基因的表达量均显著高于其他组,NK细胞对K562的杀伤率结果 与基因表达水平一致.结论 应用细胞因子后可使NK细胞的穿孔素、颗粒酶B基因表达水平明显提高,同时提高了NK细胞的杀伤功能.
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PD-L2剪切异构体与EGFP融合蛋白的表达及其亚细胞定位研究
目的探讨PD-L2的剪切异构体在哺乳动物细胞的表达和亚细胞定位. 方法以RT-PCR方法克隆人PD-L2基因的常规剪切体和新型剪切异构体的cDNA,构建其与EGFP融合的表达载体,分别转染K562细胞进行表达,经抗PD-L2抗体染色后以流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位. 结果从活化的人白细胞中克隆到常规剪切体PD-L2Ⅰ和新型剪切异构体PD-L2Ⅱ的cDNA, 后者删除了编码胞外区Ig-C结构域的外显子3.进而构建了PD-L2Ⅰ-EGFP和PD-L2Ⅱ-EGFP融合蛋白表达载体,分别转染K562细胞.流式细胞仪分析显示,转染前者的细胞中既可检测到EGFP的表达又可在细胞膜上检测到PD-L2表达;而转染后者的细胞中只能检测到EGFP的表达,在其细胞膜上不能检测到PD-L2表达.共聚焦显微镜观察显示,PD-L2Ⅰ-EGFP主要分布于细胞膜表面,PD-L2Ⅱ-EGFP则主要分布于细胞内. 结论常规剪切体PD-L2Ⅰ能正确定位于细胞膜表面,而新型剪切异构体PD-L2Ⅱ则位于细胞内,不能运输至细胞膜,提示不同PD-L2剪切异构体可能与其功能的调变有关.
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HLA-G3蛋白能够抑制多克隆NK细胞的杀伤功能
目的研究HLA-G3蛋白对NK细胞杀伤功能的抑制作用. 方法用RT-PCR方法扩增HLA-G3和HLA-G1的cDNA,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,采用脂质体转染法将其转入K562细胞,用免疫荧光法确定其在细胞表面表达,细胞毒试验研究其对NK细胞杀伤功能的抑制作用. 结果 HLA-G3蛋白和HLA-G1表达在细胞表面,以PBL细胞为效应细胞的细胞毒实验表明K562-G1细胞和K562-G3细胞的细胞裂解率都比K562细胞裂解率低. 结论 HLA-G3蛋白能够抑制多克隆NK细胞的杀伤功能.
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白细胞介素15促进 Vδ2γδT 细胞杀伤人白血病 K562细胞
目的：研究细胞因子白细胞介素15（IL-15）对Vδ2γδ（Vδ2）T细胞杀伤人白血病K562细胞的影响。方法分离人外周血单个核细胞，唑来膦酸联合IL-2扩增Vδ2T细胞；体外IL-15刺激，流式检测Vδ2 T细胞活化和功能变化。结果唑来膦酸可以大量扩增Vδ2 T细胞，IL-15能活化Vδ2 T细胞，增强Vδ2 T细胞脱颗粒能力和分泌IFN-γ功能，并能促进Vδ2 T细胞杀伤人白血病细胞K562。结论 IL-15刺激可以显著活化Vδ2T细胞，增强杀伤K562细胞功能。
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超声诱导K562细胞凋亡机制的研究
目的 本实验探讨超声体外诱导K562细胞凋亡的影响及其机制.方法 频率为1.8 MHz的超声波辐照正常外周血单核细胞和体外培养的K562细胞,辐照后用光学显微镜观察凋亡细胞形态学改变、流式细胞仪检测原位末端脱氧核苷酸转移酶(TUNEL)和p53、bcl-2、caspase-3、Fas、FasL蛋白表达水平.结果 电压为10 mV超声辐照细胞10 min后12 h和24 h,光学显微镜下可见凋亡小体形成等典型形态学改变,K562细胞凋亡率及p53、caspase-3、Fas、FasL蛋白表达水平分别显著高于对照组(P＜0.001);而bcl-2蛋白表达水平明显低于对照组(P＜0.001).结论 超声可以诱导K562细胞凋亡,其机制可能与p53、caspase-3、Fas、FasL蛋白表达增高及bcl-2蛋白表达降低有关.
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低强度He-Ne激光照射对K562细胞的抑制作用
目的 观察不同能量密度的低强度He-Ne激光对K562细胞的生物学作用。方法 以能量密度为1.89、4.74和9.47 J/cm2的He-Ne激光照射K562细胞，检测细胞活性；以能量密度为0.41、1.02和2.03J/cm2的He-Ne激光照射K562细胞，测定超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果 中、高能量密度He-Ne激光照射能显著抑制K562细胞生长，升高细胞内SOD活性，而低能量密度激光照射对细胞无明显影响。结论 较高能量密度的He-Ne激光对K562细胞的生长有抑制作用，其机制可能与胞内SOD活性增高有关。
