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短发夹RNA抑制三氧化二砷耐药的白血病K562/AS2细胞MRPI基因表达的实验研究
目的 研究短发夹RNA(shRNA)对耐三氧化二砷(As2O3)的白血病K562/AS2细胞MRPI基因表达的抑制作用.方法 设计并合成3条针对MRPI基因的shRNA序列,在脂质体的介导下转染K562/AS2细胞;用荧光实时定量PCR分析MRPI mRNA的表达水平;流式细胞术检测MRPI蛋白表达和细胞内柔红霉素蓄积量.结果 经MRPI shRNA作用24 h后,K562/AS2细胞株中MRPImRNA和蛋白表达水平明显下降,大下调幅度分别为(79.1±0.07)%和(62.48±0.86)%(P<0.05),同时细胞内柔红霉素蓄积量显著增加(P<0.05).结论 MRPI shRNA可抑制As2O3耐药的白血病细胞株K562/AS2细胞MRPl基因的表达.
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2-甲氧基雌二醇对白血病K562细胞凋亡相关基因表达的影响及其机制
目的 探讨2-甲氧基雌二醇(2-ME)对白血病K562细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 实验分为3组,对照组:培养基中不含2-ME;实验组:分别用1、2.4、8、16μmol/L的2-ME处理K562细胞36 h后观察各项指标的变化;阴性对照组:培养液中以无RNase蒸馏水代替K562细胞.应用原位细胞凋亡法(TUNEL)、流式细胞术(FCM)、半定量RT-PCR及黄嘌呤氧化酶法分别检测K562细胞凋亡率、Caspase-3、性连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)及其基因表达、超氧化物歧化酶(SOD)与活性氧(ROS)水平.结果 不同浓度的2-ME与K562细胞作用36 h后,2-ME在一定的浓度范围内以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡;2-ME通过上调促凋亡因子Caspase-3和(或)下调抗凋亡因子XIAP的表达,降低SOD及增加ROS水平等途径促进K562细胞凋亡,这可能是2-ME诱导K562细胞凋亡的机制之一.结论 2-ME能够以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡,显示了其在慢性粒细胞白血病(CML)治疗中的潜在价值.
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三氧化二砷诱导K562细胞凋亡过程中Par-4及WT1基因表达的变化
目的 探讨三氧化二砷(As2O3)诱导K562细胞凋亡过程中前列腺凋亡反应因子-4(Par-4)和WT1基因表达的变化.方法 用不同浓度As2O3(2～10 μmol/L)处理K562细胞24～72 h,MTT法测定细胞增生活力,流式细胞术检测细胞凋亡.采用荧光定量RT-PCR检测Par-4和WT1基因mRNA表达变化,Western blotting检测Par-4和WT1蛋白表达的变化.结果 不同浓度As2O3作用于K562细胞,随浓度增加能明显抑制细胞的生长,诱导细胞发生凋亡.同时Par-4基因mRNA和蛋白表达逐渐增加;而WT1基因mRNA及蛋白表达逐渐下降.结论 As2O3可抑制K562细胞生长,诱导细胞凋亡,Par-4与WT1基因可能参与As2O3诱导K562细胞凋亡的调控.
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阿糖胞苷对白血病细胞K562凋亡抑制基因Survivin的作用研究
目的 了解人类白血病细胞在化疗药物阿糖胞苷作用下的Survivin凋亡抑制基因表达情况,探讨阿糖胞苷治疗耐药的可能机制.方法 用MTT比色法检测K562细胞对阿糖胞苷的敏感性,以阿糖胞苷的IC50药物浓度处理K562细胞.应用RT-PCR和Western blotting的方法 检测各组细胞Survivin基因的mRNA表达情况和蛋白质的表达情况.结果 K562细胞经阿糖胞苷作用24、48 h后,细胞的Survivin mRNA表达较加药前分别增加1.92、3.38倍(P<0.05);24、48 h阿糖胞苷作用组细胞的Survivin的蛋白表达较对照组分别增加1.92、2.64倍(P<0.05).结论 阿糖胞苷作用白血病细胞后,细胞的Survivin基因mRNA和蛋白质表达升高,且具有时间效应.化疗药物作用后Survivin基因表达升高可能是白血病细胞治疗耐药的又一机制.
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NF-κB信号通路的激活对白血病细胞K562/A02多药耐药的影响
目的 研究K562细胞株及其耐药细胞株K562/A02 NF-κ B活性的差异性表达,探讨白血病多药耐药(MDR)发病机制.方法 用MTT法检测K562/A02的耐药倍数,观察细胞生长的形态学变化,PI单染法检测K562/S、K562/A02细胞周期分布,并用RT-PCR方法榆测mRNA的表达、流式细胞仪检测P糖蛋白(P-gp)表达及其功能,Western blotting方法检测细胞核NF-κB p65表达,比较K562与K562/A02白血病耐药细胞株之间的差异性.结果 与K562细胞不同,耐药细胞株K562/A02细胞生长特性发生改变,旱半贴壁生长,与K562/S细胞相比,K562/A02细胞的G0/G1期、S期比例增高,G2/M期细胞比例减低,差异有统计学意义(P＜0.05),凋亡细胞比例差异无统计学意义(P＞0.05),且检测到mdrl mRNA及细胞膜P-gp表达增高以及细胞核内NF-κB p65表达明显增加.结论 NF-κ B信号通路的激活即NF-κ B p65细胞核内转位可能参与了白血病MDR的形成.
关键词： K562细胞 K562/A02细胞株 核转求因子-κB P-糖蛋白 聚合酶链反应 -
锌指蛋白KLF4在K562细胞株中的表达和作用
目的 研究锌指蛋白KLF4在慢性粒细胞白血病细胞株K562中的表达,探讨KLF4在其中的作用.方法 采用RT-PCR及蛋白印迹法检测KLF4 mRNA、KLF4蛋白在K562细胞株和健康人单个核细胞巾的表达.结果 KLF4在K562细胞株中表达,KLF4 mRNA表达量为0.02±0.01,与其在健康人单个核细胞中的表达0.43±0.03比较,差异有统计学意义.KLF4蛋白在K562细胞株中的表达也明显低于正常对照组.结论 KLF4在K562细胞株中旱低表达,提示KLF4可能具有肿瘤抑制凶子作用,但其对白血病的增生、凋亡及耐药机制需要进一步研究.
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人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达
目的 构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP/Survivin,并转染K562细胞.方法 以pDNR/Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定.采用Superfect转染试剂转染K562细胞.提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达.结果 经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达.结论 pIRES2-EGFP/Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达.
关键词： Survivin基因 真核表达载体 转染 K562细胞 -
人类前列腺凋亡反应因子4基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达
目的 构建带有绿色荧光蛋白的人类前列腺凋亡反应因子4(Par-4)基因真核表达载体pIRES2-EGFP/Par-4,并转染K562细胞.方法 以pDNR/Par-4质粒为模板,PCR扩增Par-4基因,T-A克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定.采用Superfect转染试剂转染K562细胞.提取细胞总蛋白,Western blotting柃测Par-4表达.结果 经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/Par-4载体序列止确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,Western blotting 证实转染细胞中存在Par-4蛋白的表达.结论 pIRES2-EGFP/Par-4表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达.
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肝素干预长春新碱诱导的K562细胞凋亡
目的 探讨肝素对长春新碱诱导的K562细胞凋亡及增生的影响.方法 肝素预处理K562细胞1 h,再经长春新碱(0.05 mg/L)处理24 h,应用Hoechst 33342染色、DNA电泳、FMC等方法检测细胞凋亡.Trypan blue染色及MTT法检测细胞毒性及增生反应.结果 Hoechst 33342荧光染色见长春新碱凋亡诱导组细胞凋亡率达40.10%,肝素25、50、100、200 U/ml组凋亡率依次为32.47%、29.70%、25.50%、19.53%(均P＜0.05).随肝素浓度增加DNA电泳凋亡梯带亮度逐渐减弱至消失.FACS检测凋亡诱导组凋亡率为21.61%,肝素25～200 U/ml组凋亡率依次为13.64%、11.75%、8.59%、6.03%(均P＜0.05).肝素各组处理K562细胞24 h后细胞存活率、活细胞总数及细胞增生水平与正常对照组比较差异均有统计学意义(P＞0.05).结论 肝素浓度在200 U/ml内对K562细胞无毒性作用及增生影响,在25～200 U/ml以浓度依赖性方式抑制由长春新碱诱导的KS62细胞凋亡.
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂提高腺病毒对K562细胞转染及杀伤效率的研究
目的 研究通过观察组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人类白血病细胞系K562柯萨奇-腺病毒受体(CAR)表达水平的影响,并探讨HDAC抑制剂在以腺病毒为载体的基因治疗中的应用价值.方法 在mRNA和蛋白水平检测TSA处理K562细胞前后CAR的表达情况,采用流式细胞术测定病毒的转染效率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测腺病毒及其携带的基因的体外抗瘤效应.结果 TSA处理后,K562细胞CAR的mRNA和蛋白表达明显增高;流式细胞仪分析ADV-GFP转染K562后GFP的表达发现:未处理组的转染率为(8.74±0.34)%,1、10和100 nmol/LTSA处理细胞48h后的转染率分别为(12.26±0.55)%、(20.83±1.22)%和(28.66±0.43)%.未处理组与处理组间及各处理组间转染效率的差异有统计学意义(P《0.05).MTT结果表明腺病毒M1介导的体外杀伤效应TSA处理组比未处理组增强(P《0.05),TSA各处理组间的体外杀伤效应随TSA浓度的提高而增强(P《0.05).结论 低浓度的TSA可以增强腺病毒对K562细胞的感染及杀伤效率,可以提高以腺病毒为载体的血液肿瘤基因治疗的疗效.
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柚皮素对人类白血病K562细胞生长的作用及其机制探讨
目的 研究柚皮素(naringenin)对人类慢性髓系白血病K562细胞株的作用及其机制.方法 体外培养K562细胞,MTT法检测柚皮素在不同浓度、不同时间点对K562细胞生长的影响;用免疫组织化学的方法检测细胞增殖核抗原(PCNA)的表达,并计算PCNA标记指数(LI);显微镜和透射电镜下观察细胞形态变化;流式细胞仪分析细胞周期分布和细胞凋亡率;用RT-PCR和Western blot的方法检测K562细胞中p53、p21WAF1 mRNA和蛋白表达的变化.结果 柚皮素对K562细胞增生有明显抑制作用,作用24、48和72 h后的半数抑制浓度(IC50)分别为455 μmol/L、225 μmol/L和175 μmol/L;PCNA在柚皮素实验组的表达显著低于对照组;普通光镜以及电镜观察均见实验组细胞显著的增生抑制和典型的细胞凋亡形态学改变;流式细胞仪分析证实柚皮素能使K562细胞聚积在G0/G1期、S期细胞减少,凋亡率增加;RT-PCR和Western-blot检测表明,实验组细胞表达p21 mRNA和蛋白质呈浓度和时间依赖性升高,而p53变化不明显.结论 柚皮素对K562细胞具有明显的增生抑制作用,细胞周期阻滞和诱导凋亡可能是其重要机制,而非p53依赖性的p21上调可能是其发挥作用的重要途径.
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K562及其耐药细胞系多药耐药机制的蛋白质组学研究
目的 探讨K562及其耐药细胞系K562/ADM(由多柔比星诱导的耐药K562细胞系)蛋白差异表达情况.方法 应用二维荧光差异电泳结合质谱技术,经过相应软件处理找出K562和K562耐药细胞之间蛋白质表达质和量的变化.结果 二维电泳发现11个差异蛋白点,质谱鉴定出9个表达差异的蛋白质,其中4种蛋白质与能量代谢有关;3种蛋白质与细胞信号转导有关;2种蛋白质与细胞增生相关.9种差异表达蛋白质中,6种在K562/ADM中表达增加,3种表达降低.结论 应用二维凝胶电泳结合质谱技术对白血病多药耐药机制研究是一种新的可靠手段,可对揭示耐药细胞与敏感细胞蛋白组学变化和蛋白质之间的相互作用提供新的思路.
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三氧化二砷联合甲磺酸伊马替尼、咖啡因对K562白血病细胞的协同作用
目的 探讨三氧化二砷(Arsenic trioxide,As2O3)与酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼(实验药物代号STI571)以及细胞周期调节剂咖啡因联合诱导K562细胞凋亡的作用及机制,为寻找克服K562细胞对As2O3抵抗的有效手段提供实验依据.方法 以As2O3与STI571、咖啡因联合作用于K562细胞,采用MTY方法检测细胞增生活性,PI染色流式细胞仪检测细胞周期,PI和Annexin V双染色流式检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞周期相关调节蛋白的表达.结果 5.0 μmol/L浓度的咖啡因对K562细胞增生无抑制作用,亦不能增强As2O3的抑制作用,单独以STI571 1.0 μmol/L处理,即可有效抑制K562细胞的生长,与As2O3联用能明显增加其抑制增生的效应;咖啡因与As2O3联合作用,不增加As2O3诱导的K562细胞凋亡率[(14.7±3.6)%vs (15.3±3.3)%,P＞0.05];STI571具有轻度诱导K562细胞凋亡的作用[(18.3±4.5)%],与As2O3合用可显著增加诱导凋亡率[(14.7±3.6)%vs (42.8±4.2)%,P＜0.01],并明显降低As2O3诱导的G2/M期细胞比例.与单用As2O3比较,As2O3+STI571明显抑制cdc2、cdc2-p及survivin蛋白表达,而As2O3与咖啡因合用不能诱导survivin蛋白表达下调,对cdc2、cdc2-p蛋白的表达无明显影响.结论 周期调节药物咖啡因对As2O3诱导K562细胞凋亡无增敏作用;酪氨酸激酶抑制剂STI571能协同As2O3诱导K562细胞凋亡,下调抗凋亡蛋白survivin的表达可能是其机制之一,值得深入研究其临床应用效果.
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2-甲氧基雌二醇对白血病细胞K562增生、凋亡及细胞周期的影响
目的 探讨2-甲氧基雌二醇(2-ME)对体外培养的慢性粒细胞白血病(CML)急变期细胞系bcr-abl(+)K562细胞增生、凋亡及细胞周期的影响.方法 将不同浓度和作用时间的2-ME与K562细胞共同培养,采用相差显微镜观察细胞的形态学变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测2-ME对K562细胞增生的抑制作用;流式细胞术分析2-ME对K562细胞凋亡及细胞周期的影响.结果 1～16 μmol/L浓度的2-ME在24、36、48及60h均可明显抑制K562细胞增生,并在一定范围内呈时间和剂量依赖性;2-ME作用后G0/G1期细胞增加,并伴随细胞凋亡峰和凋亡率的升高.结论 2-ME可抑制K562细胞增生,诱导其凋亡,为2-ME的临床应用提供实验依据.
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高电压脉冲电场对K562细胞凋亡的影响
背景与目的:探讨高电压脉冲电场诱导K562细胞凋亡的情况,寻求血液肿瘤治疗的新途径.材料与方法:采用高电压脉冲电场装置处理K562细胞,利用双标记流式细胞术(Annexin V-FITC/PI法)测定细胞凋亡率,通过透射电子显微镜观察K562细胞的超微结构.结果:经过高电压脉冲电场处理后的K562细胞,胞内出现大量空泡及裂隙,核内染色质向核周边聚集形成凋亡小体,呈典型细胞凋亡形态学改变;K562癌细胞的凋亡比例随着脉冲个数和电场强度的增加而增加.结论:高电压脉冲电场可以诱导K562细胞凋亡.该结果可为治疗癌症提供一个新的途径.
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小剂量苦参碱诱导K562细胞凋亡的研究
目的研究小剂量苦参碱对白血病细胞K562的凋亡诱导作用.方法利用小剂量苦参碱对白血病细胞K562进行凋亡诱导实验,通过细胞形态学观察、细胞周期分析、流式细胞仪及凋亡细胞检测试剂盒检测凋亡细胞.结果0.3g/L浓度苦参碱作用K562细胞5～7天,细胞呈现出凋亡的形态学特征,细胞周期受阻于G1期,亚二倍体细胞数随作用时间延长而增加,凋亡细胞试剂盒检测出凋亡细胞.结论小剂量苦参碱可诱导白血病细胞K562凋亡,苦参碱有可能成为新的白血病治疗的高效药物.
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褪黑素对K562细胞巨核细胞分化的影响
目的 初步明确褪黑素对K562细胞巨核细胞分化的影响. 方法 用一定浓度的佛波酯( PMA)联合褪黑素处理K562 细胞48 小时,显微镜观察K562细胞形态改变,硝基四氮唑蓝( NBT)还原实验观察K562细胞巨核细胞分化比例,荧光定量PCR检测K562细胞巨核分化中CD41和CD61的mR-NA水平的变化. 结果 褪黑素可以抑制PMA诱导的K562细胞巨核细胞分化.
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麻黄碱逆转K562/A02细胞多药耐药性的研究
目的:观察非细胞毒性浓度的麻黄碱对耐药的白血病细胞株(K562/A02)多药耐药性的逆转作用,并探讨其逆转机制.方法:用MTT法检测麻黄碱的细胞毒作用;用流式细胞仪检测非细胞毒性的麻黄碱处理后K562/A02细胞膜表面糖蛋白P170表达的及功能的变化.结果:麻黄碱对K562/A02有一定的细胞毒作用,其非细胞毒浓度(IC10)为75ug·m1-1,非细胞毒性浓度的麻黄碱对K562/A02细胞对阿霉素的耐药性有部分逆转作用(5.67倍),作用于K562/A02细胞后,细胞膜糖蛋白P170的表达从85.32±5.49%下调至34.78±1.18%,DNR外渗试验显示,细胞内化疗药物的浓度明显增加.结论:麻黄碱通过下调K562/A02细胞膜糖蛋白P170的表达,抑制其将化疗药物"泵"出细胞外的功能,提高了化疗药物在K562/A02细胞内的有效浓度,能部分逆转K562/A02细胞的多耐药性.
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苦参碱对白血病细胞K562抑制作用的实验研究
目的:探讨苦参碱对白血病细胞株k562抑制作用.方法:1.用含5%胎牛血清的RPMI1640培养基培养人白血病细胞株k562于25ml的培养瓶中培养,取对数生长期的细胞进行实验.2.将细胞浓度调整为1×104/ml的细胞悬液接种于96孔酶标板,共设5个实验组(每组设4个平行空,并重复实验),以终浓度苦参碱0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0mg/ml各50ul为实验组,空白组加等量培养基,阴性组加等量终浓度为0.01%的DMSO.3.作用24h、48h、72h后分别用CCK-8试剂盒检测苦参碱对k562细胞抑制作用并计算抑制率.结果:不同浓度的苦参碱对k562都有抑制作用,随着苦参碱浓度增加和作用时间的延长其抑制作用增强.结论:苦参碱对白血病细胞k562有明显抑制作用,且呈时间浓度依赖性.
