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未知基因KH开放阅读框架真核表达载体的构建及其对K562细胞增殖的影响
目的:构建未知基因KH的开放阅读框架(open reading frame,ORF)的真核表达体系,初步探讨未知基因KH的功能.方法:采用DNA重组技术将KH基因片段的开放阅读框架(KH-ORF)亚克隆于表达载体pCl-neo Mammalian Expression Vector,重组为pCI-neo-KH-ORF真核表达体系,脂质体转染K562细胞,RT-PCR检测目的基因KH的表达.采用体外培养技术,通过pCI-neo-KH-ORF质粒转染K562细胞前后的生长曲线和乳酸脱氢酶活性测定观察KH-ORF对K562细胞增殖速度的影响.结果:KH-ORF在K562细胞中获得表达,对细胞增殖速度有明显影响.结论:KH-ORF表达产物可能是一个与K562细胞增殖有关的功能蛋白质,KH基因可能是一个具有生物学功能的白血病未知基因.
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K562细胞未知基因KH的开放阅读框架在大肠杆菌中的表达
目的:构建K562细胞未知基因KH的开放阅读框架(open reading flame,ORF)的原核表达体系.方法:采用DNA重组技术构建KH基因片段的开放阅读框架(KH-ORF)的表达载体pCI-neo-KH-ORF,热休克法转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导后,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达.结果:经IPTG诱导0.5h后KH-ORF在BL21(DE3)plysS中获得表达,表达产物以包涵体形式存在,分子产量约24kD.结论:成功构建了KH-ORF的原核表达体系,为进一步研究其功能奠定了基础.
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未知KL基因cDNA片段的末端快速扩增
目的:为研究白血病K562细胞中未知KL基因的结构与功能,对其cDNA片段进行全长克隆.方法:采用3种RACE策略,对未知KL基因的cDNA片段进行末端的快速扩增.结果:网上LabOnWeb的mstant RACE与传统的3'-RRACE使未知KL基因的cDNA片段向5'末端与3'末端各自延伸了156bp与350bp.结论:通过末端快速扩增,表明白血病K562细胞中未知KL基因的全长cDNA大小约为1Kb,这为我们进行该基因的全长克隆,进而研究其结构与功能奠定了基础.
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苦参碱对K562细胞骨架的作用观察
目的:从细胞骨架方面进一步探索苦参碱对人白血病K562细胞株的作用机制.方法:采用微管吮吸技术和基因芯片技术分析苦参碱处理前后K562细胞粘弹系数和细胞骨架蛋白基因表达的改变.结果:0.1mg/ml苦参碱作用K562细胞24h后粘弹系数下降,细胞骨架类基因prefoldin与ezrin的mRNA表达增强.结论:苦参碱能够导致K562细胞的细胞骨架发生变化.
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苦参碱诱导 K562 细胞分化相关 cDNA 的克隆
目的克隆苦参碱诱导人白血病K562细胞分化的相关基因,以求了解白血病细胞分化及苦参碱的作用机制.方法以人白血病细胞K562为研究对象,在苦参碱诱导其分化的基础上,利用mRNA差异显示技术对K562细胞在苦参碱诱导前及诱导后48小时的基因表达情况进行分析.结果在苦参碱诱导前后的K562细胞之间存在明显的基因表达差异,一些基因在诱导后表达增强,而一些基因经苦参碱作用后表达减弱甚至完全抑制.经克隆和筛选获得部分表达差异的cDNA片段,为进一步研究苦参碱的诱导分化机制及肿瘤细胞发生和分化机制打下了基础.结论苦参碱具有调控分化相关基因表达的作用,苦参碱诱导K562细胞分化是多基因共同参与的过程.
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氢醌HQ对K562细胞WRN基因甲基化水平及DNMT1表达的影响
目的:探讨氢醌(hydroquinone,HQ)对K562细胞中WRN基因甲基化水平及DNMT1表达的影响.方法:K562细胞生长至对数期后,设置空白对照组,低(15 μmol/L)、中(30 μmol/L)、高(60 μmol/L)剂量HQ组,重复间隔染毒72 h,空白对照组加入等量的PBS培养.MTT比色法检测细胞存活率;重亚硫酸盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测细胞WRN基因甲基化水平;FQ-PCR法检测DNMT1基因的mRNA表达情况;免疫印迹法检测DNMT1基因的蛋白表达情况.结果:①MTT结果显示,细胞存活率随着HQ染毒浓度增加而下降(P=0.000).②BSP检测结果显示,低、中、高剂量HQ组甲基化率与对照组比较,差异有统计学意义(x2=7.50,P=0.048).③与对照组比较,低、中、高剂量HQ组DNMT1基因mRNA及蛋白表达量呈下降趋势(P=0.000).结论:HQ染毒K562细胞可引起WRN基因甲基化水平增高,同时下调DNMT1基因的表达.
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人K562细胞cDNA文库的扩增、纯化、鉴定和酵母细胞转化
目的:对预转化到大肠杆菌DH5 α中的人K562细胞cDNA文库进行扩增、纯化和鉴定并将文库质粒转化酵母细胞,为下一步的靶蛋白筛选做准备.方法:对K562细胞cDNA文库进行扩增,提取文库质粒,将文库质粒转化酵母Y187细胞,并用PCR和酶切鉴定转化结果.结果:成功的扩增人K562细胞cDNA文库、并验证了文库的多样性、将文库质粒成功转化酵母Y187细胞.结论:K562细胞cDNA文库的成功扩增、纯化、鉴定,为进一步的文库筛选奠定了基础.
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survivin反义寡核苷酸对K562细胞增殖的抑制作用
目的:采用反义寡核苷酸技术研究凋亡抑制基因survivin对白血病细胞增殖的影响.方法:1.细胞抑制率实验分5组:111nmol/L反义寡核苷酸组、333nmol/L反义寡核苷酸组、555nmol/L反义寡核苷酸组、777nmol/L反义寡核苷酸组、空白组.转染后24、48、72h收集细胞进行检测:用台盼蓝染色进行活细胞计数,计算细胞抑制率.2.细胞周期及survivin蛋白表达实验分4组:555 nmol/L寡核苷酸组、544nmol/L无义组、脂质体组、空白组,转染后24、48h流式细胞仪检测细胞周期;免疫组织化学方法检测survivin蛋白水平.结果:不同浓度的反义寡核苷酸对K562细胞的细胞抑制率均高于空白组(P<0.05),并随反义寡核苷酸的浓度增大抑制率增加;随作用时间延长,抑制作用越明显,抑制率与浓度及时间呈正相关;555nmol/L反义寡核苷酸作用后,K562细胞被阻滞在G0/G1期,细胞周期进程受到明显阻滞,而无义、脂质体、空白组细胞周期进程无明显变化(P<0.05);反义寡核苷酸作用48h后survivin蛋白表达水平明显降低,与各对照组比较有显著性差异(P<0.05).结论:survivin反义寡核苷酸能抑制K562细胞的增殖.
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大黄素诱导白血病K562细胞凋亡的实验研究
目的:探讨大黄素对人白血病K562细胞的增殖抑制与诱导凋亡作用.方法:采用MTT法检测大黄素对K562细胞的增殖抑制作用;通过Wight-Giemsa染色(W-G染色),在普通光镜下观察细胞的形态学变化;运用Annexin V/PI双标记法检测大黄素对K562细胞的凋亡效应;采用流式细胞技术检测细胞周期变化与凋亡情况;通过比色法检测Caspase-3、8、9的相对活性,分析大黄素诱导K562细胞凋亡的信号途径.结果:大黄素能显著抑制K562细胞的增殖,作用24、48、72 h后的半数抑制率浓度分别为80、50、40 μmol/L;处理组细胞在普通光镜下可见典型的凋亡形态学改变;Annexin V/PI双标记法检测到K562细胞在大黄索的诱导下出现早期凋亡并呈剂量依赖性(P<0.01);流式细胞仪结果分析发现,处理组的K562细胞被阻滞于G0/G1期,与对照组相比,凋亡率明显升高并呈现剂量依赖性(P<0.01);大黄素可触发caspase-3、8、9的活性增高(P<0.01).结论:大黄素能有效地抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制和Caspase信号途径的活化有关.
关键词： 大黄素 K562细胞 细胞凋亡 半胱氨酸大冬氨酸蛋白酶 -
MicroRNA-193b对K562细胞bcr/abl表达的影响
目的 用Ad-pre-miRNA-193b重组腺病毒感染K562细胞,探讨miR-193b在细胞中过表达对bcr/abl表达的影响.方法 将前期构建的Ad-pre-miRNA-193b重组腺病毒感染K562细胞后,采用荧光定量PCR (qRT-PCR)检测miR-193b的表达;qRT-PCR检测bcr/abl融合基因的表达;Westem blot检测BCR/ABL融合蛋白的表达;CCK-8检测K562细胞的增殖情况,流式细胞术(FCM)检测K562细胞凋亡率.结果 与对照比较,K562细胞感染Ad-pre-miRNA-193b重组腺病毒后,miR-193b表达明显升高;bcr/abl融合基因及BCR/ABL融合蛋白表达明显下调;K562细胞增殖能力明显降低(P＜0.05),凋亡水平明显升高(P＜0.05).结论 miR-193b可下调bcr/abl表达,抑制K562细胞的生物学效应,过表达miR-193b能作为治疗CML的有效手段.
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K562细胞对树突状细胞线粒体功能和能量代谢状态的影响
目的 探讨共培养条件下血液肿瘤K562细胞对树突状细胞线粒体功能和能量代谢状态的影响.方法 采用免疫磁珠分离方法从健康人外周血中分离纯化出单核细胞,用细胞因子GM-CSF和IL-4将单核细胞诱导分化为未成熟DCs(immature DCs,imDCs),再利用细胞因子TNF-α进一步将imDCs诱导为成熟DCs(mature DCs,mDCs),在Transwell系统中分别将imDCs和mDCs与K562细胞共培养48 h,用流式细胞术检测K562细胞对DCs的线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度的影响,采用MTT比色法检测线粒体酶活力变化,用傅立叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)技术检测细胞能量代谢状态.对照组为正常培养和撤细胞因子培养48 h的DCs.结果 与K562细胞共培养后,和对照组DCs相比,imDCs和mDCs的线粒体膜电位下降(P＜0.05),imDCs和mDCs胞内钙离子浓度增加(P＜0.01),imDCs和mDCs的线粒体酶活力下降(P ＜0.05,P＜0.01),imDCs和mDCs的细胞能量代谢减低(P＜0.01),而正常培养组和撤细胞因子后再培养48h的DCs组相比无显著差别.结论 与K562细胞共培养后DCs的线粒体功能受到损伤,细胞能量代谢受到抑制,K562细胞可能通过损伤DCs的线粒体功能,抑制细胞能量代谢状态来损伤其迁移能力,进而损伤其免疫功能,从而使血液肿瘤细胞逃脱机体免疫监视,实现血液肿瘤细胞的增殖、扩散和转移.
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三七总皂苷抑制K562细胞mTOR信号通路活性的实验研究
目的 探讨三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)对体外培养K562细胞mTOR信号通路相关分子表达及活性的影响.方法 不同浓度的PNS(50～800 μ,g/mL)干预体外培养K562细胞24 ～ 72 h后,MTT比色法检测PNS对K562细胞增殖的抑制作用;AO/EB双荧光染色法观察细胞死亡及凋亡状况;RT-PCR检测mTOR、p70S6K、4E-BP1 mRNA表达变化;Western blot检测mTOR、p70S6K、4E-BP1及p-mTOR、p-p70S6K、p-4E-BP1蛋白表达量的变化.结果 与对照组相比,浓度为100～ 800 μg/mL的PNS能够抑制K562细胞增殖(P＜0.05),促进K562细胞凋亡及死亡(P＜0.05),PNS对K562细胞72 h的IC50为(229.07±2.36) μg/mL;100、200、400 μg/mL PNS作用于K562细胞72 h后mTOR蛋白表达量及mRNA表达量降低(P＜0.05),且磷酸化蛋白p-mTOR (Ser2448)、p-p70S6K (Thr229/389)及p-4E-BP1(Thr37/46)表达水平也随着药物浓度的增加而降低(P＜0.05).结论 PNS能够抑制K562细胞mTOR信号通路的活性,这可能是PNS抑制K562细胞增殖的机制之一.
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PTD-ABD融合蛋白对髓系白血病细胞的增殖和凋亡的影响
目的 研究癌基因BCR/ABL C末端肌动蛋白结合域(actin-binding domain,ABD)蛋白对白血病细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建含有ABD基因的重组表达载体,应用蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)将蛋白转入白血病细胞内,应用Westem blot与免疫荧光法确定蛋白是否进入白血病细胞,然后分别应用流式细胞仪及MTT法检测融合蛋白对白血病细胞凋亡及增殖的影响.结果 成功构建PTD-ABD融合表达载体,获得高纯度PTD-ABD融合蛋白.同时构建PTD表达载体并获得高纯度表达蛋白.将PTD、PTD-ABD蛋白与白血病细胞K562、HL60共培养,Westernblot与免疫荧光法确定PTD、PTD-ABD蛋白成功进入细胞内.与阴性对照比较,PTD-ABD蛋白能显著抑制HL60细胞的生长,并且对HL60细胞的凋亡具有明显的促进作用,差异具有统计学意义(P＜0.05),但对K562细胞的增殖及凋亡无影响(P＞0.05);PTD蛋白对K562、HL60细胞的增殖及凋亡无影响,与阴性对照比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 PTD转导的ABD蛋白抑制HL60细胞的增殖,并诱导细胞凋亡.
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人参皂苷Rg1抑制白血病细胞K562增殖并诱导分化的分子机制
目的 研究人参皂苷的重要单体Rg1对人白血病细胞K562的增殖抑制作用并诱导其向成熟分化的分子机制.方法 取对数生长期K562细胞,分设人参皂苷Rg1组和常规培养组,以流式细胞仪检测24、48、72 h Rg1对K562细胞增殖的影响;Wright's染色测定细胞形态和酶标仪测定血红蛋白合成来观察Rg1作用24、48、72 h后K562细胞向成熟细胞分化的特征;激光共聚焦显微镜检测Rg1作用48 h对K562细胞STAT5蛋白分布的影响;Western blot法检测Rg1作用24、48、72 h对K562细胞STAT5蛋白表达的影响.结果 流式细胞仪检测提示Rg1作用后K562细胞S期比例增加,48 h达高峰(P＜0.05);酶标仪测定显示Rg1作用后,K562细胞合成血红蛋白(Hb)的量与对照组相比具有显著性提高(P＜0.05);Wright's染色显示经Rg1诱导后,K562细胞体积缩小,细胞核直径减小,细胞核和细胞质的比例降低,细胞向成熟方向分化;激光共聚焦显微镜观察显示经Rg1诱导后,K562细胞细胞质内的STAT5荧光强度增加,而细胞核内STAT5荧光强度减弱;Western blot法检测显示Rg1作用K562细胞后,细胞质内STAT5的表达水平增加,细胞核内STAT5的表达水平减少,作用48 h变化明显.结论 人参皂苷单体Rg1可抑制人白血病细胞K562增殖并诱导其向成熟方向分化;Rg1改变K562细胞内STAT5的分布和减少K562胞核中STAT5的表达,这可能是Rg1抑制K562细胞增殖并诱导其分化的作用机制之一.
关键词： 人参总皂苷单体Rg1 K562细胞 增殖抑制 诱导分化 STAT5 -
人参多糖对K562细胞凋亡与细胞周期的影响及其机制
目的 探讨人参多糖(ginseng polysaccharide,GPS)诱导白血病细胞K562凋亡和周期阻滞的机制.方法 取对数生长期的K562细胞,调整密度为7×108/L,空白对照组予以常规培养；GPS组加入400 mg/L GPS.流式细胞仪测定细胞的凋亡率及细胞周期分布变化；RT-PCR检测细胞ERK表达的变化.免疫组化的方法检测细胞中p-ERK、NF-κB、Cyclin D1蛋白定位及表达量的变化.Western blot检测细胞中ERK、p-ERK、NF-κB、Cyclin D1蛋白的变化.结果 与对照组比较,K562细胞在400mg/L GPS的作用下,体外培养24、48、72 h后,GPS组细胞凋亡率显著增高(P＜0.05),周期分布检测结果显示,与对照组相比,GPS组K562细胞G0/G1期细胞数量呈时间依赖性增多(P＜0.05),G2+M、S期细胞数量则明显减少(P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,400 mg/L GPS处理48 h组ERK mRNA的表达水平明显低于对照组(0.20vs0.50,P＜0.05).免疫组化显示p-ERK、NF-κB、Cyclin D1主要分布在细胞核和细胞质,与对照组相比,GPS组K562细胞内p-ERK、NF-κB、Cyclin D1的表达明显减弱.Western blot检测结果显示,ERK总蛋白无明显变化(P＞0.05),而p-ERK、NF-κB、Cyclin D1随时间变化有减少趋势,且在48h减少明显,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 人参多糖GPS可促使K562细胞周期阻滞在G0/G1期,并诱导K562细胞凋亡,且均呈时间依赖性.GPS促进K562细胞凋亡、导致其细胞周期阻滞的机制可能是通过抑制ERK/NF-κB信号通路的激活,进而下调Cyclin D1来实现的.
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辛伐他汀抑制K562细胞MAPK1、cyclin D1、E2F1、c-myc mRNA的表达
目的 探讨辛伐他汀抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡的分子机制. 方法 不同浓度辛伐他汀作用K562细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况,RT-PCR测定MAPK1、cyclin D1、E2F1、c-myc mRNA表达.结果辛伐他汀能抑制K562细胞增殖,增殖抑制效应随药物浓度增加和作用时间延长而增大(P<0.05).与对照组比较,5、10、20 μmol/L辛伐他汀作用K562细胞48 h和72 h后能明显增加细胞凋亡率,差异具有统计学意义(P<0.05),表明辛伐他汀能诱导K562细胞凋亡.10、20 μmol/L辛伐他汀处理K562细胞72 h后,MAPK1、cyclin D1、E2F1 c-myc mRNA表达水平明显降低. 结论 辛伐他汀可能通过调节Ras-MAPK途径抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡.
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稳定过表达Wnt5a对K562细胞生物学性状的影响
目的 构建稳定过表达Wnt5a的K562细胞株,并观察稳定过表达Wnt5a对K562细胞牛物学性状的影响.方法 构建质粒pSEB-Wnt5a;包装得到含有逆转录病毒的上清,感染K562细胞,筛选出感染成功的细胞;Western blot检测蛋白的表达;细胞计数、瑞氏染色、透射电子显微镜观察对细胞生物学性状的影响.结果 成功构建了质粒pSEB-Wnt5a;筛选得到了感染成功的细胞;感染pSEB-Wnt5a逆转录病毒的K562细胞Wnt5a蛋白表达水平明显高于感染空病毒载体的细胞;与K562-vector细胞相比,K562-Wnt5a细胞的增殖被明显抑制,并出现了向成熟分化的形态学特征.结论 成功构建了稳定过表达Wnt5a的K562细胞株;稳定过表达Wnt5a抑制K562细胞增殖并可以促进其向成熟分化,提示Wnt5a在白血病发生中可能起到抑癌基因的作用.
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Livin siRNA重组腺病毒的构建及其对K562细胞增殖、凋亡和耐药的影响
目的 通过改良的重组腺病毒介导方法 研究Livin基因与K562细胞增殖、凋亡及耐药的关系.方法 用基因工程技术将靶向Livin siRNA片段克隆至穿梭质粒pSES-HUS中,然后与骨架质粒pAdeasy同源重组,将重组成功的质粒用脂质体介导的方法 转染HEK293细胞,乒乓感染收获高滴度的重组腺病毒AdS-Livin siRNA,并将其感染K562细胞,采用Real-time PCR、Western blot检测Livin基因的干扰效果,用MTT和流式细胞仪检测其与K562细胞增殖、凋亡及多药耐药的关系.结果 成功构建重组腺病毒Ad5-Livin siRNA,并感染K562细胞,在mRNA和蛋白2个水平均抑制Livin的表达.证实通过重组腺病毒沉默Livin基因,可抑制K562细胞增殖,促进凋亡,增加其对阿霉素、长春新碱和依托泊苷的敏感性.结论 用重组腺病毒介导的方法 抑制K562细胞中Livin基因的表达,可增加K562细胞的凋亡及对抗癌药物的敏感性.Livin可能成为治疗白血病新的分子靶点.
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K562细胞survivin基因表达对淋巴细胞增殖和功能的影响
目的 探讨K562细胞中survivin 基因的表达对淋巴细胞增殖和功能的影响.方法 将融合重组质粒pEGFP-C1-survivin 和靶向survivin基因的RNAi的重组质粒pTZU6+1-survivin分别转染K562细胞,得到K562/survivin+和 K562/survivin- 2种细胞,用G418筛选K562/survivin+细胞,用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法及免疫细胞化学法检测K562/survivin+和K562/survivin- 2种细胞中survivin mRNA及蛋白水平的表达,并与K562细胞作对照.将这3种细胞与健康人外周血单个核细胞(PBMC)混合培养(MLTC),检测混合培养体系中淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性及培养上清中IFN-γ水平.结果 K562/survivin+组的淋巴细胞增殖指数明显低于其余两组.survivin基因的表达水平与NK细胞活性呈负相关.混合培养上清中分泌的IFN-γ,K562/survivin+组是K562组的1/4.5,是K562/survivin-组的1/8.结论 高表达的survivin可以抑制淋巴细胞的增殖、NK细胞活性及IFN-γ的分泌.
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RNA干扰survivin基因对K562细胞化疗敏感性的影响及机制
目的 应用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制survivin基因的表达,观察其对K562细胞化疗敏感性的影响,为临床白血病治疗提供理论依据.方法 实验分为RNA干扰组、脂质体对照组、空白对照组.转染48 h后用RT-PCR法,免疫组化法分别检测survivin在mRNA及蛋白水平的表达;MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性;流式细胞仪检测细胞内阿霉素的药物浓度;免疫组化法检测K562细胞中3种耐药相关蛋白P-gp、TOPO-2、GST-π的表达.结果 ①RNA干扰组K562细胞的survivin基因表达水平明显下降;②RNA干扰组K562细胞对阿霉素敏感性增高;③RNA干扰组K562细胞中阿霉素浓度增高;④RNA干扰组K562细胞耐药蛋白GST-π表达水平下降, 而P-gp,TOPO-2的表达与对照组比较无显著差异.结论 特异性siRNA能够有效抑制survivin基因的表达,并可能通过降低耐药蛋白GST-π的表达增加K562细胞对阿霉素的敏感性.
