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单核细胞影响NK细胞抗K562细胞活性的实验研究
目的 探讨单核细胞(MO)呼吸爆发过程中产生的反应性氮代谢物(RNM)、反应性氧代谢物(ROM)的情况及其对NK细胞抗K562细胞活性的影响.方法 在NK+K562混合细胞培养体系中,观察加入MO或/和IL-2/PHA前后RNM、ROM产量、KIR及TNF-β、IFN-γ产量的相应变化.再观察加入氢氯组胺、硫普罗宁后上述各指标的变化情况.结果 ①在NK+K562混合培养体系中,加入IL-2/PHA后,KIR逐渐升高;当按E/MO=10/2、10/5、10/10比例加入MO后,RNM、ROM产量随着MO数量的增加而增加,而TNF-β、IFN-γ的产量和KIR反而降低.对K562细胞数量作偏相关分析,RNM与KIR的负相关系数大于ROM.②加入药物后,ROM产量明显下降,KIR和TNF-β、IFN-γ产量明显升高,硫普罗宁还降低RNM的产量,但二氢氯组胺无效.结论 ①MO可通过产生ROM、RNM降低NK细胞的活性,抑制NK细胞抗K562细胞效应;②RNM对NK细胞的影响可能比ROM更强.③硫普罗宁通过清除ROM、RNM,可逆转MO对NK细胞的抑制作用.
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P53基因对K562细胞增殖的影响
目的观察恢复K562细胞的p53蛋白功能后该细胞的生物学行为的改变,探索用野生型p53基因治疗白血病的可能性.方法以K562细胞为研究对象,电穿孔法转导野生型p53基因,RT-PCR和免疫细胞化学方法检测p53基因的表达,3H-TdR掺入法检测细胞增殖,用流式细胞仪分别以TUNEL、annexin-V、细胞周期检测细胞的凋亡情况和细胞周期分布情况.结果转染p53基因的K562细胞,出现明显细胞周期G1期停滞,增殖抑制率为24.17%,但用TUNEL、annexin-V和亚二倍体峰检测未发现与未转染p53基因组有凋亡细胞比例差异.结论P53基因对K562细胞有一定的治疗效应,但不能诱导其发生凋亡.
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ALA-PDT对K562、HL60细胞株破坏的实验研究
探讨基于氨乙酰丙酸介导的光动力作用(ALA-PDT)对白血病细胞株HL60和K562细胞的杀伤模式及其可能机制.在ALA-PDT处理细胞的优化条件下,用透射电镜对处理细胞进行超微结构观察,选择Annexin VFITC/PI双标法明确ALA-PDT对两种白血病细胞的杀伤模式,PI染色流式细胞仪分析ALA-PDT后细胞周期的变化,以Fluo-3/AM为钙离子指示剂采用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度的变化.透射电镜观察发现PDT后即刻的细胞呈现典型的凋亡小体,24 h后大部分发生坏死;双标法检测显示PDT后即刻及24 h后细胞的死亡模式分别以凋亡和凋亡后坏死为主.光动力作用后即刻和作用后2 h,K562细胞S期所占的比例分别为57.67%±1.13%和84.77%±6.20%,HL60细胞S期所占的比例分别为74.6%±7.27%和84.60%±1.74%;两种细胞内钙离子浓度的均明显升高.在佳试验条件下,凋亡是ALA-PDT杀伤白血病细胞K562和HL60细胞的初模式,而凋亡后坏死为其主要模式,ALA-PDT使白血病细胞株阻滞于S期,在白血病细胞株死亡的过程中,细胞内钙离子浓度的增加可能起着重要的作用.
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二氢青蒿素对K562细胞BCR/ABL融合基因表达的影响及意义
目的 探讨二氢青蒿素( dihydroartemisinin,DHA)对白血病细胞K562 BCR/ABL融合基因表达的影响及意义.方法 采用噻唑蓝比色方法检测不同浓度的DHA对于K562细胞的增殖抑制作用,并计算不同培养时间点的抑制率.用逆转录PCR检测K562细胞处理前后BCR/ABL融合基因的表达变化,流式细胞仪检测K562细胞的凋亡情况.结果 DHA(10～160 μmol/L)能抑制K562细胞的增殖,随着浓度增加抑制作用明显增强,培养24 h后抑制率从52.76％增加到94.65％;用浓度为20μmol/L的DHA对K562细胞作用12～48 h后,逆转录PCR检测BCR/ABL融合基因表达,△Ct值为4.45±0.25和5.23±0.21.与对照组(4.23±0.21)相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 DHA可通过影响BCR/ABL融合基因的表达抑制K562细胞的增殖.这可能是导致K562细胞凋亡的原因之一.
关键词： 二氢青蒿素 白血病 K562细胞 Bcr/abl融合基因 -
K562细胞VEGF基因表达下调后的基因表达谱改变
目的探讨血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)基因VEGF表达下调对白血病K562细胞株基因表达谱的影响.方法采用脂质体介导的方法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ转染白血病细胞株K562、G418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组DNA,用PCR方法验证核酶基因已转入K562细胞;荧光定量PCR和免疫印迹反应检测白血病细胞中VEGF mRNA和蛋白表达量的改变;应用cDNA微阵列技术检测VEGF基因表达下调对白血病K562细胞株基因表达谱的影响.并用逆转录PCR验证PCNA、GSN基因的表达改变.结果抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ转入白血病细胞株K562、G418筛选两周获得阳性克隆,PCR检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组DNA;与K562及K562/PC细胞(转染空质粒的K562细胞)相比,转染VEGF核酶基因的K562/RZ细胞VEGFmRNA和蛋白的表达量明显降低,芯片中共有表达差异的基因191条,包括周期相关基因、细胞凋亡相关基因、癌基因以及细胞信号和传递蛋白等基因,其中104条表达下调,87条表达上调.逆转录PCR证实GSN基因表达上调,PCNA基因表达下调.结论 VEGF基因表达下调能引起白血病K562细胞株基因表达谱的改变,这些基因的改变可能对白血病细胞增殖、分化和凋亡等生物学行为产生了一定的影响.
关键词： K562细胞 血管内皮细胞生长因子 发夹状核酶基因 基因芯片 -
联合培养法优化K562细胞红系诱导分化及红系相关基因和膜蛋白表达分析
目的 优化K562细胞体外红系诱导分化条件,分析红系相关基因和膜蛋白的表达,探讨K562细胞的分化潜能.方法 采用红系诱导联合培养法,优化诱导试剂丁酸钠、红细胞生成素、氯化高铁血红素等成分组合和剂量组合.诱导效率鉴定指标选用红系ALAS mRNA和粒系bcr/abl mRNA表达丰度分析、细胞形态学观察、联苯胺染色阳性率计数.红系分化进一步鉴定指标选用Realtime-PCR检测10种红系分化相关基因的表达;流式细胞术测定红系细胞膜标志物.结果 优化红系诱导组合联合培养K562细胞120 h后,联苯胺染色计数阳性细胞可达100%.Realtime-PCR检测Spectrina、Spectrinβ、band3、eALAS、CD47、RhD、EPB4.2的mRNA水平分别为对照组的8.05、14.58、22.87、14.52、26.53、3.48、1.94倍,而ber/abl mRNA水平为对照组的0.39倍.流式细胞术测定红系膜蛋白CD47,band3、RhD水平明显增高(P<0.01),GPA无明显差异.结论优化组合体外红系诱导分化法可使K562细胞稳定向红系分化,良好细胞状态利于转外源基因操作,进行红系统疾病研究.RhD比GPA更早在红系细胞表达,可作为早期红系特异标记.
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残留冻存保护剂对慢性髓系白血病细胞株K562生存的影响
目的 研究冻存保护剂甘油、二甲亚砜(DMSO)、乙二醇和丙二醇对细胞生长的抑制作用.方法 常规进行细胞培养后,用台盼蓝拒染法、MTT法和流式细胞术检测不同浓度的冻存保护剂对慢性髓系血病K562细胞的生长抑制作用.结果 四种冻存保护剂终浓度为3%时,均会明显抑制K562细胞的生存;终浓度为1%的甘油和1%的DMSO对细胞的增殖无影响,其中甘油的安全性高于DMSO;而终浓度为0.5%的丙二醇会影响细胞的生存.结论 少量冻存保护剂残留可能影响K562细胞的生存,四种冻存保护剂中对细胞生长影响小的是甘油.
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全反式维甲酸对K562细胞的诱导分化及c-myc基因表达的抑制
目的观察ATRA对K562细胞的诱导分化作用,探讨c-myc基因表达与诱导分化的关系及可能的作用机制.方法采用形态学观察、流式细胞术及RT-PCR方法,检测K562细胞的诱导分化特征及c-myc基因的表达.结果ATRA诱导K562细胞向粒系分化的同时,伴有c-myc基因mRNA水平表达下降.结论ATRA可通过下调c-myc基因表达而诱导K562细胞向粒系成熟方向分化.
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人红白血病K562细胞的红系终末分化研究
人红白血病K562细胞是一株恶性程度较高的人红白血病体外细胞系,但在体外可被多种诱导剂诱导向红系终末分化,出现红系表征:停止分裂、表达珠蛋白基因产物、核固缩直至自然排核,因此己成为体外研究肿瘤细胞恶性表达调控的良好模型.本文就K562细胞红系分化的机制和研究进展作一综述.
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红白血病诊治及预后的进展
红白血病是一种少见的异质性血液系统恶性肿瘤,可同时累及多个细胞系.形态学上,根据原始粒细胞及原始红细胞所占百分比不同可分为3种临床亚型:M6a、M6b和M6c.不同亚型的红白血病的平均生存时间、对化疗的敏感性以及临床预后均有所不同,本文将就此作一论述,并对近年来红白血病耐药机制方面的研究做一综述.
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K562细胞RNA负载人树突状细胞后体外诱导特异性CTL的研究
目的探讨人的树突状细胞(dendritic cell, DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL).方法自健康人浓缩白细胞制品(白膜)分离有粘附特性的单核细胞(PBMC),经GM-CSF、IL-4培养5d后,获得未成熟的DC(imature DC,imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA.抽提转染前后以及转染24h后的DC内RNA 进行RT-PCR检测,Western-blot分析p210蛋白表达,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等.PBMC以每组5×106/ml,分别在不同组分的培养液中培养DC,通过细胞计数、流式细胞仪测定CD1a表达、细胞纯度来估计制备效果.结果 RT-PCR检测表明:DC经K562总RNA转染后,细胞内出现Bcr-Abl的cDNA条带,24h后消失.Western-blot试验表明:转染24h后,开始表达p210特征性蛋白;并且明显促进T细胞对K562的杀伤活性.1%自体血浆体积分数RPMI 1640培养的DC的CD1a表达量高,并且细胞获得数量也仅屈居第二,为总体评价较高的一组.结论应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗具有可行性,预示改良的DC疫苗抗肿瘤的广泛应用前景.
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表达人ABO* A1.01等位基因的K562细胞稳定株的构建
目的 构建稳定表达人ABO* A1.01等位基因的K562细胞株.方法 在载体GV492(Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin)基础上构建ABO* A1.01等位基因蛋白质编码区(coding sequence,CDS)全长重组质粒GV492-A,将慢病毒重组载体、2种慢病毒包装载体pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞做病毒包装;将重组慢病毒感染人慢性髓细胞白血病K562细胞,用嘌呤霉素筛选得到K562-A稳定株,荧光显微镜下观察K562-A稳定株;qPCR检测K562-A稳定株中ABO等位基因mRNA表达水平;对稳定株中的ABO等位基因测序;用流式细胞术检测稳定株细胞表面A抗原的表达情况.结果 重组载体测序结果证实成功构建了ABO*A1.01等位基因重组表达载体;包装慢病毒的滴度适中:ABO*A1.01等位基因重组慢病毒为1.5E+9 TU/mL,载体GV492对照慢病毒为5.0E+8 TU/mL,说明重组慢病毒包装成功.重组慢病毒载体感染K562细胞后,得到稳定感染细胞株.K562-A稳定株的qPCR检测显示ABO等位基因的mRNA表达水平明显升高(P＜0.01),GFP荧光蛋白阳性率＞98％,ABO等位基因测序证实ABO* A1.01等位基因在细胞内成功转录,流式检测显示细胞表面表达A抗原.结论 成功构建表达ABO*A1.01等位基因的K562-A细胞稳定株,细胞表面表达A抗原.
关键词： K562细胞 ABO*A1.01等位基因 慢病毒载体 A抗原 -
羟基磷灰石纳米粒子对人白血病细胞K562毒性作用的研究
目的:探讨羟基磷灰石(HAP)纳米粒子体外抑制人白血病细胞K562的生长增殖作用.方法:采用MTT法检测HAP和联合应用化疗药物对K562细胞的增殖抑制及化疗增敏作用.结果:(1)HAP和抗癌药物对K562细胞增殖均有抑制作用;(2)K562细胞生长抑制率与HAP的浓度和作用时间呈明显正相关性;(3)HAP与化疗药物合用具有更良好的抑癌效果.结论:HAP纳米粒子明显抑制K562细胞生长,具有体外抗白血病作用和化疗增敏作用.
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载As2O3白蛋白纳米粒对人K562细胞的增殖抑制作用
目的 采用白蛋白纳米粒包载As2O3,通过肿瘤细胞摄取载药纳米粒来增强As2O3对K562细胞的增殖抑制作用.方法 采用去溶剂化法制备白蛋白纳米粒(ALB-NP),以异硫氰酸(FTTC)标记ALB-NP,荧光显微镜观察K562细胞对ALB-NP的摄取；以ALB-NP包载As2O3制备载As2O3白蛋白纳米粒(As2O3-ALB-NP),MTr法比较As2O3与As2O3-ALB-NP对K562细胞增殖抑制率的差异.结果 As2O3-ALB-NP在低浓度(＜0.8 μmol·L-1)即可显著抑制K562细胞增殖,而As2O3在该浓度对其无抑制作用.结论 与As2O3相比,利用ALB-NP载As2O3可显著增强其对K562细胞的增殖抑制作用,有望实现对As2O3用药的增效减毒,为其用于抗肿瘤治疗提供了新的给药策略.
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丹参酮ⅡA与丹参酮ⅡA磺酸钠对 K562细胞的增殖抑制与诱导分化作用
目的 比较丹参酮ⅡA与丹参酮ⅡA磺酸钠对人白血病K562细胞的体外增殖抑制与诱导分化作用.方法 采用改良MTT法测定两种药物对K562细胞的增殖抑制作用,倒置显微镜下观察其对K562细胞形态的影响,以硝基四氮唑蓝还原试验法,用流式细胞仪测定细胞膜表面的分化抗原CD33和CD11 b,观察丹参酮ⅡA与丹参酮ⅡA磺酸钠对K562细胞的诱导分化作用.结果 3.4～13.6 μmol·L-1丹参酮ⅡA对K562细胞有显著的增殖抑制作用,且呈时间和剂量依赖性;丹参酮ⅡA对K562具有诱导分化作用,表现为NBT还原能力增强,CD33表达下降,CD11b表达升高.丹参酮ⅡA磺酸钠对K562细胞无增殖抑制与诱导分化的作用.结论 丹参酮ⅡA对K562细胞具有增殖抑制与诱导分化作用,磺酰化后其药理活性丧失.
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龟板、黄芪、丹参、党参上调K562细胞Gγ-珠蛋白mRNA的表达
目的 研究龟板、黄芪、丹参、党参在体外对K562细胞Gγ-珠蛋白mRNA表达的上调作用.方法 以K562细胞为体外模型,应用荧光定量RT-PCR技术研究药物诱导后Gγ-珠蛋白基因mRNA表达水平的变化.结果 龟板、黄芪、丹参、党参作用K562细胞5 d后,Gγ-珠蛋白mRNA的表达增加(高达3.7倍).与丁酸钠组比较,黄芪组诱导K562细胞Gγ-珠蛋白基因mRNA的表达可持续3-5 d,而丁酸钠组仅1 d.结论 龟板、黄芪、丹参、党参有望成为一种有效的γ蛋白基因诱导剂.
关键词： 龟板、黄芪、丹参、党参 K562细胞 Gγ-mRNA -
三氧化二砷诱导K562细胞凋亡过程中血管内皮因子的变化
目的 通过观察三氧化二砷(As2O3)对人类慢性髓系白血病(CML)细胞株K562细胞的作用.探讨其治疗CML的作用机制.方法 将K562细胞与不同浓度As2O3共同孵育,于24、48、72 h用MTT方法检测K562细胞存活率,用AnnexinV-FITC检测凋亡细胞,同时用酶联免疫吸附法(ELISA)检测K562细胞上清液中血管内皮因子(VEGF)的浓度.结果 As2O3＜2 μmol·L-1时,对K562细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用与空白对照组比较,无统计学意义(P＞0.05);As2O3＞2 μmol·L-1时则具统计学意义(P＜0.05);在相同作用时间下,AS2O3 浓度升高对K562细胞的增殖抑制率及细胞凋亡率亦升高;当As2O3＞8 μmol·L-1时,对K562细胞的抑制及细胞凋亡率不再上升. As2O3＜2 μmol·L-1时上清液中VEGF浓度与空白对照组比较无显著性(P＞0.05);As2O3＞2 μmol·L-1时VEGF的浓度差异有显著性(P＜0.05),且随As2O3 浓度的增加VEGF浓度上升;当As2O3＞8 μmol·L-1时则变化不显著(P＞0.05).结论 As2O3可抑制K562细胞增殖,并具诱导凋亡作用, As2O3在2.0～10.0 μmol·L-1梯度浓度,作用在24～72 h时段,表现为时间和剂量依赖性,还可下调VEGF表达水平.
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MTX-右旋糖酐偶联物的合成及其对K562细胞的敏感性初探
用溴化氰活化右旋糖酐(T-77)后,通过6-氨基己酸间隔桥,用水溶性碳二亚胺(EDC)法将抗癌药甲胺喋呤(MTX)与糖基相偶联,合成MTX-右旋糖酐偶联物(MTX-D).应用细胞凋亡荧光染色(AFS)法检测该偶联物MTX-D对人白血癌K562细胞的敏感性,结果该偶联物对K562细胞凋亡有诱导作用和影响其生长周期的作用.
关键词： MTX-右旋糖酐偶联物 合成 K562细胞 细胞凋亡 生长周期 -
全反式维甲酸诱导K562细胞分化过程中线粒体铁蛋白表达的研究
目的 研究K562白血病细胞在全反式维甲酸(ATRA)诱导分化过程中线粒体铁蛋白(MtF)、运铁蛋白受体1(TfR1)和铁蛋白(Fn)mRNA表达水平的变化情况,探讨MtF在白血病细胞增殖和铁代谢方面的作用.方法 K562细胞加入ATRA(终浓度1 μmol/L)中诱导培养,分别于第1、3、5 d收集细胞,分别进行:①瑞士染色观察各时间点的细胞形态;流式细胞学检测细胞表面分化抗原CD13的表达;②Trizol法提取各时间点细胞的RNA,通过半定量RT-PCR方法 检测各时点MtF、TfR1和Fn基因的表达水平.同时设未用ATRA诱导培养的K562细胞为对照组.结果 1 μmol/L的ATRA可诱导K562细胞向粒系细胞分化,诱导培养第5 d,细胞表面CD13的表达水平增加,诱导分化率为21.2%,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).诱导分化前K562细胞即有MtF mRNA表达,但随细胞诱导时间的延长,MtF和TfR1 mRNA表达呈下降趋势,诱导分化第5 d的表达水平分别为诱导分化前的86.5%和79.2%;而Fn mRNA的表达呈上调趋势,诱导分化第5 d表达水平为诱导分化前的1.21倍.结论 ATRA诱导K562细胞向粒系细胞分化过程中,MtF和TfR1 mRNA表达下调,而Fn mRNA表达上调,这种协调变化有助于降低细胞通过TfR1介导的铁摄取,从而抑制或影响细胞增殖潜能.
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Survivin反义寡核苷酸对K562细胞耐药性的影响
目的 探讨Survivin反义寡核苷酸(antisense oligodeoxg nucleotide,ASODN)与传统化疗药物对白血病K562细胞耐药性的影响.方法 实验分为反义核苷酸组(ASODN)、无义核苷酸组(SODN)、脂质体组(Lip)、空白对照组,以脂质体转染Survivin ASODN,用RT-PCR检验SurvivinmRNA表达;用MTT法检测K562细胞对阿霉素(driacin,ADM)、柔红霉索(daunorubicin.DAM)及联合用ASODN耐药性;用流式细胞仪检测单独用ADM、DAM和联合用ASODN时K562细胞内ADM和DAM的浓度.结果 ASODN组Survivin mRNA表达较对照组降低(P<0.05);ADM和ASODN+ADM对K562细胞的半数抑制细胞(IC50)分别为0.5457 mg/L和0.1933 mg/L,DAM和ASODN+DAM对K562细胞的IC5.分别为0.5408 mg/L和0.2027 mg/L,联合用药组ICso低于单用药组(P<0.05);用ADM和ASODN+ADM时K562细胞内药物的荧光强度分别为51.64、89.92,DAM和ASODN+DAM时K562细胞内药物的荧光强度分别为63.71、88.47,联合用药组细胞内药物浓度高于单用药组(P<0.05).结论 Survivin反义寡核苷酸可下调K562细胞Survivin mRNA的表达;Survivin反义寡核苷酸与阿霉素和柔红霉索联合作用可提高K562细胞内药物浓度,降低细胞生存率,降低细胞耐药性.
