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外源性Wnt5a激活K562细胞非经典Wnt5a/Ca2+信号途径研究
目的 观察外源性Wat5a对K562细胞非经典WntSa/Ca2+途径的影响,进一步研究外源性Wnt5a诱导K562细胞的分化机制.方法 激光共聚焦显微镜观察Ca2+内流的变化,以RT-PCR及免疫组化检测β-catenin的表达变化,以Western blot检测cyclin D1的表达变化.结果 外源性Wnt5a能明显促进K562细胞Ca2+内流,显著下调cyclin D1表达,且能下调K562细胞β-catenin表达,但β-catenin表达下调无统计学意义.结论 外源性Wnt5a能激活K562细胞非经典Wnt5a/Ca2+途径,外源性Wnt5a诱导K562细胞分化机制可能与此相关.
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RNAi重组体抑制白血病K562细胞系中NPM1基因的表达
目的 构建核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin1,NPM1)特异性的RNAi真核表达载体,观察对白血病K562细胞系NPM1表达的抑制作用.方法 采用RT-PCR检测白血病细胞系(THP1和K562)和急性髓系白血病(AML)细胞NPM1 mRNA水平.设计合成2条针对NPM1基因并具有小发夹结构的DNA序列,经退火形成互补双链.再克隆至载体pGenSil-1中构建含NPM1的RNAi重组体,经酶切及测序鉴定后通过脂质体转染K562细胞,同时设立pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组.采用RT-PCR检测各组转染细胞中NPM1的mRNA水平.结果 白血病细胞系和AML细胞均高表达NPM1 mRNA.针对人NPM1基因的RNAi重组体构建成功,并能够稳定转染K562细胞,导致白血病细胞NPM1 mRNA相对表达量下降64%,而pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组未能下调NPM1表达.结论 白血病细胞高表达NPM1基因,其mRNA表达水平能够被靶向NPM1的RNAi重组体特异性地下调.
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孤儿受体ROR2诱导慢性髓细胞白血病细胞株K562凋亡的研究
目的 研究ROR2抑制慢性髓细胞白血病细胞株K562增殖并诱导其凋亡的作用,初步探讨可能的机制.方法 采用重组ROR2腺病毒(AdROR2)感染K562细胞为实验组,重组RFP腺病毒(AdRFP)感染K562细胞为对照组.采用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化和细胞凋亡.Western blot检测实验组和对照组促凋亡基因caspase3和抗凋亡基因survivin的表达.结果 与对照组比较,实验组ROR2感染K562细胞48 h后,细胞增殖明显受抑(P＜0.05),细胞周期主要阻滞在G2/M期(P＜0.05),细胞凋亡增多,48 h凋亡显著(P＜0.05),同时促凋亡蛋白caspase3表达升高(P＜0.05),抗凋亡蛋白survivin表达下降(P＜0.05).结论 过表达ROR2能够抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制可能与上调了促凋亡蛋白caspase3和下调了抗凋亡蛋白survivin表达有关.
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P53途径在辛伐他汀诱导K562细胞凋亡中的作用
目的 探讨辛伐他汀处理后的P53通路和细胞周期的分子水平变化,以说明P53途径在辛伐他汀抑制K562细胞增殖和诱导细胞凋亡中的作用.方法 体外培养和用辛伐他汀处理K562细胞,用流式细胞仪检测辛伐他汀作用后的细胞周期和凋亡率的变化,用RT-PCR检测P53通路和细胞周期相关基因的变化.采用免疫组化LDP法检测P21蛋白变化的水平.结果 辛伐他汀能使K562细胞停滞在G0/G1期,明显诱导K562细胞凋亡,大多数P53通路基因和细胞周期相关基因出现差异表达.P21蛋白随药物作用时间的延长,表达上调.结论 P53通路可能在辛伐他汀诱导的K562细胞增殖抑制和凋亡发生的过程中起重要作用.
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Wnt5a与髓细胞白血病发生关系的研究
目的 观察Wnt5a在髓细胞白血病中的表达以及外源性Wnt5a对K562细胞生长的影响.方法 RT-PCR检测5例急性髓细胞白血病、6例慢性髓细胞白血病外周血或骨髓标本及白血病细胞系中Wnt5a的表达.用AdWnt5a和AdGFP腺病毒转染CHO细胞制备的条件培养液分别处理K562细胞1～5 d,采用细胞计数、台盼蓝染色、细胞形态等方法观察Wnt5a对K562细胞生长影响.结果 6例慢性髓细胞白血病均未表达Wnt5a,5例急性髓细胞白血病中4例不表达或弱表达,仅1例完全缓解的病人高表达Wnt5a.K562、HL-60细胞中Wnt5a也不表达,Jurkat细胞高表达.以GFP条件培养液处理细胞为对照,Wnt5a条件培养液处理K562细胞生长明显受到抑制,但未影响细胞的存活率.与对照相比细胞形态上出现了分化的表型.结论 Wnt5a在急慢性髓细胞白血病外周血或骨髓中以及髓系白血病细胞株中均表达缺失或降低,并且外源性的Wnt5a可抑制K562细胞生长并有诱导其分化的现象,提示Wnt5a的表达下调可能与髓细胞白血病的发生有关.
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辛伐他汀对K562细胞PI3K-AKT信号通路分子变化影响的体内外比较
目的 通过检测辛伐他汀体外对K562细胞和裸鼠慢性粒细胞白血病组织(CML)K562细胞的影响,同时分别检测辛伐他汀处理后K562细胞PI3K-AKT信号通路中 mRNA水平的变化,比较辛伐他汀在体内外所引起PI3K-AKT信号通路的分子变化,以分析辛伐他汀诱导K562细胞凋亡的机制.方法 体外培养CML 细胞株K562细胞,MTT噻唑蓝法检测细胞增殖抑制率.流式细胞术检测辛伐他汀作用后的细胞周期和凋亡率的变化.另外,12只BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下接种K562细胞,构建Balb/c-nu/nu裸小鼠的慢性粒细胞白血病动物模型,采用缺口末端标记技术TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)法检测辛伐他汀诱导K562细胞早期凋亡的变化,用RT-PCR检测辛伐他汀在体内外K562细胞后N-ras分子和N-ras分子下游的PI3K-AKT信号通路的N-ras、PI3K、AKT1、IKK-β、NF-κB1 mRNA水平的变化.结果 辛伐他汀在体外能抑制K562细胞的增殖,使K562细胞停滞在G0/G1期,明显诱导K562细胞凋亡,PI3K-AKT信号通路大多数基因出现差异表达.不同剂量的辛伐他汀能够诱导裸鼠体内K562细胞凋亡,并随剂量的增加凋亡率逐渐增高(P=0.000 );不同剂量的辛伐他汀能够引起PI3K、AKT1、NF-κB、IKK-β mRNA的明显差异表达(P=0.000,P=0.003).但体外实验中的PI3K-AKT信号PI3K、AKT1 mRNA水平的变化与体外实验PI3K、AKT1 mRNA水平的变化呈现相反的差异表达.结论 辛伐他汀体外能够引起参与K562细胞凋亡的N-ras分子和N-ras分子下游的PI3K-AKT信号通路的基因 mRNA水平的变化,从一定角度说明辛伐他汀能依赖PI3K-AKT信号通路诱导K562细胞及其移植瘤细胞凋亡.但体内外实验存在不同的凋亡诱导机制.
关键词： 辛伐他汀 K562细胞 PI3K-Akt信号通路 体内实验 体外实验 -
青蒿琥酯对K562细胞和脐血CD34+造血干/祖细胞的选择性作用
目的 探讨青蒿琥酯(artesunate, AST)对K562细胞和正常造血干/祖细胞是否具有选择性作用.方法 选用K562细胞及脐血CD34+造血干/祖细胞,加入不同浓度AST.MTT法检测药物对上述两种细胞增殖的影响;甲基纤维素半固体培养法考察AST对其体外扩增和多向分化能力的影响;以流式细胞术Annexin V-FITC-PI双染定量检测细胞凋亡率;Western blot方法检测BCR-ABL融合蛋白的表达.结果 青蒿琥酯对K562细胞有明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用(P＜0.01),并存在时效和量效关系,对集落抑制作用明显(P＜0.01).青蒿琥酯在12.5～25 μg/ml作用48 h对脐血CD34+造血干/祖细胞增殖抑制作用和诱导凋亡作用不明显(P＞0.05),对集落生成亦无明显抑制作用(P＞0.05).经青蒿琥酯作用48 h,K562细胞BCR-ABL蛋白以剂量依赖方式被降解(P＜0.01). 结论 青蒿琥酯在一定浓度范围内对K562细胞具有选择性抑制增殖和诱导凋亡的作用,对脐血CD34+造血干/祖细胞影响较小.
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靶向阻断STAT5对白血病K562细胞周期的影响
目的通过应用诱骗寡核苷酸(Decoy ODNs)抑制信号转导因子和转录激活因子5(signal transducers and activators of transcription 5, STAT5)信号转导途径,观察对白血病K562细胞细胞周期的影响,初步探讨其中的分子机制.方法体外设计合成STAT5 Decoy ODNs,在脂质体的介导下转染K562细胞,FCM检测细胞周期,用RT-PCR和Western blot方法检测STAT5下游基因细胞周期素D1 (cyclin D1)和c-myc的表达.结果 Decoy ODNs作用K562细胞24 h后的细胞周期显示,S期细胞由(48.71±5.42)%减低为 (31.94±2.35)%,G0/G1期细胞由 (40.83±5.20)%增加为 (61.39±2.18)%;而错配寡核苷酸(mutant ODNs)对细胞周期没有明显影响.RT-PCR实验和Western blot实验证实Decoy ODNs作用引起STAT5下游基因cyclin D1和c-myc mRNA和蛋白表达下调.结论 STAT5 Decoy ODNs能抑制细胞G1/S转换而影响细胞周期进程,其作用机制可能与Decoy ODNs下调STAT5下游cyclin D1和c-myc基因的表达有关.
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血管内皮生长因子及其Flt-1受体在白血病细胞中的表达
目的探讨人白血病细胞系血管内皮生长因子(VEGF)及其Fh-1受体的表达,进一步阐明VEGF在白血病细胞异常增殖中的作用机制.方法以人脐静脉血管内皮细胞系ECV304作为对照,采用RT-PCR半定量技术和免疫组化检测体外培养的人白血病细胞系K562和HL-60中VEGF及Flt-1的表达.采用MTT试验观察VEGF反义寡核苷酸(VEGF-AS)对白血病细胞体外增殖的影响.结果K562和HL-60细胞同时表达VEGF和Fh-1 mRNA和蛋白.VEGF-AS能够抑制白血病细胞体外增殖.结论在白血病细胞异常增殖中自分泌VEGF可能起着重要作用.
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K562细胞影响BMSCs生长及MIP-1α表达的实验研究
目的研究K562细胞在与正常骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)接触和隔离培养条件下对BMSCs生长特性及造血负调因子MIP-1α表达的影响.方法加入K562细胞与BMSCs直接接触与用隔离膜两种方式培养,第2、4、7、12天观察BMSCs生长增殖情况;检测培养上清的MIP-1α含量和BMSCs中MIP-1αmRNA的表达;TUNEL法检测BMSCs的凋亡.结果加入K562细胞培养后BMSCs在第12天时数量显著减少;接触培养BMSCs的凋亡在第4天后显著高于对照组(P＜0.01);MIP-1α水平升高到4 d与对照组有显著差异(P＜0.01);BMSCs胞浆MIP-1αmRNA阳性率升高到第4天后与对照组有显著差异(P＜0.01).结论 K562细胞可抑制正常BMSCs生长,促进其凋亡,上调其MIP-1α的表达,可能是造成正常造血的抑制和白血病细胞导致造血微环境损伤的主要原因之一.
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低氧和缺氧诱导因子-1α对人白血病细胞株K562细胞血管相关生成因子的影响
目的 观察低氧和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对K562细胞分泌血管相关生成因子的影响.方法 选用携带和干扰HIF-1α基因的慢病毒转染K562细胞,以转染携带和干扰HIF-1α基因的K562细胞分别作为过表达组、干扰组,同时以空载病毒转染K562细胞作为对照组,3组在低氧状态下培养72 h后收集细胞.通过荧光显微镜观察转染效率,采用RT-PCR法检测HIF-1α和血管相关生成因子mRNA表达水平;ELISA法检测培养上清液中血管相关生成因子蛋白水平.结果 慢病毒转染K562细胞佳感染复数(MOI)为10,转染效率约50％,经过嘌呤霉筛选后转染阳性细胞达90％以上.干扰组人血管生成素(ANG)-Ⅱ和血管内皮生长因子(VEGF) mRNA表达均低于过表达组,而转化生长因子(TGF)-β mRNA表达高于对照组和过表达组,过表达组ANG-ⅡmRNA表达高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).培养上清液中TGF-α未检测到,过表达组ANG-Ⅱ水平低于对照组(P＜0.05);过表达组VEGF和TNF-α水平高于对照组,干扰组TGF-β和VEGF水平低于对照组(P＜0.05).干扰组TGF-β、VEGF和TNF-α水平低于过表达组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 低氧和HIF-1α可影响慢性白血病K562细胞血管生成相关因子的表达和自分泌,但在mRNA表达和蛋白分泌水平上存在差异.
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慢性髓性白血病相关信号通路的研究进展
慢性髓性白血病(CML)是一种以髓系增生为主的造血干细胞恶性疾病,具有酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白是导致该病的核心因素.酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的临床应用,尤其是第一代TKI伊马替尼的问世,使CML患者的缓解率和长期生存率得到很大提高.但临床仍有部分患者出现对该药原发或继发的耐药,治疗效果不佳.近年来,国内外学者发现CML的发生、发展及耐药的产生,往往伴随着BCR-ABL下游信号传导通路的异常,现就目前研究较热的JAK2/STAT、Hedgehog、Notch、PI3K/AKT等信号通路作一综述.
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阿托伐他汀对K562细胞的抗增殖作用及凋亡作用的研究
目的 观察阿托伐他汀对K562细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法 不同浓度的阿托伐他汀处理K562细胞,CCK-8法检测细胞增殖;AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞周期;比色法检测半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、-8、-9的活性;qRT-PCR检测Bcl-2、程序性死亡因子(PDCD5) mRNA的表达.结果 阿托伐他汀至浓度和时间依赖性地抑制K562细胞增殖(P＜0.05)并诱导细胞凋亡(P＜0.01);阿托伐他汀作用K562细胞后,G0/G1期细胞百分比增加(P＜0.01),S期细胞百分比下降(P＜0.01),且呈浓度依赖性(P＜0.01);阿托伐他汀以浓度依赖性活化caspase-3、-8、-9(P＜0.01)、下调Bcl-2 mRNA表达和上调PDCD5 mRNA的表达(P＜0.01).结论 阿托伐他汀可抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡.
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可溶性CD40配体对K562细胞增殖及生存素mRNA和IL-8表达的影响
目的：探究可溶性CD40配体（sCD40L）对人白血病K562细胞增殖、生存素（survivin）mRNA表达和白介素8（IL-8）表达水平的影响。方法采用噻唑蓝（MTT）法检测sCD40L对K562细胞增殖的影响，通过RT-PCR检测sur-vivin mRNA表达水平，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IL-8表达情况。结果不同浓度的sCD40L（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μg/mL）对K562细胞增殖均有抑制作用，且可降低survivin mRNA及IL-8的表达水平；sCD40L细胞组细胞增殖抑制率高于K562细胞组，survivin mRNA及IL-8表达水平均低于K562细胞组，差异均有统计学意义（P<0.05），且呈剂量-时间依赖性。结论 sCD40L在体外能够明显抑制K562细胞增殖，具有剂量-时间依赖性，sCD40L抑制K562细胞增殖可能与survivin mRNA及IL-8表达水平下调相关。
关键词： K562细胞 细胞增殖 Survivin基因 白细胞介素8 可溶性CD40配体 -
糙叶败酱总木脂素对K562细胞基因表达的影响
[目的]研究糙叶败酱总木脂素对白血病K562细胞基因表达的影响.探讨糙叶败酱治疗白血病的药理作用机制.[方法]分别提取药物治疗组表模型组K562细胞总RNA, Cy3和Cy5荧光标记,反转录分别合成cDNA探针后,与基因表达谱芯片杂交,ScanArray Lite扫描仪扫描芯片,Quantarray软件分析表达信号.[结果]总木脂素处理前后比较差异表达的基因共有147个,其中表达上调的有68个,表达下调的有79个.[结论]糙叶败酱总木脂素对K562细胞基因表达具有调控作用,从分子水平阐释了糙叶败酱治疗白血病的药理作用机制.
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三氧化二砷诱导白血病K562细胞凋亡与线粒体和内质网的作用
目的:研究三氧化二砷(Arsenic trioxide,As2O3)诱导白血病K562细胞凋亡的机制以及线粒体和内质网的作用.方法:采用MTT比色法测定细胞增殖活性,细胞形态学和AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡,电镜观察凋亡细胞内质网和线粒体形态结构变化;流式细胞术(FCM)测定线粒体跨膜电位(△ψm)、细胞内Ca2+浓度、活性氧(ROS)水平、细胞色素c(Cyt c)含量及Caspase-3活性;RT-PCR检测GRP78 mRNA表达,Western blot法检测GRP78/Bip蛋白表达.结果:2 mol/L和5 mol/L As2O3显著抑制K562细胞的增殖和诱导其凋亡.As2O3诱导K562细胞发生凋亡过程中,线粒体内外膜融合,嵴紊乱,肿胀,内膜扩张呈空泡样变,内质网明显扩张和脱颗粒;线粒体△ψm降低,细胞内Ca2+浓度、Cyt c释放和ROS水平明显升高,Caspase-3活性显著增强;GRP78 mRNA和蛋白表达无明显改变.结论:线粒体和内质网均参与As2O3诱导K562细胞的凋亡过程,但不能触发内质网应激反应性凋亡.
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日本粗榧果肉中三种二萜类化合物体外抗癌活性研究
目的:观察从日本粗榧果肉中分离得到的三种二萜类化合物18-hydroxyferruginol(A)、kayadiol(B)及hinokiol(C)对人白血病细胞K562和鼠肉瘤细胞S180生长的影响.方法:以人白血病细胞K562为研究对象,采用MTT法检测上述三种二萜类化合物对K562细胞生长的抑制率,用相差倒置显微镜观察细胞形态变化.根据检测结果,对三种化合物进行抗癌活性筛选,将筛选出的有效化合物kayadiol再作用于鼠肉瘤细胞S180,观察其对S180细胞的作用.结果:18-hydroxyferruginol及kayadiol对K562细胞有抑制其增殖的作用;其有效浓度分别是1×10-4 mol/L和1×10-8 mol/L～1×10-4 mol/L,kayadiol对S180细胞也有一定的抑制作用.hinokiol对于K562细胞的增殖没有明显的抑制作用.结论:日本粗榧果肉中分离得到的二萜类化合物18-hydroxyferruginol(A)、kayacliol(B)对人白血病细胞K562的生长具有一定的抑制作用.
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槲皮素对白血病K562细胞增殖及PPARγ蛋白表达影响的研究
目的:研究槲皮素在诱导白血病K562细胞凋亡过程中PPARγ蛋白的表达.方法:用槲皮素作用于K562细胞一定时间后,通过胎盘蓝拒染法观察其生长曲线,MTT法检测其对细胞的抑制率,Hoechst33258染色后荧光显微镜下观察细胞核形态,流式细胞仪检测处理后细胞的凋亡率,采用Western-blotting技术从蛋白分子水平上检测槲皮素对PPAR～蛋白表达.结果:槲皮素显著抑制K562细胞的增殖并呈浓度依赖关系.电泳的结果显示一定浓度的槲皮素能够上调PPARγ蛋白的表达,进而可能诱导K562细胞的凋亡.结论:PPARγ蛋白表达的上调可能是槲皮素抑制K562细胞增殖诱导凋亡的原因之一,其中,槲皮素起着PPARγ非特异配体的作用.
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阿胶含药血清对白血病K562细胞P53基因表达的影响
目的:观察阿胶含药血清对K562细胞p53基因表达的影响.方法:采用阿胶含药血清作用于体外培养的白血病K562细胞,流式细胞仪检测癌细胞P53的表达变化.结果:阿胶可下调肿瘤细胞P53基因的表达.结论:阿胶对K562细胞诱导凋亡的机理可能是通过下调P53的表达,诱导细胞中止分裂转入凋亡而取得效果.
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抗白一号诱导白血病K562细胞凋亡作用的研究
目的:研究抗白一号对白血病细胞株K562细胞的影响,并探讨其机制.方法:采用MTT法检测细胞毒作用,利用Wright-Gimesa染色法、Hoechst33342荧光染色等手段观察凋亡细胞的形态结构变化,应用透射电镜技术和流式细胞分光光度术进行凋亡定性定量观察,并探讨凋亡抑制基因bcl-2蛋白表达,应用原位末端标记检测DNA断裂.结果:抗白一号对细胞具有明显的生长抑制作用.在其作用下细胞呈现典型的凋亡形态学变化.流式细胞仪分析表明抗白一号能使K562细胞发生凋亡,凋亡率呈现对浓度和时间的依赖性,并发现抗白一号使K562细胞bcl-2基因的表达下调.结论:抗白一号能诱导K562细胞发生凋亡,其作用机制与bcl-2基因表达的下调有关.
