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体外血脑屏障及模拟代谢系统对丙烯酰胺诱导的SH-SY5Y凋亡的影响
目的 通过体外细胞整体模型模拟体内神经系统对外源性化学物质的屏障效应和代谢微环境,评价丙烯酰胺对神经细胞凋亡发生的影响.方法 用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和大鼠胶质瘤细胞(C6)建立非接触式共培养体外血脑屏障(blood brain barrier,BBB)模型,通过测定跨内皮阻抗(Trans-endotheilal electrical resistance,TEER)以及辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)的示踪效应分别验证建立的BBB模型的紧密连接性及通透性.将人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)、人正常肝细胞(L-02)和入神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)接种于自制的多器官细胞共培养板中,观察细胞生长情况,建立多器官细胞共培养(integrate discrete multiple organ cell co-culture,idMOC)模型.通过观察共培养条件下各组织细胞与单独培养条件下生长曲线情况,对idMOC模型进行验证.用不同浓度的丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)对SH-SY5Y细胞直接染毒、经BBB模型及idMOC模型后对SH-SY5Y细胞间接染毒,用流式细胞仪分析2种情况下SH-SY5Y细胞凋亡率的变化,探索模型对典型神经毒物ACR损伤效应的影响.结果 HUVEC细胞在C6细胞的作用下,间隙可以形成广泛的紧密连接的复合体而抑制外加电场下电流的跨内皮运动,TEER值均数在4、5、6d时均高于内皮细胞单独培养组,差异有统计学意义(P＜0.05);20 min后各时间点HRP的通透率在共培养组均小于单独培养组,差异有统计学意义(P＜0.05),表明共培养组的屏障功能高于单独培养组.各细胞间可通过培养板的交换孔进行物质交换,细胞生长状态良好,无明显死亡.且各细胞单独培养与在共培养组培养时生长曲线基本一致,差异无统计学意义(P＞0.05).不同浓度ACR(140、270 μg/ml)染毒情况下,与直接染毒组比较,经BBB模型和idMOC模型的间接染毒组凋亡率均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 建立了基于HUVEC细胞和C6细胞共培养体系的体外BBB模型以及基于HK-2细胞、人L-02细胞和SH-SY5Y细胞共培养体系的体外idMOC模型,并通过验证实验评价了ACR对SH-SY5Y细胞的毒性及毒作用特点.
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黄芩苷对神经细胞缺氧缺糖-再灌注损伤的保护作用
目的 观察黄芩苷对神经细胞缺氧缺糖再灌注损伤的保护作用,在细胞水平阐明黄芩苷治疗脑缺血-再灌注损伤的作用机制.方法 选用SH-SY5Y神经细胞,采用缺氧-复氧结合缺糖-复糖的方法,对其进行攻击,模拟人体神经细胞的缺血-再灌注损伤,观察黄芩苷对此损伤的治疗作用.结果 缺氧、缺糖8 h结合复氧、复糖12 h对神经细胞可造成明显损伤,导致SH-SY5Y细胞线粒体的活性下降,凋亡率明显上升;而黄芩苷可以显著减轻上述损伤.结论 黄芩苷对缺氧、缺糖-再灌注损伤的神经细胞有保护作用.
关键词： 黄芩苷 SH-SY5Y 缺氧缺糖-再灌注损伤 -
Beclin-1 shRNA对低氧诱导的SH-SY5Y细胞自噬的影响
目的:构建Beclin-1基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,感染人SH-SY5Y细胞,观察沉默Beclin-1基因后低氧对SH-SY5Y细胞自噬的影响.方法:构建特异性靶向Beclin-1基因的shRNA慢病毒表达载体和阴性对照序列慢病毒载体;再将载体转染入SH-SY5Y细胞;RT-PCR检测Beclin-1的mRNA表达;Western blot检测Beclin-1蛋白表达;CCK-8法测定Beclin-1 shRNA对SH-SY5Y细胞活力的影响.再将空白对照、阴性对照、转染型三种细胞分别以21％常氧及5％低氧培养,Western blot检测各组细胞LC3蛋白表达;电镜观察自噬小体.结果:Beclin-1 shRNA能明显抑制SH-SY5Y细胞Beclin-1的mRNA及蛋白的表达;沉默Beclin-1基因后,Beclin-1 shRNA组细胞存活率与阴性对照组相比无差异;成功建立了稳定表达Beclin-1 shRNA的SH-SY5Y细胞.5％低氧处理后,与阴性对照组相比较,Beclin-1 shRNA组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下调,细胞内自噬小体数量减少.结论:慢病毒介导的Beclin-1shRNA对SH-SY5Y细胞的活力无影响,但可以抑制低氧诱导的自噬.
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Tideglusib对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用及其机制研究
目的:研究特异性GSK-3β抑制剂Tideglusib对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion,MPP+)诱导SH-SY5Y神经细胞凋亡的保护作用及其可能的作用机制.方法:通过MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡建立体外帕金森病细胞模型,采用MTT筛选出对SH-SY5Y起保护作用的Tideglusib有效浓度;采用免疫化学染色方法检测Tideglusib对SH-SY5Y的神经保护作用;分别采用Hoechst33258核染方法和流式细胞仪检测Tideglusib的抗凋亡作用;通过Western-blot检测经Tideglusib处理后,SH-SY5Y细胞中与神经元凋亡密切相关的磷酸化tau蛋白(p-tau)及其上游激酶磷酸化糖原合成激酶(p-GSK-3β)的表达水平.结果:300μmol·L-1的MPP+处理SH-SY5Y细胞48 h构建体外帕金森细胞模型,通过MTT及免疫化学染色方法筛选Tideglusib的有效保护浓度发现5μmol·L-1的Tideglusib可对SH-5Y细胞产生保护作用,细胞存活率与MPP+处理组相比差异具有统计学意义(P<0.01);通过Hoechst33258和流式细胞仪发现MPP+可导致SH-SY5Y产生凋亡,5μmol·L-1的Tideglusib可有效改善SH-SY5Y的凋亡情况,差异具有统计学意义(P<0.01);Western-blot结果显示MPP+可引起GSK-3β的活化并诱导tau的异常磷酸化;而Tideglusib可下调GSK-3β的活性,降低磷酸化tau的水平(P<0.05).结论:Tideglusib可抑制MPP+引起的SH-SY5Y神经细胞凋亡,作用机制可能是通过抑制GSK-3β从而降低tau蛋白的磷酸化水平,进一步发挥神经元保护作用.
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三七总皂苷对缺糖缺氧/再灌注损伤SH-SY5Y细胞NgR1、ROCK2mRNA和蛋白表达的影响
目的:研究三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)对Nogo-NgR及其下游通路中NgR1和ROCK2 mRNA和蛋白的调控作用.方法:将SH-SY5Y细胞分为8组:正常组、模型组、维甲酸(retinoic acid,RA)组、三七总皂苷大(640 mg/L)、小(320 mg/L)剂量组、Y27632组、Y27632+三七总皂苷大、小剂量组,采用缺糖缺氧方法建立SH-SY5Y细胞损伤模型.应用实时荧光定量PCR和Western blot检测SH-SY5Y细胞缺糖缺氧损伤后NgR1、ROCK2 mRNA和蛋白表达特征及三七总皂苷对其影响.结果:模型组细胞中NgR1、ROCK2 mRNA和蛋白的表达较正常组显著升高(P＜0.01);各给药组细胞中NgR1和ROCK2 mRNA水平较模型组均有较为显著的降低(P＜0.01或P＜0.05);Western blot结果显示Y27632+三七总皂苷大、小剂量组中NgR1表达水平较模型组有显著差异(P＜0.01或P＜0.05);Rock2在三七总皂苷大剂量组、Y27632组和Y27632+三七总皂苷大、小剂量组中,表达水平较模型组明显减少(P ＜0.01或P＜0.05).结论:三七总皂苷可能通过抑制NgR1、ROCK2 mR-NA和蛋白在缺糖缺氧损伤SH-SY5Y细胞中的表达,进而促进轴突的生长和重塑.
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红景天苷对缺氧缺糖损伤的神经细胞线粒体膜电位和凋亡的影响
目的:观察红景天苷对神经细胞系SH-SY5Y细胞缺氧/缺糖损伤时线粒体膜电位和凋亡的影响.方法:四唑盐比色实验(MTT)检测线粒体活性,流式细胞术检测细胞凋亡百分率和线粒体膜电位,荧光显微镜观察细胞形态学变化和坏死百分率.结果:缺氧/缺糖损伤2h可诱导SH-SY5Y细胞凋亡和坏死,分别为18.59%(P＜0.01)和4.94%(P＜0.01),形态学观察也发现SH-SY5Y细胞的染色质凝聚,核碎裂,凋亡小体产生,线粒体膜电位和活性分别降低29.17%(P＜0.01),38.80%(P＜0.01),随着缺氧/缺糖时间的延长,细胞凋亡的发生也越来越多,坏死的细胞也增多,线粒体膜电位和活性进一步下降;红景天苷能显著降低SH-SY5Y细胞凋亡及坏死的百分率,提高线粒体膜电位和活性,其作用随剂量增加而作用增加.结论:红景天苷可抑制缺氧/缺糖损伤所致的线粒体膜电位和活性的降低,从而具有稳定线粒体膜电位的作用,抑制神经细胞凋亡的发生.
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人参糖蛋白降低Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡中一氧化氮释放的保护作用
目的 确定人参糖蛋白的基本化学构成,探讨人参糖蛋白抗 β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)引起的神经炎症和神经保护作用.方法 采用超滤、葡聚糖凝胶等方法分离纯化得到人参糖蛋白(PgGp),采用苯酚-硫酸法测定总糖含量,Lowry法测定蛋白含量,高效液相色谱法测定纯度和分子量分布.利用MTT法考察PgGp(5,25,125μg/mL)对细胞存活率的影响;Griess法测定PgGp对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞一氧化氮释放的影响.结果 PgGp总糖含量为25.9%,蛋白含量为73.4%,分子量分布在200~50000 Da.PgGp在不影响细胞存活率情况下,中、高剂量组与模型组比较,表现出保护Aβ25-35诱导的SH-SY5Y释放NO的能力(P<0.05,P<0.01).结论 人参糖蛋白可降低Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞一氧化氮释放量,从而具有保护神经细胞的作用.
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百草枯诱导的SH-SY5Y细胞中核连蛋白2基因的表达变化
目的 检测核连蛋白(NUCB)2在百草枯(PQ)诱导的SH-SY5Y细胞中的表达变化,分析NUCB2在PQ引起的SH-SY5Y细胞凋亡中的作用机制.方法 采用MTT法进行SH-SY5Y细胞毒性分析.选择PQ作用的佳浓度和时间点,进一步收取经PQ处理后的SH-SY5Y总RNA,首先采用RT-PCR方法观察NUCB2的表达趋势,然后采用real-time PCR方法进行NUCB2基因进行表达变化检测,采用ΔΔCt法进行定量比较分析.结果 MTT方法在酶标仪490 nm波长下,分析得到PQ的佳作用浓度和时间是0.5 mmol/L作用24 h,此时细胞活力较对照组低约41.67%;采用ΔΔCt法进行定量比较分析,发现NUCB2在mRNA水平的表达量明显降低(P=0.001 6);Western印迹检测发现SH-SY5Y细胞经PQ诱导后引起了caspase-3酶原形式的表达量降低(P<0.05).结论 NUCB2基因在经PQ诱导后的SH-SY5Y细胞中表达量明显降低,分析其可能在神经细胞的凋亡机制中发挥重要作用.
关键词： 核连蛋白(NUCB)2 PQ SH-SY5Y 凋亡 -
pEGFP-N1-NUCB2真核表达质粒的构建及在SH-SY5 Y细胞中的转染效率
目的 构建pEGFP-N1-NUCB2重组子并比较Lipofectamine 2000和Xfect两种转染试剂在进行神经细胞转染时的转染效率.方法 构建pEGFP-N1-NUCB2重组子,然后采用碱裂解法进行质粒DNA的提取,PEG-MgCl2进行质粒DNA的纯化,后将纯化的质粒DNA分别用两种不同转染试剂分别在HEK293细胞和SH-SY5Y细胞中进行转染.结果 采用Lipofectamine 2000进行pEGFP-N1-NUCB2重组子的转染实验,发现在HEK293细胞中可以转染成功,但是在SH-SY5Y细胞中基本没有荧光显现;采用Xfect进行pEGFP-N1-NUCB2重组子的转染实验,发现在SH-SY5Y细胞中虽有荧光显现,但是转染效率非常低.结论 Xfect的转染效率高于Lipofectamine 2000,pEGFP-N1-NUCB2在SH-SY5Y细胞中采用脂质体进行转染很难成功.
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6-羟基多巴胺诱导SH-SY5Y细胞帕金森病模型中14-3-3蛋白表达的研究
目的 应用蛋白质组学技术研究6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导SH-SY5Y细胞帕金森病(PD)模型中14-3-3蛋白的表达变化.方法 在建立6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞PD模型的基础上,分别提取6-OHDA实验组和对照组孵育24 h的细胞总蛋白,应用荧光差异双向凝胶电泳(DIGE)技术获得蛋白点的差异表达信息,运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)鉴定出差异蛋白质.结果 DIGE分析发现实验组有一个表达明显上调的差异蛋白质点(P＜0.05),经质谱分析鉴定确认为14-3-3蛋白.结论 6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞的PD模型中14-3-3蛋白表达上调,提示14-3-3蛋白上调可能与PD的发病机制有关.
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芦荟大黄素对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用
目的 研究芦荟大黄素对MPP+诱导的人神经母细胞株SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用.方法 采用体外SH-SY5Y细胞培养的方法,建立SH-SY5Y神经细胞MPP+损伤模型.通过观察细胞形态,测定细胞存活率(MTT法),检测芦荟大黄素对SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用.结果 同正常对照组细胞相比,MPP+损伤模型组细胞活性明显降低;同模型组比较,浓度为2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L的芦荟大黄素能减轻MPP+引起的SH-SY5Y神经细胞的损伤,明显提高细胞的存活率.结论 芦荟大黄素对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用.
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开心散含药血清对β-淀粉样蛋白致SH-SY5Y细胞损伤的影响
目的:研究开心散含药血清对β-淀粉样蛋白所致人神经母细胞瘤SH-SY5Y损伤的影响及其机制.方法:SD大鼠灌胃给予开心散(0.58 g/Kg,1.16 g/Kg,2.32 g/Kg),连续7天,每天2次,第8天末次给药后1h腹主动脉取血,制备开心散含药血清,将不同浓度的开心散含药血清加入SH-SYSY细胞孵育2h后,加入Aβ25-35(10 μmol/L),共同培养24 h.采用MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡,活性氧表达及线粒体膜电位.结果:与正常对照组细胞比较,Aβ25-35(10μmol/L)可以明显降低SH-SY5Y细胞的细胞存活率,增加细胞凋亡率,升高细胞内活性氧的含量,降低线粒体膜电位;开心散含药血清可以明显抑制细胞凋亡,提高细胞存活率,降低活性氧表达及提高线粒体膜电位(P＜0.01).结论:开心散含药血清能减轻Aβ25-35所致的细胞损伤,可能与保护线粒体,减少细胞凋亡有关.
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脉络宁对SH-SY5Y细胞氧糖剥夺再恢复损伤的保护作用及其机制研究
目的:研究脉络宁注射液对SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/再复氧糖(OGD/R)损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制.方法:体外培养SH-SY5Y细胞,将细胞随机分为正常组、氧糖剥夺模型组和脉络宁组(1.0 mL·L-1),建立体外OGD/R细胞模型.倒置显微镜观察细胞形态;MTT法测定细胞存活率;测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量;Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax蛋白表达的变化.结果:与模型组相比,脉络宁能减轻OGD/R引起的SH-SY5Y细胞的损伤,明显提高细胞存活率(P＜0.05),减少LDH的释放量(P＜0.05),有效抑制Bax蛋白的表达(P＜0.05),上调Bcl-2的表达(P＜0.05).结论:脉络宁注射液对OGD/R引起的SH-SY5Y细胞损伤有保护作用,其机制可能与影响凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达有关.
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大气细颗粒物对SH-SY5Y细胞能量代谢的影响
[目的]研究大气细颗粒物(PM2.5)对人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞能量代谢的影响.[方法]用不同质量浓度(下称浓度)PM2.5(0、20、40、80、160、320 mg/L)染毒SH-SY5Y细胞24h,MTT法检测细胞存活率,丙二醛(MDA)试剂盒检测MDA的含量,XFp细胞能量代谢分析仪检测细胞线粒体呼吸功能及糖酵解功能.[结果] PM2.5各浓度组SH-SY5Y细胞存活率均低于对照组(均P＜0.05);80、160、320 mg/L PM2.5组细胞内MDA含量高于对照组(均P＜0.05).PM2.5各浓度组细胞基础耗氧率、ATP偶联的有氧呼吸速率低于对照组(P＜0.05),分别下降了13.8％、19.7％、25.1％、35.8％、45.2％和17.0％、21.9％、28.3％、39.2％、47.9％;40、80、160、320 mg/L PM2.5组细胞有氧呼吸大值较对照组下降了19.0％、24.2％、28.5％、40.7％(均P＜0.05).80、160、320 mg/L PM2.5组细胞糖酵解水平和糖酵解大值低于对照组(均P＜0.05),分别下降了15.9％、22.1％、26.1％和16.5％、19.6％、21.5％.SH-SY5Y细胞基础耗氧率、ATP偶联的有氧呼吸速率、质子漏耗氧速率、有氧呼吸大值、糖酵解水平及糖酵解大值与细胞存活率呈正相关(r在0.65～0.86之间,P＜0.01),与MDA值呈负相关(r为-0.53～-0.86,P＜0.05或P＜0.01).[结论] PM2.5可引起SH-SY5Y细胞的氧化损伤,降低细胞线粒体呼吸功能及糖酵解功能.
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雷帕霉素对不同肿瘤细胞Bax/Bcl-2和活性caspase-3表达的影响
目的:探讨雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对不同肿瘤细胞Bax/Bcl-2和活性caspase-3表达的影响及其可能的机制.方法:采用RAPA处理肺腺癌A549细胞、人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞和人骨肉瘤MG63细胞后,MTT法检测细胞的相对增殖率,蛋白质印迹法检测细胞中Bcl-2、Bax和活性caspase-3的表达以及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和Akt活性的变化;RAPA联合ERK抑制剂U0126或PD98059以及联合Akt抑制剂wortmannin处理MG63和SH-SY5Y细胞后,分别用MTT法和蛋白质印迹法检测细胞的相对增殖率和Bcl-2、Bax、活性caspase-3的表达.结果:在A549细胞中,RAPA上调细胞Bax/Bcl-2和活性caspase-3的表达(P＜0.05),细胞的相对增殖率下降(P＜0.05).在MG63细胞中,RAPA通过ERK上调Bcl-2和Bax的表达,Bax/Bcl-2和活性caspase-3的表达以及细胞的相对增殖率无明显变化;ERK抑制剂U0126或PD98059逆转RAPA导致的Bcl-2上调,联合RAPA作用后细胞中Bax/Bcl-2和活性caspase-3的表达上调(P＜0.05),细胞的相对增殖率降低(P＜0.05).在SH-SY5Y细胞中,RAPA通过Akt上调Bcl-2的表达,Bax/Bcl-2降低(P＜0.05),细胞的相对增殖率上升(P＜0.05); Akt抑制剂wortmannin逆转RAPA导致的Bcl-2上调,联合RAPA作用后细胞中Bax/Bcl-2和活性caspase-3的表达上调(P＜0.05),细胞的相对增殖率降低(P＜0.05).结论:RAPA在不同肿瘤细胞中可能通过调节不同的激酶影响Bax/Bcl-2和活性caspase-3的表达.
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阿片生长因子Met-ENK对多种肿瘤细胞的生长抑制作用研究
目的:研究阿片生长因子Met-ENK(methionine enkephalin,Met-ENK)对多种肿瘤细胞的抑制作用,分析其对不同肿瘤细胞系的抑制作用差异性及特点.方法:采用CCK-8法考察不同浓度Met-ENK对SH-SY5Y细胞的增殖抑制活性;采用细胞计数法计数相同浓度Met-ENK作用下,SHSY5Y细胞随时间的生长曲线;采用CCK-8法检测不同浓度的Met-ENK对8种不同的肿瘤细胞系细胞的抑制作用.结果:不同浓度的Met-ENK对SH-SY5Y细胞具有不同的抑制作用,IC50为5.1×10-5 mol/L;Met-ENK作用后SH-SY5Y在48 h生长抑制明显(P＜0.01);不同浓度的Met1ENK对8种不同的肿瘤细胞系细胞均有抑制作用,其中对SMCC-7721抑制作用为明显.结论:Met-ENK具有广谱抗肿瘤作用,但抑制强度不同,具有时间依赖性,其对8种不同的肿瘤细胞系细胞均有不同强度的抑制作用.
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丹酚酸D对MPP+损伤SH-SY5Y细胞线粒体功能和生物合成的影响
目的 研究丹酚酸 D ( salvianolic acid D, SalD)对MPP+损伤SH-SY5Y细胞线粒体功能和生物合成的影响及机制.方法 采用 MPP+损伤 SH-SY5Y细胞模型,MTT法检测MPP+对细胞的毒性作用,MTT和LDH法考察SalD对SH-SY5Y细胞活力的影响,AO/EB法检测细胞凋亡.应用DCFH-DA和MitoSOX分别检测细胞 ROS及线粒体超氧化物水平,通过测定细胞内ATP水平以及线粒体膜电位变化,考察线粒体功能. qPCR检测MPP+损伤细胞后,PGC-1α及其下游调控基因NRF1和TFAM的mRNA水平,Western blot及免疫荧光测定细胞中PGC-1α、NRF1 和TFAM蛋白含量.结果 MPP+可损伤SH-SY5Y细胞,导致细胞存活率明显降低为51.34% . 0.1、1、5 μmol·L-1SalD 和 5 mmol·L-1 NAC能够减轻MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤及LDH释放,其细胞存活率分别增加到67.98% 、71.79% 、76.91% 、77.55% .并且,SalD能减少MPP+诱导的细胞内ROS及线粒体超氧化物的升高,降低线粒体膜电位,改善线粒体功能.同时,SalD能够明显抑制MPP+损伤导致的PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA转录及表达降低.结论 SalD能够抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤,保护线粒体功能和线粒体生物合成.
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5-羟基-1-氢-吲唑对SH-SY5 Y细胞的保护作用及其机制研究
目的：研究5-羟基-1-氢-吲唑对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导凋亡的SH-SY5Y神经细胞的保护作用及其可能的作用机制。方法以MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡建立体外帕金森病细胞模型,以MTT法筛选药物有效保护浓度；以免疫化学染色以及Hoechst 33258核染研究药物的神经保护作用以及抗凋亡作用；以Western blot法检测与神经元凋亡密切相关的磷酸化tau蛋白及其上游激酶磷酸化糖原合成激酶( P-GSK-3β)和周期依赖性蛋白激酶5( cyclin dependent kinase,CDK5)的表达。结果 MPP+可引起 GSK-3β的活化以及CDK5活性升高,诱导tau的异常磷酸化和神经细胞凋亡；而5-羟基-1-氢-吲唑可下调GSK-3β与CDK5的活性,降低磷酸化tau的水平和抑制MPP+导致的SH-SY5Y细胞的凋亡。结论5-羟基-1-氢-吲唑可抑制MPP+引起的SH-SY5Y神经细胞凋亡,作用机制可能是通过同时抑制GSK-3β和CDK5两条信号传导通路,而降低tau蛋白的磷酸化水平,进一步发挥神经元保护作用。
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CKLF1通过激活PLCγ/FAK信号途径促进SH-SY5 Y细胞迁移
目的：考察趋化素样因子1( chemokine-like factor 1, CKLF1)对神经系统细胞系SH-SY5Y细胞迁移运动的影响,并进一步研究其分子机制。方法采用CELLocate细胞定位法研究CKLF1在不同时间点对 SH-SY5Y细胞迁移的影响；采用蛋白免疫印迹法观察CKLF1是否能够增强与细胞迁移密切相关的局部粘着斑激酶( focal adhesion kinase, FAK) Tyr-397位点的磷酸化水平,并进一步研究抑制 FAK上游分子PLCγ对这一作用的影响；采用Boyden趋化小室法观察抑制FAK或PLCγ对CKLF1趋化活性的影响。结果CKLF1对SH-SY5Y细胞具有趋化作用,能够诱导其迁移运动,并能明显增强 FAK-pY397位点的磷酸化水平,而加入PLCγ抑制剂U73122则减弱了CKLF1诱导的FAK磷酸化水平的升高。此外, FAK 抑制剂 PF-573228和 PLCγ抑制剂U73122均可明显抑制 CKLF1的趋化活性。结论趋化因子CKLF1能够通过激活 PLCγ/FAK 信号途径,促进 SH-SY5Y细胞的迁移运动。
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脂质体转染TRPM7siRNA对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞分泌炎症因子的影响
目的 利用小干扰RNA(siRNA)抑制TRPM7基因的表达,研究TRPM7对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞分泌炎症因子的影响.方法 通过Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞构建阿尔采末病体外模型,MTT法测定Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞佳作用浓度与时间点,将人工合成抑制TRPM7基因的siRNA片段,通过脂质体LipofectamineTM 2000转染到SH-SY5Y细胞内;RT-PCR检测TRPM7、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表达,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒的测定细胞上清乳酸脱氢酶(LDH)的含量;ELISA测定细胞上清中TNF-α、IL-6的含量.结果 转染siRNA后SH-SY5Y细胞的TRPM7、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表达较模型组明显下降,细胞上清中TNF-α、IL-6、LDH的含量表达较模型组明显下降.结论 应用siRNA干扰靶向抑制TRPM7基因,可以下调TNF-α、IL-6等炎症因子的释放,这一过程可能是通过抑制NF-κB信号转导通路的激活,从而减少炎症因子的释放,进而减轻Aβ对SH-SY5Y细胞的毒性作用.
