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辛伐他汀对大鼠髓核间充质干细胞增殖及分泌功能的影响
目的:观察大鼠髓核间充质干细胞(nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell,NPMSC)的生物学特性和辛伐他汀对髓核间充质干细胞增殖及分泌功能的影响.方法:取8周龄SD大鼠尾椎髓核组织,采用胶原酶及胰酶序贯消化法分离NPMSC并进行体外扩增培养,观察细胞形态并通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况.通过流式细胞仪检测细胞免疫表型及逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测干细胞基因表达进行NPMCS的鉴定.取第3代NPMSC施加不同浓度辛伐他汀干预(0μmol/L 、0.01 μmol/L、0.1μmol/L、1 μmol/L),在干预1d、3d、7d、14d、21d后通过CCK-8法检测细胞活力,RT-PCR检测蛋白多糖、Ⅱ型胶原、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,GLUT-1)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的mRNA表达.结果:原代细胞早期可形成葵花样细胞集落,克隆样生长,传代后细胞生长较原代细胞明显加快,细胞形态以纺锤形为主.第3代细胞高表达干细胞相关阳性表面抗原分子CD73、CD90及CD105,低表达干细胞相关阴性表面抗原分子CD45及CD11b,与骨髓间充质干细胞具有相似的干细胞转录因子Sox2、Oct-4及Nanog表达水平.适当浓度的辛伐他汀(0.01 μmol/L～0.1 μmol/L)可促进NPMSC增殖及HIF-1α 、GLUT-1、VEGF的mRNA表达,且浓度为0.1μmol/L时达到强,而高浓度辛伐他汀(1tμmol/L)对细胞增殖能力及HIF-1α、GLUT-1、VEGF的mRNA表达有明显抑制作用.辛伐他汀可使NPMSC中出现并促进Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA的表达,0.1μmol/L浓度达到强.结论:大鼠的髓核组织培养出的NPMSC能够表达骨髓间充质干细胞特异性的干性基因,适当浓度(0.01 μmol/L～0.1μmol/L)的辛伐他汀可促进NPMSC增殖和细胞外基质的分泌.
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动静力失衡对大鼠颈椎不同节段椎间盘退变影响的显微CT形态学和组织学研究
目的:评价大鼠动静力失衡颈椎退变模型对C4～C7各节段终板磨损面积、椎间高度和椎间盘退变的影响,并分析终板磨损面积和椎间高度与椎间盘退变的相关性.方法:24只3月龄雌性SD大鼠随机分为模型组(14只)和对照组(10只).对照组仅做皮肤切口;模型组大鼠横向切断颈背部肌肉以及韧带,制作大鼠动静力失衡颈椎退变模型.术后12周、18周、24周分三次取大鼠颈椎标本.标本取材后进行显微CT扫描以及番红O快绿染色.测量C4/5、C5/6、C6/7各个节段椎间高度,计算上述三个节段的终板磨损比例,并对椎间盘退变程度进行评分.应用SPSS 13.0比较不同组相同节段椎间盘的终板磨损率,椎间高度和退变评分,并分析终板磨损率与椎间盘退变之间的相关性.结果:显微CT扫描发现模型组术后12周各个节段软骨终板均出现明显的磨损,磨损主要位于终板的腹侧.颈椎节段越高,磨损程度越轻.术后18周、24周,模型组C5/6、C6/7软骨终板磨损比例明显大于对照组,有统计学意义(P＜0.05).术后各个时间点,模型组不同节段终板磨损率情况不同,其中C6/7节段明显大于C4/5节段(P＜0.05).组织学切片显示,软骨终板的形态学改变早期以磨损为主,晚期则出现了大量钙化.术后12周,模型组C5/6、C6/7椎间高度明显低于对照组,术后18周、24周时高度进一步下降.术后12周,模型组的各节段椎间盘退变评分明显高于对照组(P＜0.05).术后24周时,模型组C4/5退变评分为11.5±1.0分,C5/6为11.8±1.0分,C6/7为12.8±0.8分.不同节段椎间盘退变评分差异有显著性(P＜0.05),其中C6/7椎间盘退变评分高,明显大于C4/5、C5/6节段(P＜0.05).相关分析显示:终板磨损比例与椎间盘高度、椎间盘退变评分具有明显的相关性.结论:在大鼠动静力失衡颈椎退变模型中C6/7终板磨损比例较大,椎间盘高度降低出现较早,组织学上椎间盘退变程度也较严重,是该模型椎间盘退变的主要节段.软骨终板的形态学改变与椎间高度的降低和椎间盘退变程度有明显的相关性.
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双侧小关节切除制作大鼠颈椎间盘退变模型的可行性
目的:探讨双侧小关节切除建立大鼠颈椎间盘退变模型的可行性.方法:16只3月龄雌性SD大鼠随机均分为实验组和对照组.实验组大鼠C4/5和C5/6双侧上、下关节突采用磨钻切除.术后12周时获取大鼠C4～C6标本.显微CT扫描C5/6节段,测量椎间高度及软骨终板的缺损率,并观测C5椎体微结构的变化;番红O快绿染色后观察髓核和纤维环的形态,并对椎间盘退变程度评分.采用RT-PCR法检测C4/5椎间盘组织中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原以及基质金属蛋白酶(MMP)3和13的mRNA表达水平.组间定量指标行独立样本t检验,显著性水平为P＜0.05.结果:术后12周,实验组椎间高度为0.51 ±0.04mm,显著低于对照组(0.55±0.02mm)(P＜0.05).实验组软骨终板出现明显的缺损,下终板缺损主要出现在腹侧,而上终板四周及中央均出现缺损;实验组的缺损率为(11.5±2.0)％,显著大于对照组的(6.9±1.0)％(P＜0.05).在椎体微结构中,实验组骨体积分数和骨小梁间隙分别为(53.0±6.0)％和170±2μm,而对照组分别为(46.4±3.0)％和195±1μm,两组间的差异均有统计学意义.实验组的骨小梁数目和厚度与对照组无统计学差异.组织学观察到实验组椎间盘的软骨终板形态不规则、出现缺损及少许钙化,髓核细胞出现聚集、数量减少,纤维环排列紊乱.实验组椎间盘退变评分为8.6±0.8分,显著高于对照组的5.8±0.5分.在实验组椎间盘组织中,蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的mRNA表达水平明显低于对照组,MMP-13的mRNA表达水平显著高于对照组,MMP-3则呈现上升趋势.结论:大鼠颈椎双侧小关节切除可导致切除节段椎间盘在形态学、组织学和分子生物学上的退变,是建立椎间盘退变模型的一种可行方法.
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被动吸烟大鼠椎间盘中白介素-1β和白介素-1受体Ⅰ的表达及意义
目的:观察被动吸烟大鼠椎间盘中自介素-1β(IL-1β)和白介素-1 受体Ⅰ(IL-1 R Ⅰ)的表达,探讨被动吸烟诱发椎间盘退变的机制.方法:取4周龄SD大鼠60只,随机分为6组,第1组不予吸烟,10只;第2～4组分别吸烟2周、4周、8周,第5、6组吸烟8周后予停止吸烟4周、8周,每组10只.在相应时间点处死动物,取L4/5椎间盘行HE染色和IL-1β及IL-1 R Ⅰ免疫组化染色,观察椎间盘退变情况和IL-1β及IL-1 R Ⅰ的表达情况.结果:HE染色显示,吸烟2周时椎间盘无明显退变,吸烟4周时椎间盘出现2～3级退变,吸烟8周时椎间盘出现3～4级退变,停止吸烟后4周退变无明显修复;停止吸烟后8周退变部分修复.免疫组化染色显示,吸烟2周组IL-1β及IL-1 R Ⅰ染色阳性细胞率增加,吸烟4周组染色阳性细胞率大于2周组;吸烟8周组达(76±3.2)%和(46±2.8)%,停止吸烟后4周开始下降,8周时降至(66±2.9)%和38±2.2%.结论:被动吸烟可以诱发大鼠椎间盘退变,且随吸烟时间延长退变加重;其导致退变的机制可能与上调椎间盘内IL-1β和IL-1 R Ⅰ的表达有关.
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软骨终板通透性对体外培养大鼠髓核细胞生物学特性的影响
目的:观察软骨终板营养通路通透性对外培养大鼠髓核细胞生物学特性的影响.方法:4周龄雄性SD大鼠20只,处死后立即手术切取腰段椎间盘(包括邻近的软骨终板),每只6个,随机分为A、B、C 3组,其中A组为正常对照组,B组用骨蜡封闭上软骨终板,C组用骨蜡封闭上、下软骨终板,3组椎间盘在体外进行整体器官培养.于培养前和培养7d、14d时,分别用Mitotracker Green荧光探针和RT-PCR方法评估椎间盘髓核细胞的活力和髓核Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA的表达;于培养前和培养14d时用免疫组化方法观察髓核蛋白多糖、Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶3(MMP-3)的表达.结果:取材后培养前髓核细胞的荧光强度高;在体外培养7d,3组髓核细胞的荧光强度较培养前变化均不明显,3组之间无显著性差异(P＞0.05);培养14d时A、B、C组荧光强度较培养前分别降低约19%、22%和30%,与培养前比较差异均有显著性(P＞0.05),其中C组与A、B两组比较有显著性差异(P＜0.05),A、B两组比较差异无显著性(P＞0.05).免疫组织化学观察显示在培养14d时3组髓核蛋白多糖和Ⅱ型胶原的染色强度与培养前比较均有所降低,MMP-3阳性染色增加,蛋白多糖、Ⅱ型胶原和MMP-3染色强度的变化以C组为明显.3组髓核细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达在培养7d和14d时均较培养前显著降低(P＜0.05),其中7d时3组之间无显著性差异(P＞0.05),14d时A、B两组间无显著性差异(P＞0.05),C组与A、B组比较有显著性差异(P＜0.05).结论:降低体外培养大鼠椎间盘上下软骨终板的通透性,可在短期内影响髓核细胞的生物学特性,加速椎间盘的退变.
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脐带华通胶间充质干细胞移植对退变椎间盘影响的实验研究
目的:探讨人华通胶间充质干细胞(Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells,WJMSCs)移植对犬退变椎间盘的影响.方法:从新生儿脐带中提取WJMSCs,取增殖良好的第3代细胞,用含有绿色荧光蛋白的腺相关病毒(rAAV2-EGFP)感染标记细胞.选择20只健康成年比格犬作为实验动物,使用穿刺抽吸髓核组织法建立椎间盘退变模型(L4/5、L5/6、L6/7).4周后将犬各节段椎间盘进行分组:L3/4为对照组(A组);L4/5为退变组(B组);L5/6为注射组(C组),注射生理盐水;L6/7为移植组(D组),移植绿色荧光蛋白标记的WJMSCs细胞悬液.造模术前、术后4、8、12、24周行腰椎X线及MRI检查.24周后处死动物取材进行冰冻切片荧光、HE染色及番红O染色等组织学检测,提取髓核组织总RNA,反转录后行Real Time PCR检测,观察蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX-9及Ⅰ型胶原基因表达变化.结果:分离培养的WJMSCs贴壁生长,呈梭形形态,rAAV2-EGFP病毒感染后第3天表达绿色荧光.影像学检查结果显示各组椎间盘高度指数及相对灰度指数在造模术前、术后第4周无统计学差异,术后8、12、24周,D组椎间盘相对高度指数及相对灰度指数较B、C组高(P＜0.05),比A组低(P＜0.05).术后24周,D组髓核组织冰冻切片内能够检测到GFP阳性的WJMSC细胞,HE染色显示D组髓核组织退变比B组和C组轻,番红O染色结果显示D组染色较B组和C组深,基因表达检测结果显示D组Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX-9基因表达比B、C组高(P＜0.05),但比A组低(P＜0.05).结论:人WJMSCs移植入犬退变椎间盘内能够存活,促进椎间盘细胞外基质Ⅱ型胶原及蛋白多糖合成,维持椎间盘高度及髓核含水量,能够有效延缓椎间盘退变进展.
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酸环境对人髓核间充质干细胞生物学活性的影响
目的:观察酸环境对体外培养的成人髓核间充质干细胞(NPMSCs)生物学特征的影响,探讨椎间盘退变的可能机制.方法:用胶原酶消化法从6例脊柱侧凸矫形患者手术摘除的6个腰椎间盘(Pfirrmann椎间盘退变分级为Ⅰ级或Ⅱ级)髓核组织中分离细胞,体外培养,传代并观察细胞形态.取P2代细胞,利用流式细胞仪对分离得到的细胞表型CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和人类白细胞抗原(HLA)-DR表达情况进行检测;用成骨、成软骨、成脂培养液诱导培养细胞,2周后分别用茜素红、甲苯胺蓝、油红O对细胞进行染色,观察其成脂、成骨、成软骨能力.按照国际干细胞治疗协会(ISCT)有关间充质干细胞(MSCs)的判定标准,对分离得到的细胞进行综合评估鉴定.在37℃、21％O2、5％CO2的细胞培养箱中用不同pH值(6.2、6.5、6.8、7.1、7.4)的DMEM10％血清培养液培养P2代细胞,1、3、5、7、9、11、13d后利用细胞增殖试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖活力(OD值),培养3d时借助流式细胞仪检测细胞凋亡率,不同pH值培养基培养28d时采用实时荧光定量(RT-PCR)检测P2代细胞"干性维持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的mRNA表达情况.结果:P0代细胞均贴壁生长.P2代细胞免疫表型鉴定显示MSCs表面分子标记CD90、CD105、CD73表达比例分别高达96％、95％、94％以上,低表达CD45、CD34、HLA-DR(均低于4％).茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色分别证实分离的细胞均可向骨、脂肪及软骨细胞三系诱导分化.按照ISCT有关MSCs的判定标准,分离得到的细胞即NPMSCs.细胞代谢活性测定示P2代细胞在培养后1、3d各组间细胞OD值差异无统计学意义(P＞0.05);5d、7d、9d、11d、13d各组间细胞OD值差异有统计学意义(P＜0.05),且pH值越低细胞的OD值越小.pH值7.4组的细胞凋亡率均小于其余各组,各组间有统计学差异(P＜0.05).pH值7.4组"干性维持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的mRNA均明显高于pH值7.1、6.8、6.5、6.2组(P＜0.05).随着培养液pH值降低,细胞的凋亡率升高,细胞干性维持基因及酸通道家族蛋白基因的mRNA表达降低.结论:低pH值的酸环境培养1、3d对成人NPMSCs增殖无明显影响,培养5d后明显抑制NPMSCs的增殖和基因表达,促进细胞凋亡,且随着pH降低作用越明显.
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微囊化同种异体骨髓间充质干细胞移植预防兔椎间盘退变的实验研究
目的:探讨超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)磁粒子标记的微囊化同种异体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bMMSCs)移植预防椎间盘退变的可行性.方法:选用60只健康新西兰大白兔.随机平均分为A、B、C、D、E 5组,每组12只.A、B、C、D组应用髓核抽吸法制作L2/3、L3/4、L4/5椎间盘退变模型,取同种异体兔bMMSCs行体外培养,并在体外纯化扩增,用SHO标记后行微囊化,于造模手术当时植入(A组)兔手术节段椎间盘内;B组植入未微囊化bMMSCs;C组移植空微囊;D组仅制作模型,不移植;E组为正常对照组.分别于建模后2、4、6、8周时用MRI扫描对标记干细胞在椎间盘内分布进行示踪,并于相应时间点处死动物后取L2/3、L3/4、L4/5髓核组织,用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化,免疫组化法测定Ⅱ型胶原含量的变化.所得数据进行统计学分析.结果:bMMSCs能被SPIO有效标记,应用MRI扫描可观察到其在体内的分布,8周时MRI图像与4周时相比,干细胞由注射部位向周边发生了迁徙.建模后2、4、6、8周各时间点.A组髓核中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量均高于B组、C组和D组,差异有统计学意义(P<0.05);B组均高于C组及D组,差异有统计学意义(P<0.05);各时间点E组与B组、C组及D组相比差异有统计学意义(P<0.05);术后6、8周时A组与E组之间差异无统计学意义(P>0.05);各时间点C组和D组之间差异无统计学意义(P>0.05).结论:微囊化bMMSCs移植后能恢复兔髓核中细胞外基质含量,其效果优于单纯bMMSCs移植.
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犬同种异体椎间盘复合髓核细胞移植初探
目的:探讨同种异体椎间盘复合髓核细胞移植的转归,观察转人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因髓核细胞介入椎间盘移植的生物学效应.方法:常规分离8周龄比格犬髓核细胞,将PKH-26标记的传2代髓核细胞(NPc)和转hTERT基因髓核细胞(hTERT-NPc)分别注射入冷冻保存的同种异体椎间盘内构建组织工程化同种异体椎间盘.选择12月龄同种犬18只随机分为3组,分别植入hTERT-NPc组织工程化的同种异体椎间盘(A组)、NPc组织工程化的同种异体椎间盘(B组)以及未组织工程化的同种异体椎间盘(C组).每只犬于术后4、8、12周行正侧位X线片及MRI检查,观察移植椎间盘同宿主椎体愈合情况、移植椎间盘高度和信号变化情况；手术后12周麻醉状态下处死实验动物取L1 ～L7段脊柱标本进行生物力学测试,取移植椎间盘进行组织学观察.结果:X线及MRI检查结果显示3组移植椎间盘与宿主椎体均实现了良好的骨性融合,其中C组椎间盘术后出现了呈进展趋势的退行性改变,至移植后12周,其椎间盘高度及髓核信号比灰度值明显低于A、B两组(P＜0.05).生物力学显示术后12周时,C组移植椎间盘在屈伸和旋转方向的活动度显著性大于A、B两组(P＜0.05),A组与B组无显著性差异(P＞0.05).激光共聚焦显微镜观察到A、B组移植椎间盘髓核区域内有红色荧光细胞；光学显微镜下观察A、B两组移植椎间盘结构保持较好,外形类似软骨细胞的髓核细胞数量较多,排列较为规则；C组髓核形态保持欠佳,结构较为紊乱,髓核细胞数量明显减少,细胞形态欠饱满,退行性改变明显.RT-PCR分析显示术后12周时A组髓核内可检测到hTERTmRNA的阳性表达.结论:犬同种异体椎间盘移植后可在宿主体内存活,通过复合NPc可延缓椎间盘移植后的退行性改变；hTERT-NPc介入具有更好的保持异体椎间盘功能的潜力,有望保证同种异体椎间盘移植的远期疗效.
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基质细胞衍生因子-1在人正常和退变椎间盘中的表达、分布及意义
目的:比较人正常和退变椎间盘髓核中央区、髓核与纤维环交界区、纤维环外层、纤维环内层及软骨终板5个相邻部位的基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)的表达情况,探讨退变椎间盘SDF-1的表达在上述五个相邻部位是否具有差异.方法:获取20例腰椎间盘突出症患者的椎间盘(L4/5,病理证实为退变椎间盘组织),并纳入退变组；7例急性腰椎爆裂骨折患者的椎间盘(L3/4)及3例脊柱侧凸患者的椎间盘(L2/3,病理证实为正常椎间盘组织),纳入正常组.HE染色观察两组椎间盘的组织学结构,免疫组织化学、Western-blot、rt-PCR检测椎间盘髓核中央区、髓核与纤维环交界区、纤维环内层、纤维环外层及软骨终板5个部位的SDF-1表达情况及分布,并将退变椎间盘上述5个部位的SDF-1免疫组化积分光密度值与供者年龄、椎间盘Thompson分级作相关分析.结果:正常组的上述5个部位SDF-1免疫组化积分光密度值分别为420.87±89.93、407.80±100.76、380.02±85.05、342.89±63.76、344.06±88.97；Western-blot灰度比值分别为0.08±0.03、0.08±0.05、0.07±0.04、0.05±0.03、0.05±0.02;rt-PCR灰度比值分别为0.22±0.06、0.22±0.05、0.20±0.04、0.20±0.04、0.20±0.04.退变组上述5个部位SDF-1免疫组化积分光密度值分别为7355.13±2271.74、5959.58±2436.23、5397.49±3044.80、1605.44±825.31、361.91±104.22; Western-blot灰度比值分别为0.55±0.29、0.52±0.28、0.42±0.18、0.21±0.12、0.06±0.04;rt-PCR灰度比值分别为0.75±0.30、0.71±0.26、0.55±0.22、0.36±0.17、0.22±0.13.退变椎间盘5个部位的SDF-1表达均高于正常组(P＜0.05),且SDF-1表达量髓核中央区＞纤维环内层＞纤维环外层＞软骨终板,差异有统计学意义(P＜0.05),而髓核中央区和髓核与纤维环交界区比较无统计学差异(P＞0.05)；退变椎间盘上述5个部位的SDF-1表达与椎间盘Thompson分级、年龄呈正相关性(P＜0.05).结论:SDF-1广泛表达于退变和正常的椎间盘中,其表达在退变椎间盘中上述5个相邻部位存在差异.
关键词： 基质细胞衍生因子-1 椎间盘退变 正常椎间盘 -
氧浓度对人髓核间充质干细胞生物学特性的影响
目的:分离培养髓核来源的间充质干细胞(MSCs),比较不同氧浓度下细胞的生物学特性,探讨氧浓度对椎间盘退变机制的影响.方法:用胶原酶消化法从手术摘除的4个腰椎间盘(椎间盘Pfirrmann分级为Ⅰ级或Ⅱ级)髓核组织中分离MSCs,体外培养、传代,观察记录细胞形态.取P3代细胞,用流式细胞仪对分离得到的细胞表面抗原CD90、CD73、CD105、CD44和CD31、CD34、CD45的表达情况进行检测;用成骨、成脂、成软骨培养液诱导培养细胞,分别在21d、28d、21d时用茜素红、油红O、甲苯胺蓝对细胞进行染色,观察其成骨、成脂、成软骨能力.在三气培养箱的低氧条件(2％ O2、5％ CO2、37℃)和常规细胞培养箱的常氧条件(20％ O2、5％ CO2、37℃)下分别培养P3代细胞.通过细胞计数统计培养1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d时的细胞数量,比较不同氧浓度下细胞的生长曲线;使用Architect c8000自动生化检测仪检测培养1d、2d、3d、4d、5d时培养基的pH值和渗透压.实时荧光定量(qRT-PCR)检测不同氧浓度培养下细胞的干性基因POU家族类别5同位序列1(POU5F1,OCT4)、NANOG同位序列(NANOG)、性别决定区Y盒2(SOX2)及扩增基因细胞周期蛋白D1(CyclinD1,CCND1)、MYC (c-Myc)、低氧诱导基因低氧诱导因子2α (HIF2α,EPAS1)、能量基因三磷酸腺苷合成酶(ATP5A1)、线粒体相关基因细胞色素c氧化酶Ⅳ亚基1型同工酶(COX4I1)、线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体编码细胞色素c氧化酶Ⅰ(MT-CO1)、MT-CO2的mRNA表达情况.结果:分离培养的细胞呈典型的单层贴壁生长,纺锤样;P3代细胞免疫表型鉴定显示MSCs表面分子标记高表达CD90 (80.4％)、CD73 (99.9％)、CD105 (99.8％)、CD44 (95.9％),低表达CD31(5.3％)、CD34(4.4％)、CD45(6.8％);茜素红、油红O染色、甲苯胺蓝染色证实细胞可向骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化.根据国际干细胞治疗协会(ISCT)有关MSCs的判定标准,分离培养的细胞为髓核MSCs(NPMSCs).低氧环境下培养的细胞形态更小,更接近原始MSCs,细胞增殖更快,低氧时倍增期为31.22±1.98h,常氧时倍增期为39.56±2.02h,差异有统计学意义(P<0.05).不同氧浓度各时间点培养基的pH值、渗透压差异无统计学意义(P>0.05),且皆在适合细胞生存的范围.低氧培养下POU5F1(OCT4)、NANOG、SOX2、CCND1、MYC (c-Myc)、EPAS1、ATP5A1较常氧培养时显著性升高(P<0.05);COX4I1、TFAM、MT-CO1、MT-CO2较常氧培养时显著性降低(P
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内质网应激在酸诱导的人椎间盘髓核细胞损伤中的作用机制研究
目的:模拟人椎间盘髓核(nucleus pulposus,NP)酸性环境,研究酸诱导的内质网应激活化以及内质网应激在酸诱导的髓核细胞损伤中的作用机制.方法:体外单层培养人正常髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)系,以pH值7.4为对照,pH值7.0和6.5分别模拟正常和退变椎间盘酸性环境,培养12～72h,建立酸诱导的髓核细胞损伤模型.采用CCK8法检测髓核细胞增殖情况,透射电镜检测髓核细胞中内质网应激活化情况,免疫荧光检测内质网应激特异性标志物糖调节蛋白78 (78 kDa glucose-regulated protein,GRP78)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表达.应用4-PBA(内质网应激阻断剂)阻断内质网应激后,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;β半乳糖苷酶染色检测细胞老化.Western blot检测LC3、GATA4、p53、p21、p16、Bax、Bcl-2和Caspase3蛋白变化情况.结果:与对照组相比,酸刺激下(pH6.5组)髓核细胞整体增殖力较对照组明显下降;透射电镜下可见内质网扩张明显,膜表面积增加,内质网线粒体膜结构形成,伴线粒体肿胀;细胞免疫荧光检测提示GRP78和CHOP表达明显增加(P＜0.05).应用4-PBA后,细胞凋亡率增加,且能够显著增加酸诱导的G1期停滞及β半乳糖苷酶阳性染色率(P＜0.05).Western blot检测发现,酸刺激下,髓核细胞LC3、GATA4、p53、p21、p16、Bax和Caspase3表达增高(P＜0.05),Bcl-2表达降低(P＜0.05);应用4-PBA后可降低LC3比值和Bcl-2表达水平,并显著升高GATA4、p53、p21、p16、Bax和Caspase3(P＜0.05).结论:酸性微环境能够活化内质网应激,在酸诱导的人髓核细胞急性损伤中起保护作用.
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张力性刺激对人髓核细胞表达软骨层间蛋白的调控及机制
目的:探索张力性刺激对人椎间盘髓核细胞分泌软骨层间蛋白(cartilage intermediate layer protein,CILP)的影响及其机制.方法:选取2016年6月在我院因创伤性骨折行L4/5椎间盘摘除及相邻椎体融合手术的1例38岁男性患者的髓核组织作为细胞来源,术前MRI示该节段椎间盘组织改良Pfimnann分级为Ⅱ级,分离培养其中的髓核细胞并传代至第3代,进行力学实验.使用Flexcell 5000系统通过电脑控制气压变化来使载有细胞的塑料膜发生形变,进而对膜载体上的细胞给予不同强度、时长的张力性力学加载.实验组分为4组,均以10％的拉伸量为刺激强度,给予不同时长(6h、12h、24h、48h)的刺激,空白对照组不给予任何刺激.利用RT-qPCR技术检测各组CILP的基因表达量,选出表达变化为明显的一组,以该组的刺激时长为限,再将实验组分为3组,分别给予不同刺激强度(5％、10％、20％)的张力刺激,空白对照组不给予任何刺激,利用RT-qPCR技术检测各组CILP的基因表达.选取相比较于对照组CILP增长效应明显的力学强度和时长作为刺激条件,测定髓核细胞在该实验条件下smad3的磷酸化程度,并对髓核细胞预先给予smad3磷酸化的特异性抑制剂SIS3处理后再置于同一力学条件下,以RT-qPCR检测CILP的基因表达量,以此观察smad信号通路是否介导了张力性刺激对于髓核细胞CILP表达的调控.实验结果使用配对t检验以及单因素方差分析进行组间比较.结果:RT-qPCR结果显示,相较于空白对照组,不同刺激时长的10％张力性刺激均明显下调了CILP的表达,其中在刺激48h后对CILP的抑制效应达到大(P＜0.05);5％的张力性刺激48h后髓核细胞的CILP基因相对表达量与对照组比较无统计学差异(D0.05),10％的张力刺激48h明显降低CILP的表达(P＜0.05),20％的张力刺激48h显著提高CILP表达量(R0.05)且smad3的磷酸化水平相对于空白对照组明显增高;相对于只给予20％张力刺激的对照组,先给予SIS3预处理再给予相同力学刺激的实验组的CILP表达水平显著下调(P＜0.05).结论:张力性刺激调控髓核细胞的CILP表达,调控效应随着刺激时长和刺激强度的变化而不同;smad信号通路参与高强度的张力性刺激对CILP的上调效应.
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兔髓核组织中BNIP3表达与椎间盘退变的关系
目的:探讨兔椎间盘髓核组织中BNIP3表达量与椎间盘退变的相关性.方法:健康1月龄新西兰白兔24只,随机分为4组,每组6只.在每只动物的L4/5、L5/6和L6/7椎间盘进行纤维环穿刺术,建立椎间盘退变模型,作为实验椎间盘；穿刺椎间盘近端3个椎间盘(L1/2、L2/3、L3/4)作为正常对照椎间盘.分别于术后即刻、2、4、8周对椎间盘进行MRI及组织学评分,应用Real-time PCR定量检测髓核组织BNIP3 mRNA表达,免疫组织化学染色半定量髓核组织BNIP3表达,同时分析同一椎间盘BNIP3表达与MRI评分、组织学评分之间的相关性,并与正常椎间盘进行对照.结果:正常及手术后即刻实验椎间盘在MRI T2加权像上呈高密度,评分为1.0±0.0；手术后2周实验椎间盘信号呈不均一的高密度,评分为2.9±0.4；手术后4周实验椎间盘信号呈不均一中低密度,评分4.2±0.3；手术后8周实验椎间盘信号呈低密度,评分4.9±0.1,各时间点MRI评分比较有显著性差异(P＜0.05).组织学染色显示正常及手术后即刻椎间盘结构整齐,髓核与纤维环交界清晰,组织学评分4.0±0.0；手术后2周实验椎间盘纤维环出现小裂隙,髓核与纤维环交界轻度不清,组织学评分7.5±0.2;手术后4周实验椎间盘纤维环出现较大裂隙,髓核与纤维环交界中度不清,组织学评分10.0±1.0;手术后8周实验椎间盘正常结构丧失,髓核组织纤维化,组织学评分11.8±0.2,各时间点间组织学评分比较有显著性差异(P＜0.05).手术后即刻、2周、4周及8周实验椎间盘BNIP3 mRNA表达是正常组的1.0±0.3倍、2.0±0.1倍、2.8±0.3倍和4.2±0.2倍,与椎间盘MRI退变评分呈显著性正相关(r=0.92,P＜0.01).正常及手术后即刻实验椎间盘髓核组织BNIP3灰度值分别为55.3±6.2和60.7±4.4;而手术后2周、4周及8周实验椎间盘分别为150.4±13.4、176.0±35.1和173.6±7.9,其灰度值与椎间盘组织学评分呈显著性正相关(r=0.92,P＜0.01).结论:兔椎间盘髓核组织中BNIP3 mRNA表达量与椎间盘退变相关,BNIP3表达上调可能在椎间盘退变过程中发挥了重要作用.
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骨形态发生蛋白-2和Ⅱ型胶原在退变腰椎间盘髓核组织中的表达及意义
目的:探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和Ⅱ型胶原在退变腰椎间盘髓核中的表达及其意义.方法:应用原位分子杂交(ISH)和免疫组织化学法,检测30例(男23例,女7例)退变腰椎间盘髓核(退变组)和8例(男6例,女2例)无明显退变腰椎间盘髓核(对照组)中BMP-2和Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达情况;应用Image-Pro Plus 5.0图像分析软件测定各指标的平均灰度值.结果:退变组BMP-2的mRNA和蛋白(109.51±8.32和104.48±14.24)表达较对照组(146.93±16.35和146.38±19.53)增强(P＜0.05和P＜0.01);而退变组Ⅱ型胶原mRNA和蛋白(139.49±16.05和140.34±18.26)表达较对照组(113.09±15.28和113.72±13.59)减弱(P＜0.01).退变组中,BMP-2和Ⅱ型胶原mRNA、蛋白表达均呈一定的负相关关系(r分别为-0.602和-0.614,P＜0.01).结论:在椎间盘退变过程中BMP-2可能是一个重要的调节因子;其对椎间盘退变的调节作用与Ⅱ型胶原有一定关系;BMP-2在退变椎间盘中的表达增强可能是一种保护性的反应.
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环氧化酶2与血管内皮生长因子在突出腰椎间盘中的表达及意义
目的:探讨环氧化酶2(COX-2)、血管内皮生长因子(VEGF)在突出腰椎间盘中的表达及其意义.方法:62个突出椎间盘标本取自58例腰椎间盘突出症手术患者,包括突起型22个,破裂型20个,游离型20个.取材部位分别为突出组织或游离组织(A部位)和椎间隙残余髓核组织(B部位).对照组取自4例新鲜年轻尸体的L3/4、L4/5及L5/S1椎间盘组织共12个标本,取材部位为椎间盘边缘(A部位)和中央髓核(B部位);应用免疫组化法对各组标本中C0X-2和VEGF的表达进行检测:应用图像分析系统测量标本中COX-2和VEGF表达量的平均光密度值.结果:在腰椎间盘突出组,特别是破裂型和游离型组的突出组织中存在富含新生血管的肉芽组织,COX-2和VEGF染色阳性细胞主要表达于肉芽组织中及突出组织的椎间盘细胞中,对照组未见阳性染色细胞.在突出组的A部位从突起型、破裂型到游离型COX-2和VEGF的表达均逐渐增高,差异有显著性(P＜0.01).突出组的A部位COX-2和VEGF的表达明显高于B部位(P＜0.01).腰椎间盘组织中COX-2和VEGF的表达存在明显相关性(r=0.855,P＜0.01).结论:COX-2、VEGF参与腰椎间盘退变、突出的发病过程;随着腰椎间盘退变突出的进展,COX-2、VEGF的表达均逐渐增高:COX-2与VEGF表达密切相关.
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阿伦磷酸钠联合肾骨安对去势小鼠终板结构和椎间盘退变的影响
目的:观察阿伦磷酸钠(alendronate,ALN)联合补肾中药——肾骨安(herbs,HB)对去势小鼠椎体终板、椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IVDD)的影响,初步探讨ALN+HB干预IVDD的作用机制.方法:32只12周龄健康雌性C57BL/6J小鼠,随机分为正常对照组(对照组,n=8)、去卵巢组(OVX组,n=8)、ALN组(n=8)及ALN+HB组(n=8).对照组行假手术,其余各组行双侧卵巢摘除.术后3d开始给药,连续给药2个月后取材,HE及番红O-固绿染色观察椎间盘组织形态学改变并进行病理评分,显微计算机断层扫描(u-CT)检测终板表面孔隙变化及附近骨赘增生情况,免疫组织化学法检测椎间盘中Ⅱ型胶原(Collagen-typeⅡ,Col2)的表达.结果:实验过程中无小鼠死亡.HE及番红O-固绿染色对照组椎间盘结构和形态基本正常;OVX组椎间盘终板发生严重骨化重塑,以下位终板更为明显,同时出现终板与髓核的边界结构紊乱,椎间盘基质的丢失及裂隙形成;A LN组终板骨化重塑较OVX组轻,髓核结构形态改善,软骨终板内仍可见一些小的骨化区:ALN+HB组终板骨化重塑不明显,番红O固绿染色染色可见软骨终板着色加深.IVDD病理评分、终板表面孔隙率(％)和Col2积分光密度(IOD)值分别为1.20±0.84、28.60±4.04和27764.7±1958.2,OVX组为4.00±1.58、56.80±9.39和17213.6±1021.3,ALN组为2.40±0.89、36.20±3.42和18921.4±888.1,ALN+HB组为2.00±0.71、29.60±6.19和23420.1±2439.6.OVX组与对照组比较IVDD病理评分、终板孔隙率均显著性升高(P＜0.05);ALN组、ALN+HB组与OVX组比较二者均显著性降低(P＜0.05);ALN组、ALN+HB组与对照组比较,及ALN+HB组与ALN组比较二者均无统计学差异(P＞0.05).OVX组、ALN组和ALN+HB组与对照组比较Col2 IOD值均显著性降低(P＜0.05).ALN组与OVX组比较无统计学差异(P＞0.05),ALN+HB组与OVX组、ALN组比较均显著性升高(P＜0.05).结论:OVX小鼠雌激素缺乏可引起椎体终板的骨化重塑及孔隙率增加,导致IVDD.ALN及ALN+HB均可以抑制椎体终板的重塑,降低终板孔隙率,保证终板结构和功能完整,从而能延缓雌激素缺乏相关IVDD,ALN+HB效果更为明显.
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1-磷酸鞘氨醇受体在不同退变程度髓核组织中的表达变化
目的:比较不同退变程度人椎问盘髓核组织中3种1-磷酸鞘氨醇受体(S1PR1/2/3)表达水平的差异,探讨椎间盘中S1PR表达水平与椎间盘退变的关系.方法:收集腰椎间盘退行性病变患者手术切除的椎间盘组织,其中轻度退变(Pfirrmann分级Ⅳ级)22例,严重退变(Pfirrmann分级Ⅴ级)14例;同时取6例无椎间盘退变患者(单纯腰椎椎体骨折,Pfirrmann分级Ⅱ级)手术切除的椎间盘组织作为对照组;通过HE染色以及Saf-O染色观察不同退变程度椎间盘的组织学变化,免疫组化检测不同退变程度组织中的S1PR表达水平;Ⅱ型胶原酶消化分离提取原代髓核细胞,通过Real-time PCR、Western-bolt检测不同退变程度椎间盘髓核细胞中S1PR的表达水平,并通过细胞免疫化学方法对S1PR进行定位.结果:HE染色及Saf-O染色结果显示退变椎间盘的纤维环出现破损,髓核细胞形成明显的集落,细胞外基质减少.免疫组化结果显示正常和轻度退变的髓核组织中3种受体(S1 PR1/2/3)都有表达,严重退变的组织中表达极弱;Real-time PCR结果显示对照组髓核细胞中S1PR1/2/3的mRNA表达水平分别是严重退变组的5.34±0.52倍、7.25±0.04倍、1.92±0.06倍,轻度退变组S1PR1/2/3的mRNA表达水平分别是严重退变组的4.35±2.45倍、4.96±3.44倍、2.19±0.82倍;Western-blot发现对照组和轻度退变组髓核细胞中S 1PR 1/2/3均有表达,严重退变组表达水平较低;免疫细胞化学显示S1PR主要集中在髓核细胞的细胞质和细胞膜上.结论:髓核组织中主要表达S 1PR 1/2/3,在严重退变的髓核组织和细胞中其表达水平明显下降,S1P及其受体可能参与椎间盘髓核组织的退变过程.
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直立体位下无创轴向加载建立兔椎间盘退变动物模型
目的:通过直立体位下无创性轴向加载的方式,建立一种新型兔腰椎间盘早期退变的动物模型.方法:24只4月龄雄性新西兰大白兔随机分为实验组及对照组.将实验组动物置于特制筒内使之保持直立体位,并自颈部施以600g轴向载荷,每日6h;对照组动物不接受任何处理而常规饲养.在实验开始前及实验开始后4周、8周、12周时对全部动物行X线及MRI检查,观察实验组动物在筒内时腰椎的骨性结构,通过椎间盘高度指数(disc height index,DHI)测量,比较两组动物侧卧位时L2/3、L4/5和L6/7节段椎间隙高度改变;通过髓核相对灰度值测量比较两组动物髓核含水量变化.14周后全部动物处死,取L5/6节段胶冻状髓核组织,应用rt-PCR检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达水平;取L6/7节段椎间盘连同上、下各1mm软骨下骨,应用HE及天狼星红染色观察各组动物椎间盘组织结构改变.结果:2只实验组动物在实验过程中死亡,其对应的实验数据从结果中剔除.腰椎X线片显示,在直立体位负重条件下,实验组兔腰椎形成明显后凸,较侧卧位下腰椎间隙明显变窄,在L2/3节段,直立体位下椎间隙高度为侧卧位时的75.1％(P＜0.05);在L4/5节段为54.8％(P＜0.05);在L6/7节段为47.9％(P＜0.05).DHI测量显示两组动物腰椎各节段DHI在任何时间点均无显著差异(P＞0.05).MRI结果显示,在L2/3节段,实验组与对照组髓核灰度值在任何时间点均无统计学差异(P＞0.05),在L4/5节段,实验组与对照组髓核相对灰度值在12周时开始具有显著差异(P＜0.05);在L6/7节段,两组间在8周时即开始有显著性差异(P＜0.05).rt-PCR结果显示,实验组Ⅰ型胶原mRNA表达明显高于对照组(3.57倍,P＜0.05);而Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达明显低于对照组(分别为0.35倍和0.43倍,P＜0.05).病理学检查显示对照组与实验组椎间盘组织结构存在显著差异,对照组髓核组织与纤维环间边界清晰,髓核内富含均匀分布的髓核细胞;实验组内层纤维环明显增生,而髓核区域相应减小.结论:直立体位下无创性轴向加载方式可显著加速兔腰椎间盘的退变进程,其在发病机理上与人类椎间盘退变更加相似,该腰椎间盘退变动物模型操作简单、可重复性强.
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应用纤连蛋白片段建立椎间盘退变动物模型
目的:探讨应用N端30kDa纤连蛋白片段(Fn-f)建立模拟人类椎间盘退变规律的椎间盘退变动物模型的可行性,为椎间盘退变的防治提供实验模型及实验依据.方法:选取雄性6月龄新西兰大白兔28只,麻醉后使用30G微量注射针和微量注射器,在透视引导下经皮将25μl 1.5μmol/L Fn-f(Fn-f组)或25μl磷酸缓冲液(PBS,0.01mol/L,pH值7.2;PBS组)随机分别注射入不同节段的腰椎间盘中心区.分别于注射4、8、12、16周后获取椎间盘,对椎间盘进行组织学检测(HE、Masson三色及番红O染色),并以RT-PCR法对椎间盘聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的基因表达水平进行分析.结果:与注射PBS椎间盘相比,注射Fn-f椎间盘造模后4周时椎间盘的髓核、纤维环结构以及胞外基质蛋白聚糖等无明显差别；8周时髓核细胞数量减少、细胞簇状分布,被胞外基质分隔开来,纤维环层状结构排列部分出现紊乱,蛋白聚糖染色变浅；12和16周时髓核细胞数量明显减少,细胞变圆,呈明显的成簇聚集分布,纤维环排列明显不规整,各层间出现裂隙,甚至断裂,蛋白聚糖染色明显变浅,甚至部分未见染色.Fn-f组椎间盘聚集蛋白聚糖mRNA表达水平在8、12和16周3个时间点均明显低于PBS组(P＜0.05)；Ⅱ型胶原mRNA表达水平在12和16周时明显低于PBS对照组(P＜0.05).结论:透视引导下兔椎间盘内注射N端30kDa Fn-f可诱导椎间盘产生渐进性退行性病变,该法建立的动物模型可作为研究椎间盘退变的发病机制及防治的实验模板.
