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CD36介导氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞泡沫化和凋亡
为探讨清道夫受体CD36在氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞泡沫化和凋亡中的作用,用氧化型低密度脂蛋白温育U937细胞,观察U937细胞泡沫化过程中CD36的表达时序和泡沫细胞的凋亡;用CD36单克隆抗体阻断U937细胞的吞噬作用,观察U937细胞吞噬蓄积胆固醇和细胞凋亡的改变.细胞胆固醇以修饰的酶荧光法测定;用流式细胞术检测异硫氰酸荧光素-抗CD36单克隆抗体特异标记的CD36和细胞的凋亡情况;用逆转录聚合酶链反应检测CD36mRNA的表达.结果发现,80mg/L氧化型低密度脂蛋白与U937细胞温育24h可增加细胞内总胆固醇,48h时可形成典型的泡沫细胞;CD36表达呈现时序性改变,6h即可检出CD36表达增高,24h达到高值,48h表达略有降低,CD36mRNA的转录与CD36的表达一致.用200 mg/L 氧化型低密度脂蛋白与U937细胞温育24 h 可见U937细胞出现凋亡,48h后凋亡峰明显,预先用CD36单克隆抗体阻断可使氧化型低密度脂蛋白致U937细胞凋亡明显减少.实验结果提示,CD36介导U937细胞吞噬蓄积氧化型低密度脂蛋白形成泡沫细胞,并终出现凋亡;内吞蓄积的氧化型低密度脂蛋白对CD36无负反馈调节.
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脂肪分化相关蛋白对泡沫细胞形成中脂质蓄积的影响
动脉粥样硬化是一种常见的心血管代谢性疾病,它的主要并发症心肌梗死与缺血性脑卒中已经成为世界首要的死因.泡沫细胞的形成在动脉粥样硬化的发生和发展中起到关键作用.这些细胞的产生与细胞内脂质蓄积密切相关.脂肪分化相关蛋白(PLIN2)能够促进细胞内脂质蓄积.本文主要阐述在泡沫细胞形成中,PLIN2对于脂质蓄积的影响,为动脉粥样硬化防治提供新的思路.
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斑块内泡沫细胞外迁功能障碍的研究进展
泡沫细胞的形成及外迁受抑是动脉壁斑块恶性重塑的关键环节,糖基化终末产物(AGE)则是糖尿病加速动脉粥样硬化进展的重要推手.基于国内外新进展及本课题组已有成果,文章阐述了清道夫受体CD36在介导AGE关键活性成分羧甲基赖氨酸抑制泡沫细胞外迁中的作用及机制,希冀为今后靶向泡沫细胞外迁机制的治疗策略提供新的切入点.
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动脉粥样硬化中单核细胞招募与泡沫细胞形成
动脉粥样硬化是一种慢性炎症疾病,单核细胞和激活的内皮细胞间的相互作用在动脉粥样硬化病变进程中起着关键性的作用.在动脉粥样硬化的早期阶段,单核细胞在黏附分子和细胞因子的作用下进入内膜并分化为巨噬细胞.在受体和胞饮介导下,分化而来的巨噬细胞对内膜下的脂质进行摄取,脂质负荷的巨噬细胞转化为泡沫细胞,大量泡沫细胞的蓄积将形成动脉粥样硬化的脂质核心.
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高密度脂蛋白抗炎症到促炎症的转变
高密度脂蛋白具有抗炎症的特性.高密度脂蛋白促进胆固醇外流的功能对预防心血管疾病有重要的作用,同样,其抗炎症特性也具有非常重要的作用.高密度脂蛋白在免疫系统中发挥着重要的作用,在不发生急性相反应的条件下能发挥抗炎症作用,反之,则有促进炎症发生的作用.高密度脂蛋白的抗炎症特性主要是其内容物所决定的,在发生急性相反应时,其组成成分发生改变,从而促进了高密度脂蛋白从抗炎症到促炎症的转变.
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巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中载脂蛋白E基因表达的变化
研究单核-巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中细胞载脂蛋白E表达的变化.以佛波醇酯(10-7mol/L)诱导人单核细胞性THP-1细胞分化为巨噬细胞(72 h),再以氧化型低密度脂蛋白(50 mg/L)刺激巨噬细胞形成泡沫细胞(48 h),用逆转录-聚合酶链反应检测这一过程中载脂蛋白E在mRNA水平上的变化.结果显示,单核细胞分化为巨噬细胞的同时伴随着载脂蛋白E表达的增加,巨噬细胞吞噬脂质转化为泡沫细胞后载脂蛋白E的表达进一步增加.
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动脉粥样硬化实验研究模型百年回溯
自从1908年俄国病理学家Ignatowski用蛋和奶喂饲家兔引发动脉粥样硬化病变至今整整一百年.经过一个世纪的变迁,动脉粥样硬化实验模型的研究有了巨大发展,不仅品种增多,而且在机制研究方面有根本性突破.然而,这与,临床医学相关领域的突飞猛进发展的需要仍不相适应.值此百年之际,特撰此文,对动脉粥样硬化实验模型的研究现状和方向作一简述.
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肥大细胞对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响
目的检测大鼠腹腔肥大细胞(mast cell, MC)对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响.方法 SD大鼠体重约200 g,雌雄不限,供采集MC和原代培养平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC).采用梯度密度离心分离MC,提取MC上清液(含MC释放的各种炎症介质).用MC上清液和氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)处理SMC,实验分四组:对照组SMC在5 mL含10%小牛血清的DMEM中培养48 h;oxLDL组SMC在5 mL含10%小牛血清的DMEM中(含oxLDL,终浓度为100 mg/L)培养48 h;MC上清液组SMC在5 mL含10%小牛血清的MC上清液(由含1×106个MC的细胞悬液提取)中培养48 h;MC上清液+oxLDL组SMC在5 mL含10%小牛血清的MC上清液(由含1×106个MC的细胞悬液提取)中(含oxLDL,终浓度为100 mg/L)培养48 h.采用油红O染色检测SMC泡沫化.RT-PCR检测SMC Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达,PCR引物序列Ⅰ型胶原为5'-GAC ACT GAA CCC TTT GTA ATG-3'和5'-GTG AAA CTC CCG TCT GCT-3',扩增片段长度为399 bp;Ⅲ型胶原引物序列为5'-AGC GGA GAA TAC TGG GTT-3'和5'-TGT AAT GTT CTG GGA GGC-3',扩增片段长度为288 bp;内参照采用β-actin,引物序列为5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3'和5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3',扩增片段长度为548 bp.免疫细胞化学染色检测SMC Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达.结果油红O染色显示MC上清液可加速SMC泡沫化.RT-PCR结果发现,与对照组SMC相比,用oxLDL或MC上清液分别单独处理SMC 48 h后,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA表达均降低,用oxLDL和MC上清液同时处理SMC 48 h后,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA表达降低更明显.免疫细胞化学染色显示,对照组SMC细胞浆内有大量棕色颗粒,颗粒粗大而染色深,说明对照组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达为强阳性;用oxLDL或MC上清液分别单独处理SMC 8 h后,细胞浆内棕色颗粒少而染色浅,说明Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达均明显降低;用oxLDL和MC上清液同时处理SMC 48 h后,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达降低更明显.结论 MC在体外抑制SMCⅠ型胶原和Ⅲ型胶原表达,并且能协同oxLDL对Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的抑制作用.因此MC释放的炎症介质也许参与了动脉粥样斑块纤维帽的重构.
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槟榔碱对泡沫细胞胆固醇流出和ABCA1表达的影响
目的 探讨槟榔碱对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的鼠源性巨噬细胞性泡沫细胞形成的影响及可能机制.方法 采用体外培养的鼠源性巨噬细胞株作为研究对象,加入ox-LDL (50 mg/L)诱导泡沫细胞,同时加入不同浓度的槟榔碱处理,油红0染色进行形态学观察,高效液相色谱法测定细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)的水平,3H标记的胆固醇测定胆固醇流出率.采用实时定量PCR和蛋白印迹法分别检测细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A1( ABCA1)的表达.结果 ox-LDL处理48 h后,与正常巨噬细胞相比,油红O染色阳性细胞显著增加,细胞体积明显增大,形态多呈圆形或不规则形；槟榔碱(10-6、10-5和10-4mol/L)组油红O染色阳性细胞数比泡沫细胞模型组显著减少,细胞体积明显缩小.与泡沫细胞模型组相比,槟榔碱(10-5和10-4mol/L)显著性降低细胞内TC、FC、CE水平及CE/TC,显著性增加细胞胆固醇流出率和ABCA1的表达.结论 槟榔碱抑制ox-LDL诱导的鼠源性巨噬细胞性泡沫细胞形成,上调泡沫细胞中ABCA1的表达.
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尼曼匹克病C型诊疗新进展
尼曼匹克病C型（NPC）是一种常染色体隐性遗传的溶酶体脂质贮积病，主要累及内脏器官和神经系统，自婴幼儿至成人均可发病，儿童期多见。新生儿期持续存在的胆汁淤积性黄疸、脾脏肿大、猝倒发作和垂直性核上性眼肌麻痹为该病的特征性表现，因发病年龄不同，首发的神经系统症状不一致，临床有明显的异质性。NPC基因缺陷导致游离胆固醇转运障碍，在细胞内大量沉积是疾病的始发因素，细胞的自噬功能障碍、钙稳态失平衡、氧化应激等均参与疾病的病理生理过程。通过皮肤成纤维细胞培养发现异常沉积的游离胆固醇或行基因检查发现NPC的致病性突变可确诊该病。美格鲁特是唯一被批准上市的特效药物，早期应用可以改善神经系统症状和延缓疾病的进展。
关键词： 尼曼匹克病C型 脾脏肿大 垂直性核上性眼肌麻痹 泡沫细胞 美格鲁特 -
过表达KLF4对RAW264.7巨噬细胞ABCA1表达和胆固醇蓄积的影响
目的 观察KLF4过表达对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)胆固醇蓄积的影响及对ATP结合盒转运蛋白A1 (ABCA1)表达的影响. 方法 构建KLF4过表达的RAW264.7细胞株.将细胞分为三组:对照组、ox-LDL组、KLF4过表达+ox-LDL组,后两组加入终浓度为30 μg/mL的ox-LDL处理24 h.分别运用油红O染色观察细胞质脂滴变化,高效液相色谱法(HPLC)检测细胞内总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC)含量,Westem blot法检测各组细胞ABCA1及KLF4蛋白表达. 结果 泡沫细胞模型组的细胞内存在大量的红色脂滴,KLF4及ABCA1蛋白表达及胆固醇含量较对照组升高；KLF4过表达细胞经ox-LDL处理后,细胞内脂滴较模型组明显减少,胆固醇含量下降,ABCA1蛋白表达进一步升高. 结论 KLF4可上调巨噬细胞ABCA1的表达,抑制ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞胆固醇蓄积.
关键词： KLF4 泡沫细胞 ATP结合盒转运蛋白A1 动脉粥样硬化 -
亲环素A在ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞泡沫化过程中的作用
目的 观察亲环素A在ox-LDL(氧化低密度脂蛋白)诱导血管的平滑肌细胞中的作用. 方法 不同浓度(0、20、40、80、160 mg/L)ox-LDL与大鼠血管平滑肌细胞共同孵育,进而选择80 mg/L ox-LDL与细胞共同孵育不同的时间(0、24、48、72、96 h),用免疫印迹(Western blot)检测亲环素A蛋白质的表达改变.高效液相色谱法(HPLC)检测细胞内胆固醇含量. 结果 随ox-LDL浓度增加和孵育时间延长,亲环素A蛋白质的表达均逐渐减弱.HPLC显示80 mg/L ox-LDL孵育细胞72 h组细胞胆固醇酯/总胆固醇比值为57.9%(>50%),符合泡沫细胞特征. 结论 ox-LDL可降低血管平滑肌细胞中亲环素A的蛋白表达并诱导泡沫细胞形成.
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U937细胞泡沫化前后血管内皮细胞生长因子表达的变化
目的 检测U937细胞泡沫化前后血管内皮细胞生长因子(VBGF)表达的差异,探讨VBGF在动脉粥样硬化发生发展中的可能作用.方法 用80μg/mL ox-LDL加入U937中共同孵育48 h,使其泡沫化,取泡沫化前后上清液检测VEGF表达,凝胶成像系统分析结果.结果 U937细胞泡沫化前后VEGF表达有羔异,泡沫化后VEGF表达明显增强.结论 U937细胞泡沫化过程中VEGF表达明显升高.
关键词： 动脉粥样硬化 U937 泡沫细胞 血管内皮细胞生长因子 -
苦瓜蛋白通过肝X受体α上调三磷酸腺苷结合盒转运体A1表达
目的 观察苦瓜蛋白对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)及肝X受体α(LXRα)表达的变化和细胞内胆固醇流出的影响,探讨苦瓜蛋白抗动脉粥样硬化的机制.方法 加入50 mg/L的ox-LDL共同孵育细胞24h,诱导THP-1单核巨噬细胞成泡沫细胞.分别加入0、0.5、1.5、4.5 mg/ml苦瓜蛋白或4.5 mg/ml苦瓜蛋白处理THP-1细胞0、3、6、12、24h,以检测其浓度效用和时间效用.MTT法检测苦瓜蛋白的细胞毒性,液体闪烁计数法测胆固醇流出.实时荧光定量PCR和Western blot分别检测ABCA1、LXRα的mRNA和蛋白水平,设计合成LXRα-siRNA序列,并转染THP-1细胞,Western blot法评估沉默效果.结果 苦瓜蛋白浓度低于4.5 mg/ml对THP-1细胞无毒性,并浓度和时间依赖性地促进胆固醇流出和上调ABCA1及LXRα表达水平,以4.5 mg/ml苦瓜蛋白作用效果强;使用LXRα-siRNA沉默LXRα后,ABCA1的mRNA和蛋白表达水平均显著下降(P＜0.05),胆固醇流出显著减少.结论 苦瓜蛋白可通过LXRα途径上调ABCA1的表达促使THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出.
关键词： 动脉粥样硬化 泡沫细胞 苦瓜蛋白 肝X受体α 三磷酸腺苷结合盒转运体A1 -
苦瓜蛋白抑制THP-1源性巨噬细胞泡沫化与下调ACAT1的表达有关
目的 研究苦瓜蛋白对THP-1源性泡沫细胞的影响,阐明是否与影响脂酰CoA-胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)的表达有关.方法 MTT法检测苦瓜蛋白(0、1、2、3、4、5 mg/ml)的细胞毒性,以50 μg/ml oxLDL处理THP-1源性巨噬细胞48 h,建立THP-1源性泡沫细胞模型,以0、0.5、1.5、4.5 mg/ml苦瓜蛋白分别作用24 h.油红0染色检测细胞内脂质,高效液相色谱检测胆固醇和胆固醇酯.Western blot检测ACAT1的表达.结果 MTT实验结果显示,低于5 mg/ml的苦瓜蛋白对THP-1细胞的存活率没有明显影响.油红0染色可见,随着苦瓜蛋白浓度增加,泡沫细胞内脂滴逐渐减少.高效液相色谱分析发现,1.5 mg/ml苦瓜蛋白处理组的总胆固醇的峰面积显著低于泡沫细胞模型组(P＜0.05);游离胆固醇(FC)、胆固醇酯(CE)都显著低于泡沫细胞模型组(P＜0.05),泡沫细胞模型组的CE含量高于FC(P＜0.05),苦瓜蛋白处理组的CE值明显低于FC值(P＜0.05).Western blot结果显示泡沫细胞模型组的ACAT1蛋白表达显著上调(P＜0.05),苦瓜蛋白处理组中的ACAT1蛋白表达水平显著低于泡沫细胞组(P＜0.05),但仍高于对照组(P＜0.05).结论 苦瓜蛋白能浓度依赖性地减少THP-1源性泡沫细胞内脂质含量,其与下调ACAT1的表达有关.
关键词： 苦瓜蛋白 泡沫细胞 氧化低密度脂蛋白 脂酰CoA-胆固醇酰基转移酶 -
高效液湘色谱检测高密度脂蛋白转运荷脂巨噬细胞内胆固醇的生物学活性
目的 应用U937泡沫细胞模型建立一种新的检测高密度脂蛋白(HDL)外运细胞内胆固醇生物学活性的方法.方法 将U937细胞与100μg/Ml氧化低密度脂蛋白孵育36 h后,分别用不同浓度高密度脂蛋白处理24h,应用高效液相色谱(HPLC)检测细胞内胆固醇和胆固醇酯含量.结果 经氧化低密度脂蛋白处理后的U937细胞,HPLC检测细胞内总胆固醇增加,胆田醇酯含量大于胆固醇含量;经高密度脂蛋白处理后,细胞内胆固醇含量减少,不同厂家及不同批次的高密度脂蛋白外运胆固醇的生物学活性有所不同.结论 经氧化低密度脂蛋白处理后的U937细胞可以作为检测高密度脂蛋白外运胆固醇生物学活性的方法.
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胆固醇流出对氧化性低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡的影响
目的 探讨胆固醇流出对氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡的影响.方法 采用高效液相分析法检测细胞内胆固醇含量;用液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 用ox-LDL处理RAW264.7细胞48h后,细胞内胆固醇明显增加,同时细胞的凋亡率也随之明显增加;而用胆固醇流出刺激物高密度脂蛋白3和β-环糊精处理细胞后,细胞内胆固醇流出显著增加.细胞内总胆固醇明显减少,细胞凋亡率也下降明显.而用胆固醇流出阻断物BFA后,细胞内胆固醇流出明显下降,高密度脂蛋白对细胞的保护作用被明显的削弱.结论 促细胞内胆固醇流出能够抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞的凋亡.
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液相色谱-质谱联用法测定U937细胞内胆固醇
目的利用液相色谱-质谱联用法测定细胞内胆固醇及胆固醇酯,建立一种精确鉴定泡沫细胞的方法.方法用氧化修饰低密度脂蛋白(oxidized loW density lipoprotein,oxLDL)干预U937巨噬细胞诱导泡沫细胞形成,然后用己烷/异丙醇(体积比3/2)抽提细胞内胆固醇及胆固醇酯,抽提液经真空干燥后再溶于甲醇,用液相色谱-质谱联用法直接测定细胞内游离胆固醇,胆固醇酯经胆固醇酯酶水解后测定总胆固醇,总胆固醇减去游离胆固醇即胆固醇酯.抽提脂质后的沉淀物溶于氢氧化钠溶液中,用BCA法测定蛋白含量,胆固醇及胆固醇酯用μg/mg细胞蛋白为单位来表示.结果氧化低密度脂蛋白干预后的巨噬细胞内存在高水平胆固醇及胆固醇酯的蓄积.在100μg的oxLDL处理组中,胆固醇酯与阴性对照组差异存在显著性[(25.733±2.970)μg/mg细胞蛋白vs(13.024±2.875)μg/mg细胞蛋白,P＜0.01],同样胆固醇的水平差异也存在显著性[(18.675±1.315)μg/mg细胞蛋白vs(24.428±2.370)μg/mg细胞蛋白,P＜0.01].结论液相色谱-质谱联用法测定细胞内胆固醇是一种鉴定泡沫细胞简便而精确的方法.
关键词： 液相色谱-质谱联用法 泡沫细胞 U937细胞 胆固醇 胆固醇酯 -
氧化型低密度脂蛋白促进巨噬细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1表达及辛伐他汀干预研究
目的 观察氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)对大鼠腹腔巨噬细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)表达的影响,探讨LOX-1在泡沫细胞形成中的作用.方法 无菌分离、培养大鼠腹腔巨噬细胞,分别以终浓度10 mg/L,25 mg/L,50 mg/L,75mg/L,100 mg/L ox-LDL与巨噬细胞共孵育24 h,以RT-PCR和Western blotting检测LOX-1基因表达水平;以终浓度75 mg/L ox-LDL与巨噬细胞分别共孵育0.5 h,3 h,6 h,12 h,24 h和36 h后检测LOX-1表达水平;以不同浓度辛伐他汀预处理巨噬细胞后,再与ox-LDL共培养,检测LOX-1基因表达.结果 ox-LDL终浓度为10～75 mg/L时,随着浓度增大,LOX-1mRNA和蛋白表达均增强,75 mg/L时达高峰,ox-LDL 100 mg/L时LOX-1表达显著降低(均P＜0.05);自ox-LDL与巨噬细胞共孵育6 h开始,LOX-1表达逐渐增强,24 h达高峰,36h时LOX-1表达下降(均P＜0.01);不同浓度辛伐他汀均使LOX-1表达降低,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 ox-LDL在一定范围内以剂量和时间依赖方式增强大鼠腹腔巨噬细胞LOX-1表达,LOX-1在巨噬细胞摄入ox-LDL的过程中可能具重要作用,辛伐他汀可抑制巨噬细胞LOX-1表达.
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新型干细胞iPSCs-MSCs对泡沫细胞胆固醇含量的影响及调节机制研究
目的 探讨新型干细胞iPSCs-MSCs对巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇含量的影响及可能的调控机制.方法 运用泡沫细胞模型,采用transwell的方式将iPSCs-MSCs与THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞共培养后,使用试剂盒测定细胞内胆固醇的含量,收集细胞培养液用ELISA法检测TNF-α、IL-6的浓度,Western blot和实时荧光定量PCR检测细胞内ATP结合盒转运子A1(ABCA1)的表达.结果 与iPSCs-MSCs共培养后泡沫细胞内胆固醇的含量减少,培养基中TNF-α、IL-6浓度显著降低,ABCA1 mRNA和蛋白水平表达增加(P＜0.05),Notch 1 mRNA和蛋白水平表达下降(P＜0.05).结论 iPSCs-MSCs可以下调巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇的含量,该过程可能与上调ABCA1表达及抑制Notch信号通路而减少炎症因子释放有关,提示iPSCs-MSCs有预防和治疗动脉粥样硬化的前景.
关键词： iPSCs-MSCs 泡沫细胞 炎症因子 ABCA1 Notch1
