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沉默Peroxiredoxin Ⅰ基因增强乳腺癌细胞放射敏感性及其作用机制的实验研究
目的 采用RNA干扰技术沉默过氧化物酶Ⅰ(peroxiredoxin Ⅰ,PrxⅠ)基因,观察乳腺癌MCF-7细胞对X线敏感性变化,探讨其作用机制.方法 将Prx ⅠshRNA真核表达载体pGPU6-Prx Ⅰ和阴性对照质粒pGPU6-HK转染入乳腺癌MCF-7细胞中,经G418稳定筛选后RT-PCR和Western blot检测PrxⅠ表达变化.6 MV X线照射6 Gy后48 h,流式细胞术检测细胞的活性氧水平、细胞周期和细胞凋亡；MTT法测定细胞增殖能力；克隆形成实验观察克隆形成率,计算Do、N、Dq、SF2及放射增敏比(sensitive enhancement ratio,SER)等放射生物学参数,Western blot法检测Rad51及γ-H2 AX蛋白变化.结果 获得2个稳定转染细胞株:pGPU6-HK和pGPU6-Prx Ⅰ.RT-PCR和Western bolt检测显示pGPU6-Prx Ⅰ组中Prx Ⅰ mRNA和蛋白表达均明显抑制.6 Gy的X线照射48 h后,pGPU6-Prx Ⅰ及联合照射(ionizing radiation,IR)组细胞中的活性氧水平、G1期细胞和细胞凋亡明显增加,而细胞增殖能力和S期细胞明显降低,Western blot分析表明Rad51蛋白表达降低,而γ-H2 AX蛋白表达升高(P＜0.05),以pGPU6-Prx Ⅰ+IR组变化显著,其Rad51蛋白表达下降了79.3%,而γ-H2AX蛋白表达升高了3.7倍.pGPU6-PrxⅠ组细胞的Do、N、Dq和SF2值分别为1.354、3.106、1.547和0.504,均低于pGPU6-HK组,SF2时的SER为1.353.结论 下调PrxⅠ基因表达可提高乳腺癌MCF-7细胞的放射敏感性,其作用机制与细胞内活性氧清除能力减弱、DNA双链断裂增加及DNA损伤后修复能力降低有关.PrxⅠ可能是1个理想的肿瘤放射增敏分子靶点.
关键词： Peroxiredoxin Ⅰ 放射敏感性 活性氧 基因沉默 -
MTT法在测定细胞放射敏感性中的运用
本研究用MTT法和细胞克隆计数法检测了人肺腺癌细胞株A549在不同剂量X射线照射后的存活分数，发现在一定照射剂量内两种方法相关性较好。1 材料和方法 细胞培养：人肺腺癌细胞株A549由附属新桥医院全军呼吸内科研究所提供。培养在含有10%小牛血清，青-链毒素（各100 U/ml）的RPMI-1640培养液中。 X线照射：在室温下，Varian 2300直线加速器6 MV-X线照射，加3 cm标准等效填充物，平均剂量率2 Gy/min。 细胞存活分数测定：将处于对数生长期的细胞分为4组，分别照射0、2、6、10 Gy后，立即制成单细胞悬液，然后分别运用MTT法和细胞克隆计数法测定细胞存活分数。
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人骨肉瘤细胞HOS锎-252中子放射敏感性的研究
目的观察锎-252中子治疗骨肉瘤的效果.方法人骨肉瘤细胞HOS用铱-192γ射线和锎-252中子射线分别以不同的剂量照射,MTr法绘出细胞存活曲线,经典的克隆形成分析测算D0、Dq和SF2值,彗星分析法检测照射后细胞的DNA损伤情况.结果MTT法、克隆形成分析和彗星分析法3种方法的实验结果均表明HOS细胞对锎-252中子射线更为敏感.由克隆形成分析得到锎-252中子射线和铱-192γ射线照射HOS细胞的D0值分别是2.80和3.34,Dq值分别是2.66和3.07,SF2值分别是0.596和0.684.锎-252中子射线和铱-192γ射线以200、500、1 000 cGy 3个剂量照射HOS细胞后,碱性彗星尾力矩分别是(6.664±0.648)、(20.322±1.433)、(33.909±1.245)和(4.760±O.528)、(15.203±1.272)、(27.375±1.315)(P＜0.05).结论锎-252中子对HOS细胞的杀伤效果优于铱-192γ射线,说明锎-252中子放射治疗骨肉瘤可能是一种具有发展潜力的放射治疗方法.
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Clusterin与肿瘤的放射敏感性
Clusterin(CLU)又名聚集素,由Blaschuk等[1]于1983年首次从山羊睾丸网液(ram fete testis fluid)中分离出来,因其介导支持细胞聚集而得名.由于其在细胞凋亡、周期调节、DNA损伤、修复等中起重要作用而逐渐受到人们重视,大量研究表明其表达情况与肿瘤的放射敏感性存在重要相关性.
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人胰腺癌PANC-1细胞株中不同亚群放射敏感性的比较分析
目的：研究人胰腺癌PANC‐1细胞株中干性细胞放射敏感性，并探讨其放射抗拒的可能机制。方法应用流式细胞仪分选CD44＋CD24＋、CD44－CD24＋、CD44＋CD24－和CD44－CD24－细胞亚群；照射后，计算放射增敏比；利用流式细胞术检测凋亡及周期分布，并结合DCFH‐DA探针检查各亚群活性氧簇（ROS）水平。结果 PANC‐1细胞中CD44＋细胞比例约为92．0％， CD24＋细胞比例约为4．7％。照射前4组凋亡差异无统计学意义（ P＞0．05）；照射后CD44＋ CD24＋的凋亡比例低（ P＜0．01）。照射前后CD44＋CD24＋的G0／G1期比例高，显著高于其他3组（ P＜0．01）。照射后CD44＋ CD24－、CD44－CD24＋和CD44－CD24－放射增敏比分别为1．61、1．81、1．94；照射后CD44＋ CD24＋ ROS水平低，平均荧光强度显著低于其他3组（ P＜0．01）。结论人胰腺癌PANC‐1细胞株中干性细胞大多处于静止期，且低ROS水平，因此考虑胰腺癌干性细胞的放射抗拒与此有关。
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抑制磷酸腺苷激活的蛋白激酶活性增强人鼻咽癌细胞放射敏感性
目的：研究磷酸腺苷激活的蛋白激酶（A M PK ）活化程度对人鼻咽癌（N PC ）细胞放射敏感性的影响。方法应用AMPK活化抑制剂Compound C（CC）处理人 NPC CNE-2细胞1 h后，给予X线照射，48 h后Western blot检测总 AMPK（t-AMPK）、磷酸化AMPK（p-AMPK）及自噬标志物MAPlLC3的变化；透射电子显微镜检测自噬小体形成情况。经不同药物干预后的CNE-2细胞给予X线照射48 h后四甲基偶氮唑盐（MTT）和流式细胞技术检测两组细胞活力和凋亡变化。结果 CNE-2细胞经CC干预后t-AMPK未发生明显变化（P＞0．05），而活化状态的AMPK ，即p-AMPK表达显著降低（P＜0．01），且自噬标志物MAPlLC3的表达量显著降低（P＜0．05），自噬小体数量明显减少（P＜0．05）；CNE-2细胞经CC干预后进行X线照射可明显抑制其增殖并促进细胞凋亡（P＜0．05）。结论 CC可通过抑制细胞自噬来增强放射线对NPC CNE-2细胞增殖抑制和凋亡促进作用，从而增强N PC的放射敏感性。
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磁共振扩散加权成像对鼻咽癌放疗的应用进展
鼻咽癌是指原发于鼻咽腔上皮组织的恶性肿瘤.是我国常见恶性肿瘤之一,全世界80％的鼻咽癌发生在我国华南地区的广东、广西、福建、湖南、江西等省.高危人群中的发病年龄多在30岁以上,高峰年龄在40～60岁,并具有明显的性别差异,男女性别比达2.5:1[1].鼻咽癌具有明显的放射敏感性,能够通过放射治疗取得明显疗效,大部分原发及部分复发病例(特别是组织学分类为Ⅱ和Ⅲ两个亚型)预期可被治愈,其5年生存率可达到65％～90％[2].局部复发与远处转移是主要死亡原因[3].
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蛋白质组学进展及其在肿瘤放射治疗中的运用
放射治疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一,但由于肿瘤细胞存在放射敏感性的差异,仍有相当一部分患者因为肿瘤复发而导致放射治疗失败.因此寻找预测肿瘤放射敏感性的特异性标志物,探索放射增敏的途径,一直是放射肿瘤学研究的热点问题.蛋白质组学从新的角度研究肿瘤,寻找肿瘤标记蛋白,进而阐明其表达水平的变化与肿瘤发生、发展不同阶段的相互关系,对肿瘤的早期诊断以及治疗敏感性具有重要意义.这里就蛋白质组学研究相关技术、策略及其在肿瘤放射治疗中的应用作简要综述.
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环氧化酶2抑制剂尼美舒利对乳腺癌细胞株放射敏感性的影响
[目的]探讨环氧化酶2抑制剂尼美舒利对乳腺癌细胞株MCF-7放射增敏作用并初步探讨其机制.[方法]克隆形成实验检测尼美舒利对MCF-7放射增敏作用;电镜观察肿瘤细胞形态学改变;流武细胞仪(FCM)检测肿瘤细胞调亡率及Bcl-2、Bax蛋白表达. [结果]不同浓度尼美舒利对乳腺癌细胞MCF-7均有放射增敏作用,且呈剂量依赖性关系;尼美舒利与射线照射联用能够上调Bax蛋白表达,同时抑制Bel-2蛋白表达,明显增加细胞凋亡率. [结论]COX2抑制剂尼美舒利对人乳腺癌MCF-7细胞株具有明显放疗增敏作用.
关键词： 环氧化酶2选择性抑制剂 放射敏感性 乳腺癌 凋亡 -
胶质瘤细胞及其干细胞的放疗敏感性差异
目的 探讨脑胶质瘤细胞与脑肿瘤干细胞(BTSCs)的放射敏感性差异.方法 胶质瘤细胞接种于含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养.用血清剥夺法(无血清的DMEM/F12培养基添加bFGF、EGF和B27,即干细胞培养液)培养胶质瘤干细胞.CD133免疫细胞化学染色鉴定BTSCs.用直线加速器分别以0、2、4、6、8、10Gy X线照射胶质瘤细胞及BTSCs,然后继续培养36h.流式细胞仪检测上述细胞中CD133+细胞比率.采用MTT法检测细胞的存活情况.结果 胶质瘤细胞中存在BTSCs,后者能在干细胞培养液中存活并悬浮生长,增殖形成克隆球,具有自我更新和增殖能力,表达特异性标志物CD133.胶质瘤细胞及BTSCs在X线照射后,其增殖能力都下降,但BTSCs的下降幅度远没有胶质瘤细胞大(P＜0.05).CD133+比率显示,X射线对普通胶质瘤细胞中极其微量的CD133+细胞几乎没有影响,而BTSCs中的CD133+细胞的比例在0-10GyX射线放射过程中,与放射剂量成正比(P＜0.05).结论 BTSCs的放射敏感性明显低于胶质瘤细胞,其机制可能与放疗过程中CD133+细胞的增加有关.
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Period2基因对大鼠神经胶质瘤放射敏感性的影响
目的:探讨Period2基因对肿瘤细胞放射敏感性的影响.方法:体外培养C6细胞(C6神经胶质瘤细胞,C6 gliomacells),使用脂质体包裹法将Period2表达质粒(pcDNA 3.1-per2)转导入C6细胞内;以免疫组化及流式细胞术检测Period2表达;通过流式细胞术和克隆形成试验检测稳定转染Period2阳性表达的C6细胞在γ射线照射后的凋亡及增殖情况.结果:γ射线照射后Period2阳性表达的C6细胞射线照射后其较对照组细胞凋亡率减少、增殖率较高.结论:Period2基因过表达使C6神经胶质瘤细胞的放射敏感性降低.
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反义miR-221/222上调p27~(kipl)对胶质母细胞瘤U251的放射增敏作用
目的 探讨敲低微小RNA(micro RNA,miRs)-221/222表达上调p27~(kipl)对U251胶质母细胞瘤细胞系放射敏感性的影响.方法 经生物信息学分析查询miR-221/222成熟体序列和它们与p27~(kipl)的关系.脂质体共转染反义寡聚核苷酸(反义miR-221/222)下调U251胶质母细胞瘤细胞系miR-221与miR-222的表达.使用Northern印迹方法鉴定转染后U251细胞miR-221、miR-222表达水平下调;流式细胞术检测转染后U251联合X线照射的细胞周期分布;克隆形成实验验证各组细胞增殖性死亡;Western 印迹分析p27kipl蛋白的表达变化.结果 经生物信息学分析显示miR-221/222成熟体序列的种子序列几乎一致,p27~(kipl)是miR-221/222的靶基因.Northern印迹分析显示反义miR-221/222共转染组使miR-221/miR-222的表达水平明显下降.转染无义序列组及对照组的miR-221/miR-222表达水平没有改变.流式细胞术检测可见反义miR-221/222共转染组细胞周期阻滞于G0/G1期且明显高于其它各组.经X线照射后,可明显降低S期比例.反义miR-221/222联合X线照射可增加U251细胞增殖性死亡.Western印迹分析显示反义miR-221/222共转染组的p27~(kipl)蛋白表达明显上调.结论 反义miR-221/222通过上调p27kipl蛋白表达可增加U251胶质母细胞瘤细胞系的放射敏感性.
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用Ku80 siRNA抑制Ku80基因表达以提高肺癌细胞放射敏感性的实验研究
目的 探讨用小RNA干扰抑制Ku80基因表达以提高A549肺癌细胞的放射敏感性.方法 设计并化学合成Ku80 siRNA,转染体外培养的A549肺癌细胞.利用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平对转染后的细胞Ku80基因表达情况进行测定,同时上述转染的细胞分别照射2、4、6、8及10 Gy,利用克隆形成实验测定放射敏感性的变化.结果 RT-PCR检测显示在A549肺癌细胞转染Ku80 siRNA后24、48和72 h三个时间点Ku80 mRNA含量减少,Western blot分析显示在转染48和72 h两个时间点Ku80蛋白含量减少,与对照组比较有统计学差异(P<0.05).克隆形成实验提示A549肺癌细胞转染Ku80 siRNA后放射敏感性增强.结论 Ku80 siRNA转染A549肺癌细胞后能够有效抑制Ku80基因表达,提高其放射敏感性.
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TCAB1与肿瘤及其放射敏感性关系的研究进展
端粒酶（telomerase）是一种合成端粒序列的核糖核蛋白复合物，主要由端粒酶逆转录酶（the te-lomerase reverse transcriptase，TERT）、端粒酶 RNA （the telomerase RNA component，TERC）及与酶活性和组装相关的一些蛋白质组成。端粒酶能使端粒的长度和结构得以稳定，从而保护染色体。已有大量研究显示，其在细胞永生化和肿瘤发生发展过程中起重要作用。端粒酶一直是肿瘤学中的研究热点。然而由于其含量的缺乏及其本身纯化的困难限制了学者对其的研究。目前只有部分端粒酶组分被确认。端粒酶卡扎尔体蛋白1（telomerase cajal body protein 1，TCAB1又名 WRAP53、WDR79）是2009年新发现的端粒酶关键核心蛋白组分，其主要存在于卡扎尔体（cajal body，CB）中［1］。近年来研究证实， TCAB1与肿瘤的发生发展及预后等生物学行为密切相关，并且可能影响肿瘤放疗的敏感性。本文就TCAB1与肿瘤及其放射敏感性的研究进展作一综述。
关键词： 端粒酶卡扎尔体蛋白 1 肿瘤 放射敏感性 TCAB1 -
乏氧诱导因子-1(HIF-1)和肿瘤放射敏感性
缺氧是引起细胞损伤的重要原因,而乏氧诱导因子(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)是1992年由Semenza等[1]发现的对氧浓度改变的一系列自适应反应中重要的调节因子,是一种氧依赖转录激活因子,通过与低氧反应元件(HRE)结合,引发下游基因的转录,现已确认有超过60多种的下游靶基因受HIF-1的直接调控,并且随着人们对HIF-1研究的不断深入,受调基因的数目还在不断增加[1～5].
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热休克蛋白27与恶性肿瘤的研究进展
热休克蛋白是细胞在受到刺激时产生的一类特殊蛋白质,热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)是该家族中的重要成员之一,现已证实HSP27在多种肿瘤细胞中异常高表达,HSP27在肿瘤的发生、发展中的作用及其机制是近年来研究的热点,本文就HSP27与肿瘤的研究进展作一综述.
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EGFR的多态性与鼻咽癌放射敏感性的初步研究
目的:探讨表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因外显子13 R497K和内含子1 CA双核苷酸简单重复序列(CA)n的多态性与鼻咽癌放射敏感性的相关性.方法:对53例经病理确诊为鼻咽癌患者治疗前的外周血用PCR和PCR-RFLP方法进行EGFR多态性的分析;所有病例采用调强适行放射治疗方式行根治性放疗;临床放射敏感性评价应用肿瘤体积消退率Rv表示.统计分析采用SPSS13.0软件包,用Kruskal-Wallis Test和X2检验分别分析基因型与肿瘤消退率和临床病理特征的关系.结果:R497K GTV-T型比Lyx/Arg和Arg/Arg型的GTV-T、GTV-N以及GTV-T+GTV-N体积消退率大,放射敏感性高(PGTV-T=0.000;PGTV-N=0.000;PGTV-T+GTV-N=0.001);Lys/Arg与Arg/Arg型GTV-T、GTV-N以及GTV-T+GTV-N体积消退率无统计学差异(PGTV-T=0.209;PGTV-N=0.143;PGTY-T+GTY-N=0.459).CA总数≥38时GTV-T、GTV-N、GTV-T+GTV-N体积消退率比CA＜38时大,敏感性高(PGTV-T=0.001;P GTV-N=0.001和PGTV-T+GTV-N=0.000).结论:R497K Lys/Lys型比Lys/Arg和Arg/Arg型病人对放射治疗更敏感;(CA)n重复序列总数≥38的比CA＜38的病人对放射治疗更敏感.因此,测定EGFR的多态性将有利于预测鼻咽癌病人放疗前的临床放射敏感性,对选择合适的病人进行分类治疗优化个体治疗方案,具有较强的临床应用潜力.
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p53基因BstUⅠ位点多态性与非小细胞肺癌易感性及放射敏感性的相关性研究
背景与目的肺癌是世界上发病率和死亡率增长较快的恶性肿瘤.近几年来随着分子生物学的蓬勃发展,人们对疾病的认识达到了基因水平.通过分子生物学方法发现某一基因与肺癌之间的关联性并加以利用,为早期诊断及治疗肺癌提供了一个新的思路.本研究拟探讨p53肿瘤抑制基因BstUⅠ位点多态性与非小细胞肺癌(NSCLC)易感性及放射敏感性的相关性.方法采用PCR-RFLP方法检测50例NSCLC患者及50例健康对照p53基因序列中的BstUⅠ位点单核苷酸多态性(SNP).并采用病例对照方法分析p53基因BstUⅠ位点的多态性与肺癌的易感性,以及NSCLC患者p53基因BstUⅠ位点的多态性与放疗疗效的相关性.结果不同p53基因BstUⅠ基因型的NSCLC患者对放疗的有效率不尽相同.杂合子(A1/A2)基因型的患者对放疗的有效率低,仅为25.0%,而纯合子(A1/A1,A2/A2)基因型的患者对放疗的有效率较高,分别为71.4%和70.0%,三者之间的差异有显著性(χ2=9.2,P＜0.05).肺癌组的A1/A1、A1/A2及A2/A2基因型频率分别为28.0%、32.0%及40.0%,对照组为32.0%、42.0%及26.0%,但两组间纯合子的频率差异并无统计学意义(P均＞0.05),并且未观察到p53基因BstUⅠ的多态性与NSCLC易感性有密切的相关关系.结论p53基因BstUⅠ位点多态性可能与NSCLC发生无关,但NSCLC患者的p53基因BstUⅠ SNP可能与放射敏感性有关.
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电离辐射降低NSCLC细胞株T790M突变所致TKI耐药
背景与目的以表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）为靶点的分子靶向治疗在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的治疗中发挥重要的作用。EGFR突变的患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）治疗敏感、疗效显著，但无论近期疗效如何，患者终都不可避免地产生耐药。大量研究证实，EGFR基因的二次突变（T790M）是患者耐药的主要原因。本研究旨在探讨电离辐射对NSCLC细胞株T790M突变所致EGFR-TKI耐药的影响。方法选择NSCLC细胞株H1975和H3255为研究对象，实时荧光定量PCR法检测两株细胞的突变状态、克隆形成实验观察两株细胞的放射敏感性，MTT法检测各处理组两株细胞对EGFR-TKI的抗药性。结果 H1975为T790M+L858R双突变株、H3255是仅有L858R的单突变株；各处理组H1975及H3255的存活分数未见明显差异（P=0.952），提示T790M突变对NSCLC细胞株的放射敏感性无影响；2.5 Gy X线辐射组，H1975的 IC50为（0.678,2±0.373）μmol/L，较0 Gy对照组的（3.520±0.821）μmol/L明显下降，差异有统计学意义（P=0.008），H1975相较于H3255的抗药性也从85.9倍下降为39.2倍。结论电离辐射可降低NSCLC细胞株T790M突变所致的TKI耐药，本实验的研究结果为后续的体内和临床研究提供了研究依据；EGFR-TKI治疗期间联合放射治疗对克服T790M突变介导的耐药性有望成为一种有希望的治疗策略。
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吲哚-3-甲醇对肺癌细胞放射敏感性的EGFR依赖性调节
背景与目的 吲哚-3-甲醇(indole-3-carbinol,I3C)是十字花科蔬菜中一种主要的有效植物化学物质,且具有防癌和抗癌作用.本研究旨在观察I3C是否影响表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR )表达水平不同的肺癌细胞放射敏感性.方法 采用MTT和克隆形成实验方法分别检测肺癌细胞的生长和存活率；siRNA转染方法降低细胞中EGFR蛋白表达水平；Western blot和RT-PCR法分别测定EGFR蛋白和mRNA的表达.结果 采用无明显毒副作用的5 μmol/L剂量的I3C预处理明显降低了EGFR表达阳性的人肺腺癌H1975和人肺鳞癌H226细胞对γ-射线照射的放射敏感性,而I3C对EGFR表达阴性的人肺鳞癌NIH-H520细胞的放射敏感性则影响非常小.Western blot结果显示I3C可以增加H1975和H226细胞中EGFR蛋白的表达水平和Y845位点磷酸化水平.EGFR siRNA降低了NIH-H1975细胞中EGFR蛋白的表达,增加了细胞的放射敏感性,并有效地降低和抑制了I3C导致的细胞耐辐射效应.结论 我们的研究结果首次证实I3C可以通过调节EGFR表达和磷酸化水平从而影响肺癌细胞的放射治疗敏感性,提示EGFR可能是I3C影响肺癌放射治疗敏感性的重要靶蛋白.
