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活细胞非标记检测技术
活细胞成像技术可以实时或在一定时间内观察细胞内部结构和生理过程，能够提供比固定细胞成像技术更加真实可靠的信息。现有的活细胞成像技术多基于荧光成像技术，通过增加荧光基团亮度、减少细胞毒性来获得高信噪比的图像，这些方法对细胞活性会造成一定的影响。现代物理技术的改进使得活细胞非标记成像检测成为可能，本文就活细胞的非标记物理成像技术进行深入探讨，以期为活细胞的非标记检测提供新的方法参考。（中华检验医学杂志，2016，39：801－803）
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感染性疾病现场快速检验技术的现状与未来
感染性疾病病原诊断在抗菌药物合理应用,疾病流行病学监测和管理以及控制传播等方面发挥着核心作用.理想的感染病现场快速检验方法应具有敏感、快速、特异、稳定、低成本和便于使用的特点.本文概览了POCT在感染病抗原检测、抗体检测、核酸检测等方面的临床应用状况,并重点介绍了微流控技术在病原体多重核酸检测和耐药性检测等方面的优势和潜力.选择合适的时间、合适的场所、正确应用现场快速诊断技术,将为分级诊疗模式下的感染病诊治提供新的策略.
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新型高通量肺癌相关基因甲基化检测方法的建立
目的 建立一种包含甲基化标准品的新型高通量肺癌相关基因的甲基化检测系统.方法 2009年3-6月上海交通大学医学院附属胸科医院经病理学和影像学确认的非小细胞肺癌患者8例,其中男7例,女1例,平均年龄(57±11)岁,手术后留取肺癌组织及外周血.男性健康志愿者1名,年龄35岁,抽取外周血20 ml,用以分离单个核细胞提取DNA制备质粒.对7个肺癌相关基因的启动区进行克隆,用各基因的特异性引物对克隆到质粒中的各基因片段再次进行扩增,PCR产物用甲基化酶M.sss Ⅰ和亚硫酸盐处理.通过设计3'末端CpGpCpG探针来识别甲基化模板,并经佳连接酶、佳退火温度及连接温度的选择,建立一套多重连接PCR体系,后运用液相芯片平台对扩增的标准品和临床标本进行检测.利用甲基化特异性PCR检测新系统的可靠性.结果 成功的构建了7个基因的甲基化和非甲基化标准品,并建立了多重PCR偶联液相芯片的快速检测系统,p16INK4A、APC、DAPK、RARβ、RASSF1 A、MGMT和GSTP1甲基化标准品的荧光信号值分别为863、909、703、701、901、1 060和885,与非甲基化标准品区分明显.抽提8例患者的肺癌组织DNA,对其中检测出阳性频率较高的基因进行甲基化特异性PCR,产物电泳结果 与新建甲基化检测系统检测结果 完全一致.结论 本研究建立的新型检测系统能同时准确地检测7个基因甲基化状态,有望应用于临床标本的检测.
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纳米金比色芯片同步目视化检测HBV和HCV
目的 建立一种简单、快速的比色芯片可同时目视化检测HBV DNA和HCV RNA.方法 利用多重PCR方法扩增HBsAg阳性合并抗HCV阳性的患者血清中提取的HBV DNA和HCV cDNA.制备Au纳米颗粒基因探针,检测探针与固定在尼龙膜上的捕捉探针构成双探针,用斑点杂交法检测HBV DNA、HCV cDNA的多重PCR产物,加入银离子(Ag+)-对苯二酚液染色观察结果.结果 多重PCR可同时扩增HBV DNA和HCV cDNA,出现预期的431bp和323bp特异性条带.纳米金比色芯片可以同步目视化检出乙型、丙型肝炎合并感染患者血清中HBV DNA和HCV RNA的PCR产物.结论 目视化HBV、HCV纳米金比色芯片诊断方法操作简单、特异性好、成本低廉、结果判定指标客观,此类基因芯片在病毒基因检测领域将会有广泛用途.
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应用基因芯片快速检测临床常见细菌
目的 应用基因芯片对临床常见的8种致病细菌进行检测.方法 选取8种临床常见的致病细菌,包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌、宋内志贺菌.以16S rRNA基因为目的基因,白行设计通用引物系列扩增目的片段,针对高变区域设计探针,建立基因芯片检测体系,并对所选细菌进行检测.收集来自武汉大学中南医院的待检标本50份,包括血液6份、痰液32份、粪便9份、纤维支气管镜检测物3份,提取DNA后利用建立的基因芯片进行检测.结果 自行设计的通用引物能很好地扩增目的片段,针对8种细菌进行多批次重复检测,结果显示所选用的探针具有很好的检测效果.对临床50份标本进行检测,其中47份得到准确的检测结果,3份未得到结果的原因为芯片未包含菌种.通过优化检测过程,可在8h内报告检测结果.探针信号随时间的衰减程度观察表明,60d后探针信号虽有衰减,但其衰减程度对检测结果判断无影响.结论 本研究设计的基因芯片检测体系能准确而快速地对临床常见细菌做出检测,为基因芯片技术应用于临床奠定基础.
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应用液相芯片技术检测拉米夫定耐药相关性HBV变异
法较
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山东滨州地区耐多药肺结核和分枝杆菌菌种分布分析
目的 探讨滨州地区耐多药肺结核和分枝杆菌菌种分布情况.方法 收集2013年1月至2015年3月门诊和住院肺结核培阳患者2083例,其中初治1765例、复治318例.按照年龄段分为5个组:18～岁年龄组216例,31～岁年龄组309例,41～岁年龄组593例,51～岁年龄组434例,＞60岁年龄组531例.2083例(株)利用基因芯片法进行耐多药检测和分枝杆菌菌种鉴定.结果 2083株分枝杆菌经基因芯片法检测,其中结核分枝杆菌2016株,占96.8％.总耐多药率为3.6％(73/2016).其中初治患者耐多药率为1.6％(27/1698),复治患者耐多药率为14.5％(46/318);18～岁年龄组发生耐多药13例,31～岁年龄组发生耐多药8例,41～岁年龄组发生耐多药12例,51～岁年龄组发生耐多药29例,＞60岁年龄组发生耐多药11例.其中51岁以上患者较多,共计40例,占54.8％(40/73).2083株分枝杆菌检出非结核分枝杆菌67株,占3.2％;其中胞内分枝杆菌29株,占非结核分枝杆菌的43.3％.结论 滨州地区结核病耐多药率低于国内平均水平,非结核分枝杆菌病发病率较低,以胞内分枝杆菌感染为主.
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抗体芯片在胰腺癌比较蛋白质组学研究中的应用
目的 运用抗体芯片筛选胰腺癌与癌旁正常胰腺组织之间差异表达的蛋白质,以期发现有价值的新的胰腺癌肿瘤标志物.方法 应用含有378种已知蛋白质的单克隆抗体芯片比较7例胰腺导管腺癌混合样品及其配对癌旁正常胰腺组织混合样品的差异表达蛋白谱.结果 发现20种在胰腺癌中明显差异表达的蛋白质,其中高表达的蛋白质11种(UbcH6、GABA b R2、Plakophilin 2a、Inhibitor2、Nestin、SheC、PRK2、Neurogenin 3、STAT 3、NHE-3和SRP54),低表达蛋白质9种(DCC、HPV-16 L1、RACKl、Gelsolin、Rabaptin-5、DBP2、IKKa/1、c-Cbl、FXR2).结论 抗体芯片是比较蛋白质组学研究的一种有效手段,这些异常表达的蛋白质有助于认识胰腺癌的发病机制,有助于寻找胰腺癌新的诊断标志物和治疗的靶标.
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胰腺癌相关糖尿病致病基因表达谱的分析
目的 探讨胰腺癌相关糖尿病( PCA-DM)致病基因的表达谱,为PCA-DM发病机制的研究提供新线索. 方法 对前期获得的4例PCA-DM患者、4例无糖尿病胰腺癌( PC)患者和4例慢性胰腺炎( CP)患者胰腺组织基因芯片分析结果进一步进行盒图、火山图、热图分析;基因相互作用网络分析;染色体定位分析;Gene ontology ( GO)分析,并采用实时PCR对差异表达基因进行验证. 结果 芯片检测质量可靠. PCA-DM与无糖尿病PC差异表达基因共2778个,其中表达倍数差异>10的有123个基因;无糖尿病PC与CP差异表达基因共7475个,其中表达倍数差异>10的有730个. PCA-DM与无糖尿病PC差异表达基因的数量及差异倍数明显少于无糖尿病PC与CP的差异表达基因. PCA-DM和无糖尿病PC的差异表达基因大多分布于PC与CP差异表达基因的染色体位点上. GO分析显示,与药物代谢、色素沉着、GTPase活性有关的条目上调,而与蛋白代谢、核酸代谢有关的条目下调. 在PCA-DM相关基因网络中,HSPA1A、CSNK1A1、EIF4A2、MYCBP2、PRKRA、NGFR等40 个基因参与PCA-DM发生. TFF1、MSMB、NOX1等13个基因对PCA-DM具有潜在诊断价值. 结论 建立了PCA-DM致病基因表达谱,发现了潜在的致病基因及具有潜在诊断价值的基因.
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冠心病患者血浆微小RNA作为生物标记物可能性的研究
目的 探讨微小RNA(miRNA)在动脉粥样硬化性心脏病患者循环血浆中表达特点.方法 选择男性冠心病患者32例作为冠心病组,男性健康体检者20例作为对照组.另选择载脂蛋白(apo)E/小鼠10只为实验组,正常C57BL/6J小鼠10只为观察组,用高通量基因芯片技术分析实验组和观察组小鼠血浆中差异表达的miRNA.用实时定量PCR法检测冠心病组和对照组miRNA的表达.结果 与观察组比较,实验组小鼠血浆有14种miRNA显著差异表达,其中6种显著上调3.02～3.46倍,8种显著下调3.02～4.21倍.与对照组血浆miRNA表达比较,冠心病组miR 34a和miR-21显著上调、miR 23a显著下调(P＜0.01).结论 冠心病患者循环血浆中miR-23a、miR-21、miR-34a较健康人群明显升高,提示这3种miRNA具有成为冠心病患者生物标记物的潜能.
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静脉血栓栓塞症患者外周血单个核细胞T细胞免疫功能相关基因mRNA表达
目的 探讨静脉血栓栓塞症(VTE)患者T细胞免疫功能在VTE发病中的作用.方法 采用全人类基因表达谱芯片分别检测VTE组(20例)和对照组(20例)受试者外周血单个核细胞(PBMC)T细胞免疫功能相关基因mRNA表达.结果 VTE组患者PBMC CDu7 mRNA( 15.3050±0.6346)、CD3D mRNA( 13.7878±0.7731)、CD3G mRNA( 13.3299±0.9104)、GzmA mRNA( 14.8893±0.8675)、GzmB mRNA( 15.9113±0.8123)、ZAP-70 mRNA(14.3652±0.7717)表达水平较对照组( 15.8053±0.5567、14.3820±0.4857、14.1246±0.6011、15.5305±0.4624、16.4553±0.5055、14.9229±0.4133)下调,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论 VTE患者存在T细胞免疫功能紊乱,T细胞的识别抗原、传导信号功能及杀伤性病毒微生物功能下降.T细胞免疫功能紊乱有可能在VTE的发生发展中起重要作用.
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应用基因芯片初步分析主动脉夹层与正常主动脉微小RNA的差异表达
目的 观察主动脉夹层患者与正常主动脉组织中微小RNA(miRNA)的差异表达,并预测异常表达的miRNA靶基因.方法 收集主动脉夹层患者主动脉组织标本5例(病例组),以及正常主动脉组织标本4例(对照组)作对照.抽提总RNA并质检；采用miRNA芯片技术检测miRNA的表达并对其表达谱进行差异性分析.扩大样本量(病例组11例,对照组9例)运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对差异表达的miRNAs进行验证.结果 芯片结果提示差异有统计学意义的表达基因共5条,其中表达上调的miRNAs为hsa-miR-146b-5p_st,hsa-miR- 19a_st,hsa-miR-505_st,表达下调的miRNAs为hsa-miR-1268_st,hsa-miR-939_st.经RT-PCR验证后,hsa-miR-146b-5p_st与芯片检测结果一致,且差异有统计学意义.结论 与正常主动脉组织相比,miRNAs在主动脉夹层患者的主动脉组织中呈现差异表达,其可能在主动脉夹层的发病中发挥着重要作用,其中hsa-miR-146b-5p_st有可能成为新的主动脉夹层的分子标志物.
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基因芯片在乳腺癌基因分子分型及个体化治疗方面的应用
乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一,发病率高,临床上主要借助影像学、针刺细胞学、病理学等方法进行乳腺癌的早期诊断和治疗,但乳腺癌的基因异质性导致相同病理分期的患者对临床治疗有不同的反应且预后不同.确定一种能够准确反映乳腺癌临床分型、预测疗效及预后的分子和基因分型,对于指导乳腺癌个体化治疗和改善乳腺癌患者的预后具有重要意义.本文对基因芯片在乳腺癌分子、基因分型方面的研究及其在个体化诊疗方面的应用作一综述.
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利用基因芯片技术筛选早期乳腺癌的差异表达基因
目的 比较相同病理类型和临床分期预后不同的早期(Ⅰ、Ⅱ期)乳腺癌样本的基因表达差异,寻找有显著差异的基因,探索与早期乳腺癌预后有关的基因分型.方法 用Agilent4×44K人全基因组Oligo芯片对47例早期乳腺癌患者的组织样本,结合其预后好、差数据,根据其临床预后的不同分为对照组(预后好)24例和实验组(预后差)23例,进行差异基因表达分析;采用Real-time PCR技术,对两组乳腺癌样本中差异表达的基因进行验证.结果 基因芯片检测分析发现,实验组样本比对照组样本有差异表达基因126个,其中60个基因显著上调,66个基因显著下调(差异均在2倍以上).结论 不同预后的早期乳腺癌样本中,基因表达存在显著差异,早期乳腺癌的预后与这些基因的表达有关.
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全转录组芯片筛选肝癌组织中CX43的作用靶点
目的 运用全转录组芯片测序技术结合生物信息学筛选缝隙连接蛋白CX43的下游差异性表达基因并进行功能分析.方法 采用TransIntroTM EL将重组pCX43质粒转染至人肝癌SMMC-7721细胞,构建CX43过表达组,对照组仅转染空载质粒.采用RT-PCR、Western blot检测转染后细胞CX43 mRNA和蛋白的表达情况,两组CX43 mRNA和蛋白表达量比较采用t检验.运用全转录组芯片Clariomtm D Assays筛选CX43的下游差异表达基因;利用DAVID和STRING数据库对差异性表达基因进行基因功能、信号通路和蛋白相互作用分析,确定中心节点蛋白.采用Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析靶点蛋白在生存预后中的价值.结果 过表达组CX43 mRNA和蛋白表达量分别为363±64、1.36±0.02,明显高于对照组的1、0.81±0.01(t=5.67,19.12;P<0.05).筛选CX43下游差异表达基因,其中上调基因394个,下调基因534个.STRING数据库分析出9个中心节点蛋白.Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析显示,ENO1、RALA、SRC高表达患者总体生存率较差(HR=2.29,1.72,1.75;95％CI:1.61～3.27,1.20～2.46,1.22～2.53;P<0.05).结论 ENO1、RALA、SRC为CX43的下游作用靶点,3个靶点蛋白为生存预后的独立影响因素,靶点蛋白高表达患者生存预后差.
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Wnt信号通路激活在肝门部胆管癌发生中的作用
目的：探讨Wnt信号通路激活在肝门部胆管癌发生中的作用。方法回顾性分析1998年7月至2007年5月在中山大学附属第一医院行手术切除治疗的129例肝门部胆管癌及45例先天性胆总管囊肿患者临床资料。其中肝门部胆管癌患者男91例，女38例；平均年龄（56±23）岁。先天性胆总管囊肿患者男32例，女13例；年龄（39±11）岁。所有患者均签署知情同意书，符合医学伦理学规定。制作患者病理标本的组织芯片，对Wnt信号蛋白（Wnt）-2、β-链蛋白（β-catenin）、T细胞因子-4（TCF-4）蛋白进行免疫组化染色。以Wnt-2、β-catenin和TCF-43个指标同时阳性表达为Wnt信号通路激活。两组率的比较采用χ2检验。结果免疫组织染色结果显示，肝门部胆管癌组织Wnt-2阳性表现为细胞浆出现棕黄色颗粒，β-catenin、TCF-4阳性表现为细胞核出现棕黄色颗粒。肝门部胆管癌组织中Wnt-2、β-catenin和TCF-43个指标同时阳性表达的发生率为54%（70/129），明显高于先天性胆管囊肿的29%（13/45）（χ2=11.2，P<0.05）。结论 Wnt信号通路激活可能是肝门部胆管癌发生的重要分子生物学机制之一。
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胃癌淋巴结转移相关长链非编码RNA的鉴定及验证
目的 对胃癌淋巴结转移相关长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)进行筛选和验证.方法 应用Agilent Array平台对3例胃癌阳性淋巴结和1例正常淋巴结行lncRNA芯片,聚类分析lncRNA和mRNA表达水平检测,筛选胃癌转移淋巴结中异常表达的lncRNA.随机选取15个高表达和15个低表达的lncRNAs,应用RT-PCR验证这些lncRNAs的表达水平.结果 与正常淋巴结相比,将胃癌转移淋巴结中表达变化6倍以上者确定为差异表达者,其中353个lncRNAs表达上调和464个lncRNAs下调,547个mRNAs上调和562个mRNAs下调.RT-PCR实验结果显示:与正常淋巴结相比,lncRNA OR3A4、LOC84740、FCGR1C和C21orf96在胃癌阳性淋巴结中表达上调,lncRNA MSTO2P、LOC344595、TUG1,TYW3和KRT8P10在胃癌阳性淋巴结中表达下调.结论 lncRNAs在胃癌淋巴结转移中存在异常表达.
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Shh和Ptch在肝细胞癌中的表达研究
目的 探讨肝细胞癌(HCC)中Shh和Ptch的表达及其意义.方法 应用组织芯片技术、免疫组化和原位杂交方法检测100例HCC、25例癌旁组织和5例正常肝组织中Shh和Ptch的表达情况. 结果 免疫组化检测HCC中Shh和Ptch的阳性表达率分别为19.28%(16/83)、24.68%(19/77);原位杂交检测结果分别为44.29%(31/70)、15.85%(13/82);两种基因在HCC中的表达相关,均与非肿瘤组织的表达有显著性差异,并分别与肿瘤的大小及分化程度相关.结论 Shh和Ptch的表达参与了HCC的发生,它们可能是HCC治疗的理想靶标.
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GAS5来源的piRNAs上调乳腺癌细胞中FOXO4基因的表达研究
目的 探讨GAS5来源的piRNAs在乳腺癌细胞中对FOXO4基因的影响.方法 将GAS5来源的5个pi-snoRNAs(pi-sno44/74/75/78/81)转入乳腺癌细胞后收样提取总RNA行mRNA芯片检测,探索受到上述5个piRNAs调节的基因;分别将5个piRNAs转入乳腺癌细胞中检测每个piRNA对FOXO4 mRNA水平及蛋白水平的表达的影响.收集29例乳腺癌及癌旁组织样本提取总RNA检测FOXO4的表达情况;应用关联分析对pi-sno44/74/75/78/81及FOXO4在乳腺癌及癌旁乳腺组织中的表达情况进行相关性分析,了解piRNAs与FOXO4的相关性.结果 mRNA芯片提示FOXO4基因的表达被明显上调;其中pi-sno44/74/75/81能够上调FOXO4的表达,而pi-sno78对FOXO4激活的作用不明显;pi-sno44/74/75/81在乳腺癌及癌旁乳腺组织中的表达与FOXO4在乳腺癌及癌旁乳腺组织中的表达成正相关(Corr=0.64、0.91、0.76、0.93,P<0.001),pi-sno78的表达与FOXO4的表达无明显相关性(Corr=0.25,P=0.912).结论 GAS5来源的pi-sno44/74/75/81能上调FOXO4基因的表达,并可能通过影响FOXO4的表达影响乳腺癌细胞的生长.
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Wnt信号通路调节因子在肝门部胆管癌组织中的表达
目的研究肝门部胆管癌组织中Wnt经典通路调节因子Frizzled、LRP5/6、APC、Axin的表达，结合既往的研究明确Wnt经典通路的整体调节。方法以1998年4月至2007年5月病理确诊为肝门部胆管癌的129例肿瘤标本作为胆管癌组，使用同期的45例先天性胆总管囊肿标本作为对照（囊肿组），通过组织芯片技术检测所有标本的Wnt经典通路中主要调节因子Frizzled、LRP5/6、APC、Axin的表达。结果囊肿组中Frizzled阳性率高于胆管癌组（91.1% vs 78.3%，H=9.29，P<0.05）；胆管癌组的LRP5/6及APC阳性率分别为91.5%、84.5%，囊肿组的LRP5/6及APC阳性率分别为95.6%、77.8%，两组差异均无统计学意义（H=0.622、1.800，P=0.733、0.400）；而Axin在胆管癌组的表达阳性率显著高于囊肿组（91.4%vs 88.9%，H=6.23，P<0.05）。结论以组织芯片技术为手段，本研究反映出肝门部胆管癌Wnt通路中Frizzled及Axin两种蛋白较囊肿组织体现显著差异，有望成为诊断及治疗的靶点。
