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重组表达萤火虫荧光素酶结核分枝杆菌的构建及其用于低抑菌浓度测定的研究
目的 构建萤火虫荧光素酶(FFLuc)重组表达的结核分枝杆菌菌株,利用其建立抗结核药物低抑菌浓度(MIC)检测方法,并应用该方法测定目前主要的抗结核药物的MIC.方法 (1)以质粒pMV306hsp+FFLuc为模板,PCR扩增FFLuc基因.构建重组表达质粒pMV361+FFLuc,电转化至结核分枝杆菌标准株H37Rv中,应用小动物活体成像系统鉴定FFLuc表达.比较结核分枝杆菌与重组结核分枝杆菌生长状态并绘制生长曲线.(2)检测不同浓度的异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、莫西沙星(Mfx)、链霉素(Sm)、左氧氟沙星(Lfx)、利奈唑胺(Lzd)作用不同时间的表达荧光量变化,考察在不同药物作用下FFLuc表达的稳定性,建立以FFLuc标记结核分枝杆菌为基础的测定抗结核药物MIC的方法并测定INH、RFP、EMB、Mfx、Sm、Lfx、Lzd等7种药物的MIC.结果 (1)pMV361+ FFLuc重组表达载体构建的稳定表达FFLuc的结核分枝杆菌菌株的菌量与荧光表达量(相对荧光强度)呈线性关系[x2=0.994,lg(y)=0.905×lg(x)+0.832].(2)应用新方法检测的7种药物的MIC与微孔培养显色(MABA)法MIC测定结果基本相同.第4天时荧光检测INH、RFP、Mfx、EMB、Sm、Lfx和Lzd的MIC值分别是0.05、0.05、0.09375、4、0.8、0.15、0.15μg/ml;与MABA法检测结果相比,结果在相差1～2倍MIC值的可接受范围内.结论 建立了FFLuc重组表达的结核分枝杆菌菌株检测抗结核药物MIC的方法与MABA法相比,所需时间更短,第4天即可检测结果.
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人高密度脂蛋白受体基因3'UTR对其mRNA稳定性的影响
目的 考察人高密度脂蛋白受体SR-BI基因3'UTR对其mRNA稳定性的影响.方法 以人肝癌细胞株HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增获得SR-BI基因mRNA 3'UTR全长序列,克隆至荧光素酶报告基因的下游,分别构建重组质粒pc-luc-3'UTR以及pGL3-CLAp-luc-3'UTR.利用脂质体转染HepG2细胞,进而检测转染后细胞的荧光素酶活性、荧光素酶报告基因mRNA的表达水平以及荧光素酶报告基因mRNA的半衰期.结果 通过PCR成功扩增获得人SR-BI基因3'UTR全长序列,分别构建重组荧光素酶报告质粒pc-luc-3'UTR以及pGL3-CLAp-luc-3'UTR,并以pGL3-CLAp-luc-3'UTR转染HepG2细胞建立稳定转染细胞株CLAp-luc-3'UTRHepG2.通过荧光素酶活性检测、实时荧光定量RT-PCR以及mRNA半衰期检测,结果证实SR-BI基因的3'UTR的存在可显著降低荧光素酶活性及其mRNA水平,mRNA半衰期也显著缩短.结论 SR-BI基因3'UTR对其mRNA的稳定性有显著的影响,是SR-BI基因转录后水平调控的关键,为SR-BI基因表达调控提供了一个新机制.
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以Apo A-Ⅰ为靶点的基因表达上调剂筛选模型的建立
目的 建立靶向人Apo A-Ⅰ转录调控序列的高通量药物筛选模型,用于筛选Apo A-Ⅰ基因表达上调剂.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增Apo A-Ⅰ上游的启动子序列,克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL4.17上游,采用脂质体介导的方法将重组质粒转染人肝癌细胞HepG2,在G418抗性存在的条件下,通过有限稀释法筛选稳定转染细胞株.对溶剂浓度和药物作用时间进行条件优化,应用阳性化合物染料木素评价模型有效性,通过检测荧光素酶的表达活性变化来筛选人Apo A-Ⅰ基因表达上调剂.结果 通过PCR成功扩增了人Apo A-Ⅰ基因上游的启动予序列,构建了相应的重组荧光素酶报告基因质粒pGL4-ApoP,并建立稳定转染细胞株ApoP-Luc HepG2.对筛选条件优化后,应用阳性化合物进行评价,筛选窗相关系数Z'因子为0.68,大于0.5,适于进行高通量筛选.应用该筛选模型对5000余种化合物进行筛选,4个黄酮类化合物和白藜芦醇显示出较好的活性,半数有效浓度均小于10μg/ml.结论 成功建立了人Apo A-Ⅰ基因表达上调剂筛选模型,并利用该模型筛选到5个活性化合物.
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肝孤核受体激动剂对间充质干细胞的抗缺氧复氧损伤作用及机制
目的 探讨肝孤核受体(LXR)激动荆对脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)缺氧损伤的保护作用及可能机制.方法 酶消化法分离稳定表达萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因的小鼠AD-MSCs,流式细胞术检测CD90、CD44、CD34、CD45细胞表面标记物.3代AD-MSCs分为7组:对照组；缺氧6h/复氧2h组(缺氧复氧组)；缺氧/复氧+DMSO组(DMSO组)；缺氧复氧十不同浓度LXR激动剂T0901317干预组(1μmol/L组、5 μmol/L组、10μmol/L组、15 μmol/L组).运用Fluc报告基因生物发光成像技术对AD-MSCs细胞增殖进行定量评价,免疫印迹法检测细胞NF-κB表达水平,ELISA法检测AD-MSCs的白细胞介素6(IL-6)、TNF-α分泌水平.结果 流式细胞术结果显示,AD-MSCs呈CD44(+)、CD90(+),CD34(-)、CD45(-).光学成像结果显示,AD-MSCs细胞数与Fluc平均生物发光信号强度呈正相关(r2=0.97).与对照组比较,缺氧复氧组AD-MSCs分泌TNF-α、IL-6、NF-κB明显升高；与缺氧复氧组比较,10 μmol/L组AD-MSCs分泌TNF-α、IL-6、NF-κB明显减少(P＜0.05,P＜0.01).结论 LXR激动剂可以促进缺氧复氧损伤后AD-MSCs的存活,并能通过NF-κB信号途径抑制炎性因子IL-6、TNF-α的释放,可为干细胞移植治疗心肌缺血再灌注损伤提供新的细胞保护方法.
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荧光成像技术活体示踪裸鼠肝细胞癌肺转移
目的探讨荧光素酶标记肝细胞癌（肝癌）细胞的荧光成像技术在活体示踪裸鼠肝癌肺转移中的价值。方法应用低转移潜能 HCC97L、高转移潜能HCC97H 肝癌细胞建立稳定表达荧光素酶的肝癌细胞株 HCC97L-FL、HCC97H-FL。24只裸鼠按随机数字表法随机分为HCC97L-FL 组和 HCC97H-FL 组。分别将5×106个 HCC97L-FL 和 HCC97H-FL 细胞加入磷酸盐缓冲液（PBS）50μl，制成细胞悬液。将细胞悬液注入裸鼠尾静脉，建立荧光素示踪的裸鼠肝癌肺转移模型。观察荧光成像示踪肺转移瘤大体标本及组织标本情况。两组数据比较采用 t 检验。结果荧光检测发现，HCC97L-FL、HCC97H-FL 细胞均可发出强烈荧光。建模后2～3周，HCC97H-FL 组裸鼠的肺部收集到荧光信号，3～4周荧光强度逐渐增强；HCC97L-FL 组裸鼠无可见的肺部荧光信号。建模后4周 HCC97H-FL 组荧光强度为（1.73±0.16）×104 a.u.，明显高于 HCC97L-FL 组的（0.03±0.01）×104 a.u.（t=23.652, P<0.05）。建模后4周 HCC97H-FL 组裸鼠肺脏密布大小不等转移瘤病灶，部分较大病灶突出于肺脏表面；HCC97L-FL 组中未观察到转移瘤。转移瘤癌细胞核异型性明显，具备肝癌特征。结论荧光素酶标记肝癌细胞的荧光成像技术可对裸鼠肝癌肺转移进行活体、动态示踪。该技术为体内肝癌细胞生长、侵袭、转移的研究提供了可靠的量化研究手段。
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应用活体内光学成像技术观察裸鼠乳腺癌模型的建立
目的 应用活体内光学成像技术观察裸鼠乳腺癌模型的建立.方法 将携带荧光素酶(luc)基因的乳腺癌细胞MDA-MB-231-lue注入裸鼠体内,采用"活体内光学成像系统"观察乳腺癌模型的建立.结果 裸鼠乳腺脂肪垫种植MDA-IVlB-23-ldue后原位成瘤,肿瘤的体积和光子数在第2周到第5周时都呈上升趋势;MDA-IVIB-231-lue细胞尾静脉注射后肿瘤病灶主要位于肺部,左心室注射后可形成全身多发肿瘤病灶.结论 活体内光学成像系统能够很好地显示裸鼠乳腺癌原位成瘤和尾静脉注射、左心室注射模拟转移瘤模型体内成瘤的过程.
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报告基因荧光素酶在科研中的应用
目的:总结报告基因荧光素酶在医学研究中的新进展.方法:应用pubmed及CNKI期刊全文数据库,以"报告基因和荧光素酶"为关键词,检索1996-01-2007-12相关文献,共收集文献617篇.纳入标准:1)荧光素酶的生物学特性;2)荧光素酶作为报告基因的应用.根据纳入标准,精选55篇文献,并查看每篇文献后的引文,后纳入19篇文献进行了综述.结果:荧光素酶是在氧气存在下使底物发光的一类酶,该酶类与底物的结合特异性很强,检出的灵敏度高,因没有激发光的非特异性干扰,信噪比较高,具有其他报告基因不可替代的优势,在基因工程研究中被广泛作为报告基因用于单个细胞、转基因生物、动物和人体基因表达的实时、低光成像,是一种非常实用的研究方法.结论:荧光素酶作为报告基因显示出良好的前景,已成为医学研究领域的重要工具,特别是对推动基因工程研究的发展具有重要作用.
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小鼠DUSP1 3’-UTR双荧光素酶报告基因表达系统的建立及功能鉴定
目的 建立小鼠双特异性磷酸酶1(DUSPl)3’端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因表达系统,并对其进行功能鉴定.方法 提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板通过PCR扩增获得小鼠DUSP1 3'-UTR全长序列,酶切后克隆至pGL3-control载体荧光素酶编码基因的下游,获得重组载体LuDP,经PCR、限制性内切酶酶切、DNA序列分析鉴定正确后与内参照质粒pRL-TK共转染NIH3T3细胞,48h后检测双荧光素酶报告基因的表达.将含有小鼠DUSP1 3’-UTR的荧光素酶表达模块与来源于pRL-TK质粒的RL表达模块克隆至pLenti6-TR质粒中,获得双荧光素酶报告基因表达载体LuDP/RL,将其与RNA结合蛋白HuR表达载体(pcDNA3.1-HuR-FLAG)、mmu-miR-101a分别共t转染NIH3T3细胞,检测双荧光素酶的活性,分析HuR、mmu-miR-101对荧光素酶基因表达活性的影响.结果 成功构建了双荧光素酶报告基因表达载体.小鼠DUSP1 mRNA 3'-UTR可显著下调与其相连的荧光素酶的表达活性(0.14±0.01倍,P＜0.01)；共转染HuR可上调荧光素酶的表达活性(1.40±0.20倍,P＜0.05),共转染mmu-miR-101a则可下调荧光素酶表达活性(0.57±0.18倍,P＜0.05).结论 成功构建了DUSP1 3’-UTR双荧光素酶报告基因表达系统,该系统可用于转录后调控元件对小鼠DUSP1基因表达的调控机制研究.
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反转录病毒介导的Luciferase基因稳定转染细胞株的建立及其生物发光成像检测
目的 建立反转录病毒介导的Luciferase基因(Luc2)稳定转染的细胞株,通过体内及体外实验探讨Luc2阳性细胞数与生物发光成像系统光通量之间的关系.方法 采用分子克隆方法构建pMX-Luc2质粒,将其与pMD.G质粒共转染293T gag-pol细胞,获得表达Luc2的反转录病毒.将该反转录病毒感染小鼠结肠癌CT26、人小细胞肺癌NCI-H446、人结肠癌HT-29、人卵巢癌SKOV3、人肝癌sMMC-7721细胞系,建立并筛选Luc2阳性表达的细胞株.分别接种10～1×104个SKOV3-Luc2细胞于培养皿中,在4只裸鼠背侧皮下16个位点分别接种200μl不同浓度(1×107、5×106、2.5×106、1 × 106、5×105、2.5 × 10s、1×105、5 × 104/ml)的SKOV3-Luc2细胞,在另外4只裸鼠尾静脉中分别注射1 ×106和3×106个SKOV3-Luc2细胞.采用生物发光成像系统检测体外、体内接种细胞的光通量值.结果 成功获得表达Luc2的反转录病毒,感染肿瘤细胞系CT26、NCI-H446、HT-29、SKOV3、SMMC-7721,筛选阳性细胞株,均可稳定表达Luc2.体外生物发光成像系统检测结果表明,光通量值与培养皿中接种的细胞数之间存在显著的线性关系(R2=0.944,β=0.972,P＜0.01)；活体检测结果表明,光通量值与裸鼠尾静脉注射和皮下接种的细胞数之间均存在显著的线性关系(R2=0.991,β=0.996,P＜0.01; R2=0.351,β=0.628,P＜0.01).结论 采用表达Luc2的反转录病毒感染肿瘤细胞系是快速建立Luc2阳性细胞株的一种可行方法.Luc2阳性细胞数与生物发光成像系统中光通量值具有显著的线性关系.
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表达人HER2/neu及荧光素酶的小鼠乳腺癌模型的建立
目的 建立表达HER2/neu表皮生长因子受体及萤火虫荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞模型.方法 将重组人HER2/neu原癌基因真核表达载体与荧光素酶报告基因依次转染小鼠乳腺癌4T1细胞系,用G418与潮霉素加压筛选阳性克隆,Western印迹及活体成像技术鉴定HER2/neu和荧光素酶在4T1细胞中的表达.在BALB/c小鼠前肢乳腺皮下注射该细胞1.5×106个,活体成像观察肿瘤的生长及转移.结果与结论经过两步转染获得抗G418及潮霉素4T1细胞,Western印迹结果显示,该细胞高表达HER2/neu.流式细胞术检测结果提示几乎所有细胞均有GFP的表达.用该细胞株接种小鼠后具有与野生型4T1细胞相似的成瘤性和转移能力.实验结果提示,我们已建立可表达HER2/neu表皮生长因子受体及荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞株,为乳腺癌的研究提供一个良好的模型.
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双荧光素酶标记丙型肝炎病毒亚基因组复制子细胞模型的建立
目的 构建双荧光素酶标记丙型肝炎病毒(HCV)亚基因组复制子细胞模型,为HCV研究提供有效工具.方法 通过单克隆筛选及慢病毒感染构建双荧光素酶标记的HCV亚基因组复制子细胞模型(HCV Fluc-Ubi-Gluc).利用荧光素酶检测、Western印迹检测鉴定细胞模型,利用IFN-α对HCV抗病毒效果评价验证细胞模型的有效性.结果 筛选所得HCV亚基因组细胞克隆检测到荧光素酶活性,Western 印迹检测到HCV NS5A蛋白表达.NS3/4A对黄色荧光蛋白(YFP)标记的MAVS(YFP-MAVS)切割作用使亚细胞定位发生转移.IFN-α处理后荧光素酶活性、HCV蛋白表达水平明显降低.结论 该模型采用萤火虫荧光素酶报告基因指示HCV亚基因组在细胞内的复制水平,Gaussia荧光素酶指示细胞的生长数量,能准确反映候选药物对HCV复制水平的影响,并有效排除药物的细胞毒性干扰,具有操作简单、快速等优点,在抗病毒药物高通量筛选、HCV致病机制等研究方面具有一定的价值.
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DMRIE-C、Lipofectamine2000和TransMessenger转染HCV RNA效率比较
目的 比较和优化DMRIE-C、Lipofectamine2000和TransMessenger 3种转染试剂的转染效率,选择适合建立丙型肝炎病毒(HCV)复制子或感染克隆的转染试剂和条件.方法 将含有萤火虫荧光素酶报告基因的HCV RNA,分别通过上述3种转染试剂转染Huh7和Huh7.5.1细胞系,于转染24 h后裂解细胞,测定荧光素酶活性.2~3周后,结晶紫染色细胞集落.结果 在Huh7和Huh7.5.1细胞中,DMRIE-C比Lipofectamine2000和TransMessenger的转染效率高.在Huh7细胞中,4 μl DMRIE-C 转染试剂组的荧光素酶活性比其他组高(P＜0.05).在Huh7.5.1细胞中,3 μl DMRIE-C 转染试剂组的荧光素酶活性比其他组高(P＜0.05).在细胞集落形成实验中,DMRIE-C组的细胞克隆数多于其他两种转染试剂组.结论 在Huh7和Huh7.5.1细胞中,DMRIE-C比Lipofectamine2000和TransMessenger的转染效率高.当建立HCV复制子或感染克隆试验时,既要选择合适的RNA转染试剂,又要考虑细胞生长状态的影响.
关键词： 丙型肝炎病毒(HCV) RNA 荧光素酶类 萤火虫 转染 -
生物发光成像的特点及应用
生物发光成像(BLI)是通过荧光素酶基因标记细胞或DNA,在ATP及氧气存在条件下,催化荧光素的氧化反应而发光,从而能够直接监控活体内的细胞活动和基因行为.该文通过比较BLI与MRI,PET、放射成像的异同,以及BLI在肿瘤、干细胞和免疫细胞运输、细胞凋亡等方面的应用,为更好地推广BLI的应用提供依据.
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HeLa细胞中ezrin基因主要转录调控区的定位分析
目的:鉴定ezrin基因在HeLa细胞中的主要转录调控区,初步研究ezrin基因的转录调控机制.方法:采用嵌套缺失技术构建一系列以ezrin基因翻译起始位点上游不同长度DNA序列作为报告基因启动子的重组pGLB质粒,利用双荧光素酶报告基因分析系统检测启动子的转录活力,并利用在线分析程序预测ezrin基因主要转录调控区的潜在转录因子结合位点.结果:获得一系列含不同长度ezrin基因5'侧翼区序列的重组pGLB质粒;当ezrin基因5'侧翼区序列从-1 324截短到-890时,转录活力降低约80%,从-146截短到-32时,转录活力几乎完全丧失;在-1 324/-890和-146/-32区,存在大量的Sp 1转录因子结合位点.结论:在HeLa细胞中,ezrin基因的-1 324/-890和-146/-32区是主要的转录调控区.Sp 1可能是调控基因转录的重要转录因子.
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体内生物发光成像在肿瘤转移研究中的应用
体内生物发光成像(in vivo bioluminescence imaging)在生物医学研究中是一个强有力的工具,能够非侵入性、定量及实时动态监测活体动物体内的生物学过程.一个完整的生物发光成像过程,包括构建荧光素酶(luciferase)报告基因,建立稳定表达荧光素酶的细胞,再将此细胞移植到动物体内,进而可以在体外通过敏感的光学检测系统检测到动物体内特定部位所发出的光.生物发光成像能够示踪特定细胞(肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞和细菌等)在体内的迁移,反映特定基因的时空特异性表达以及蛋白质间相互作用等.本文主要就生物发光成像的原理、特点及其在肿瘤转移相关研究中的应用作一概述.
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通过活体动物光学成像系统建立乳腺癌动物模型
目的: 通过活体动物光学成像系统建立稳定表达荧光素酶的乳腺癌裸鼠移植瘤模型.方法: 用脂质体包裹带有neo抗性基因及荧光素酶报告基因的真核表达质粒pGL4.17[luc2/neo],体外转染人乳腺癌细胞株MCF-7,将获得稳定表达荧光素酶的乳腺癌细胞株(MCF-7-luc)进行皮下接种BALB/c裸鼠及尾静脉接种SCID小鼠,建立BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型和SCID小鼠尾静脉移植瘤模型,通过活体成像系统监测体内肿瘤的生长及转移情况.结果: 经过筛选得到1个能够用于建立裸鼠皮下移植瘤模型及SCID小鼠尾静脉移植瘤模型的稳定表达荧光素酶的乳腺癌细胞株,并成功建立了乳腺癌裸鼠皮下移植瘤模型及SCID小鼠尾静脉移植瘤模型.结论: 通过活体动物光学成像系统成功获得的稳定表达荧光素酶的乳腺癌皮下移植瘤和尾静脉移植瘤模型,为人乳腺癌的相关研究提供了一个直观、方便、灵敏和可靠的平台.
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MC38-luc稳转细胞株的构建及在小鼠结肠癌肝转移模型中的应用
目的 筛选稳定表达荧光素酶基因(luc)的MC38细胞株,在免疫功能正常小鼠体内构建结肠癌肝转移模型. 方法 将带荧光素酶基因的质粒pGL4.50转染MC38小鼠结肠癌细胞,通过抗生素初筛和有限稀释亚克隆化,获取MC38-luc稳定细胞株;采用脾内注射MC38-luc细胞构建C57BL/6小鼠结肠癌肝转移模型,利用小动物活体成像系统,监测肿瘤在体内的生长及转移过程. 结果 获得了多株表达荧光素酶基因的单克隆细胞株(MC38-luc);高表达luc的27号细胞克隆在体内生长良好,可用于构建结肠癌肝转移模型. 结论 成功构建了MC38-luc稳定细胞株并将其应用于小鼠结肠癌肝转移模型.
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光学分子影像技术在抗肿瘤药物研发中的应用
光学分子影像技术能够非侵人性、定量及实时动态地监测活体内的生物学过程,在药物研发过程可加强对疾病及药物活性的了解,能有效地用于靶标鉴定、药物筛选、药效和药代动力学研究以及药物疗效的评价.
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XIAP基因3′非翻译区荧光素酶报告载体的构建及活性分析
目的：构建重组X连锁凋亡抑制蛋白质（XIAP）基因3′非翻译区（3′UTR）荧光素酶报告载体，分析可能调控 X IA P基因表达的微RNA（miRNA）。方法采用聚合酶链反应（PCR）从人cDNA中扩增 X IA P-3′UTR序列，插入荧光素酶报告载体pGL3-Ctrl ，获得重组载体pGL3-Ctrl/XIAP ；采用Target Scan 6．2软件预测可能与 X IA P-3′UTR结合的miRNA ；将pGL3-Ctrl/XIAP重组质粒和miRNA共转染A549细胞，测定 X IA P-3′UTR荧光素酶的活性。结果酶切及核酸测序证实，成功构建了X IA P-3′UTR序列的荧光素酶报告重组子；miRNA靶位点的预测显示，X IA P基因可能是miR-200b、miR-200c和miR-429的作用靶标；与miRNA mimic ctrl组比较，miR-200b、miR-200c和miR-429能明显降低pGL3-Ctrl/XIAP的荧光素酶活性，差异有统计学意义（P＜0．05）。结论成功构建了 X IA P-3′UTR荧光素酶报告载体，且miR-200b、miR-200c和miR-429可显著降低其荧光素酶的活性。
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食管癌细胞中fascin基因启动子区的克隆与初步鉴定
目的:对食管癌细胞中fascin基因启动子区进行克隆鉴定. 方法:应用PCR技术从食管癌细胞系EC109中扩增出fascin基因5′侧翼区5段不同长度的片段,并将其克隆至萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic(pGLB)中, 然后将这些质粒与对照质粒pGLB、内参照质粒pRL-TK共转染EC109细胞,48 h后用双荧光素酶检测系统分析这些重组子报告基因转染细胞的相对荧光强度,并结合生物信息学分析,以判断fascin基因启动子区所在位置. 结果:用DNA重组技术成功构建了5个系列缺失重组荧光素酶报告基因表达载体. 相对荧光素酶活性检测表明,与对照组相比,上述一系列重组质粒转染细胞均显示出较高的荧光素酶活性. 生物信息学分析发现,在启动子区(-436～+1)有标志性调控元件TATA盒(-34～-29). 结论:在食管癌细胞中fascin基因的启动子区可能位于转录起始位点上游约436 bp的区段内.
