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对微球囊栓塞大脑中动脉制作猕猴局灶性脑缺血再灌注模型的评价
目的 建立一种理想的猕猴局灶性脑缺血再灌注模型. 方法 成年健康猕猴12只(雌雄各半).经颈总动脉或股动脉介入手术,将标准微球囊导管插入大脑中动脉(MCA)的起始部,然后充盈微球囊阻断MCA血流,退出微球囊后实现MCA血流再灌注,建立大脑中动脉闭塞再灌注(MCAO/R)模型.通过脑血管造影、磁共振血管成像(MRA)、磁共振扫描成像(MRI)、氯化三苯基四氮唑(TIC)染色和神经行为功能评分对动物模型进行评价.结果 经颈总动脉或股动脉介入手术,可以在荧光屏直视下准确地将微球囊导管插入大MCA阻断其血流,MCA在MRA上不显像.MCA供血区磁共振T1、T2、DWI出现高信号区,TFC染色显示脑梗夕匕病灶,动物出现相应的神经功能障碍.该方法 成功率高、重复性好、操作简单. 结论 经股动脉微球囊导管介入手术建立猕猴MCAO/R模型是一种较为理想的方法 .
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恶性疟原虫多次部分换血猕猴模型的建立及在疫苗宿主保护性试验中的初步应用
本实验以多次部分换血的方法,使恶性疟原虫在猕猴体内进行短期的生长发育;并以此模型进行了抗疟疫苗保护性试验,以探索此猴模在疟原虫研究中的应用.结果显示,恶性疟原虫在多次部分换血猕猴模型中生长良好;在猴模外周血中可以见到除疟原虫配子体外的各种虫体形态;原虫生存期为13～14 d;3只实验猴高感染率分别达到8.6%、6.5%和5.4%;接种了恶性疟原虫复合多价疫苗-痘苗病毒的猕猴,在疟原虫的攻击试验中受到了保护.结果表明,通过多次部分换血的方法可建立起供短期实验的恶性疟原虫-猕猴模型;该动物模型可以适用于恶性疟原虫红内期疫苗宿主保护性试验.
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猕猴非清髓单倍相合造血干细胞移植模型的建立
为了研究用非清髓预处理是否能建立猕猴单倍相合造血干细胞移植模型,采用健康、单倍相合的亲代猕猴为供者,子代为受者.受体用氟达拉滨+环磷酰胺+全身照射+兔抗人胸腺细胞球蛋白作非清髓性预处理;用环胞菌素A、霉酚酸酯、鼠抗人CD25单克隆抗体作为移植物抗宿主病(GVHD)预防方案;第0天输注供者动员后的外周血造血干细胞;定期监测造血恢复、造血嵌合水平和GVHD发生等情况.结果表明:4例猕猴用非清髓性预处理后,移植后8天内造血均能恢复,早期均有供者造血干细胞植入;例3、例4植入成功,在移植后12、14天出现Ⅱ-Ⅲ度GVHD;例1在移植后7天低比例供者植入,后出现移植排斥;例2在移植后7天供者成分占50%,后因肾衰早期死亡.结论:用非清髓性预处理可以跨越单倍相合猕猴的MHC屏障,成功建立了单倍相合造血干细胞移植的模型,为进一步实验研究奠定了基础.
关键词： 猕猴 造血干细胞移植 单倍型相合造血干细胞移植 非清髓预处理 -
猕猴单倍体相合外周血造血干细胞移植后多种细胞因子mRNA表达的动态分析
本研究分析猕猴单倍体相合造血干细胞移植前后外周血单个核细胞中细胞因子(TGF-β,IL-2,IL-6,IL-10,IFN-γ,TNF-α,FAS-L)mRNA的表达并探讨这些细胞因子在急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生和病理变化中的作用,以寻找能够早期预测和鉴别诊断aGVHD的指标.5例猕猴经非清髓预处理后接受单倍体相合外周血造血干细胞移植;半定量逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测移植前后8种细胞因子mRNA的表达,动态观察这些细胞因子在移植后aGVHD中的表达情况.结果表明:5例猕猴均成功获得造血重建.1例移植排斥,长期无病存活;其余4例为混合嵌合和完全嵌合植入,1例低比例嵌合植入经第二次;注供者外周血造血干细胞后获得高比例嵌合植入;1例发生肠道Ⅲ度GVHD.移植前后体内Th1和Th2类细胞因子都有不同程度的变化,在aGVHD期间TGF-β呈下调表达,其余均为上调表达;植入比例减低的猕猴各细胞因子也下降至移植前水平.结论:TGF-β在aGVHD发生前的下降趋势可能是GVHD预测指标,并且能够作为肠道GVHD的鉴别诊断指标.
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猕猴造血嵌合体检测方法的建立与应用
在受体内检测到供体细胞嵌合是判断动物移植模型成功建立的关键.为了研究猕猴移植模型中的造血细胞嵌合状态,本研究利用多聚酶链反应(PCR)扩增猕猴Y特异性序列,建立检测性别不同供受者猕猴移植模型嵌合体的方法;用体外雄性、雌性DNA混合稀释实验研究该方法的敏感性;用染色体分析法验证该方法的准确性,并对1例异基因外周血造血干细胞移植的猕猴和1例间充质干细胞(MSC)异体输注的猕猴进行嵌合监测.结果表明:雄性猕猴DNA扩增产物长度为176 bp,雌性无扩增产物,敏感性达0.05%(雄性/雌性DNA比例).对异基因外周血造血干细胞移植的猕猴,用Y特异性序列分析法和性别染色体检测法于移植后7及14天均检测到雄性供者嵌合.输注非亲缘雄性MSC的雌性猕猴,输注后1小时的外周血和30天的骨髓用本方法检出雄性供体嵌合,结果性别染色体检测未发现雄性供体嵌合.结论:采用PCR法扩增猕猴Y特异性序列检测猕猴移植模型嵌合体方法简便,样本需要量少,敏感性高.该法可用于猕猴各种异体器官移植和细胞输注实验的嵌合状态评价.
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重组人白细胞介素11对卡铂致猕猴血小板减少症的治疗作用
观察国产重组人白细胞介素11(rhIL-11)对卡铂致猕猴血小板减少症的影响.成年猕猴每天静脉注射卡铂(15 mg/kg),连续3天.第3次注射卡铂后18小时内开始皮下注射rhIL-11(每天为50或100μg/kg),连续用药14天.给药后定期检测外周血白细胞计数、网织血小板计数、血小板聚集功能和骨髓的集落形成和病理组织学变化等.结果发现,rhIL-11能明显提高注射卡铂猕猴的血小板计数低值和缩短血小板计数少于50%药前值的持续时间,对白细胞和网织红细胞数的恢复也有一定程度的作用.给予rhIL-11后可见外周血网织血小板计数明显升高,但ADP诱导的血小板聚集功能无明显变化.rhIL-11组骨髓巨核系祖细胞和红系祖细胞集落形成增多,光镜下显示骨髓腔中粒系及红系细胞丰富和密集,巨核系细胞明显增多.上述结果表明,rhIL-11对卡铂致猕猴血小板减少症有明显的治疗作用,有助于化疗后促进多系造血功能的恢复.
关键词： 重组人白细胞介素11 猕猴 卡铂 血小板减少症 -
猕猴间充质干细胞的培养及生物学特性研究
本研究的目的是分离、培养猕猴的骨髓间充质干细胞(MSC),分析其表型及生物学特性.从猕猴股骨抽取骨髓,分离单个核细胞,24小时后去除非贴壁细胞,当贴壁细胞生长到80%融合时进行传代,传至5代后用流式细胞术检测细胞表型,在不同条件下诱导其多向分化,用特异性染色鉴定,用RT-PCR法检测MSC表达的细胞因子mRNA.结果表明:贴壁生长的猕猴MSC主要为典型的成纤维细胞样形态,在对数生长期细胞的倍增时间约31-40小时,可以连续传代、成功扩增.第5代猕猴MSC细胞高表达Flk-1、CD29、CD105和CD166,低表达造血细胞标记CD34、CD45和CD33.在不同诱导分化条件下,猕猴的MSC可以分化为成骨细胞及脂肪细胞.用RT-PCR法检测,猕猴的MSC高表达IL-6、TGF-β,弱表达TNF-α,而IL-2、Fas-L和IFN-γ未被检出.结论:猕猴的MSC可以成功分离、培养,其生物学特性与人的MSC相似.
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恒河猴基因组测序工作完成
美国Baylor医学院George Weinstock博士领导的恒河猴基因组成功破译出了猕猴的基因组,这是继人类和黑猩猩之后,科学家破译出的第3种灵长类动物基因组.今年4月13日出版的Science以封面文章形式发表了这项新成果.研究结果证实,虽然早在约2.5亿万年前,恒河猴从向人类进化的灵长类动物中分离出来,但人类和恒河猴基因组仍有93%的同源性.此项研究将有助于科学家进一步探索人类与恒河猴相似性及差异性背后的遗传学基础.通过比较人类和恒河猴基因组的异同可以获得许多有意义的结果.
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恶性间皮瘤可能与致瘤性猿猴病毒SV40无关
目的 探讨致瘤性猿猴病毒SV40(simian virus 40)是否与中国人恶性间皮瘤的发生相关.方法 从蜡块中提取17例恶性间皮瘤组织中的DNA后,用三组引物对SV4O大T抗原(TAg)的基因片段分别进行聚合酶链反应(PCR)扩增,另外,用两种SV40相关抗体(Pab101和Ab-2)分别进行免疫组织化学染色,检测肿瘤组织中是否存在SV40 TAg.结果 (1)一组引物的PCR反应仅有3例扩增出了SV40 TAg的基因片段,其余两组引物的PCR反应均为阴性.(2)两种抗体的免疫组织化学染色均未检测出SV40 TAg.结论 中国人恶性间皮瘤与SV40感染的关系可能不密切.
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广西猕猴中发现GⅡ.17型诺如病毒及其全基因组序列分析
目的 了解广西省龙虎山猕猴粪便标本中的GⅡ.17型诺如病毒的流行情况、基因结构和进化特征.方法 2015年3月～8月收集400份野生猕猴粪便标本,利用建立好的HISEQ高通量测序技术在粪便标本中发现了GⅡ.17型诺如病毒,命名为GX213.采用反转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术对其进行了序列鉴定、全长扩增和检测研究,并对三个开放阅读框(Open reading frames,ORFs)进行了序列和遗传进化分析.结果 筛查结果显示阳性率为0.5％ (2/400).诺如病毒GX213毒株基因组全长为7 565 bp(包括PloyA尾),其基因组分为三个ORFs:ORF1(10～5112nt)、ORF2(5093 ～ 6715 nt)和ORF3(6715 ～ 7494nt),其中ORF1与ORF2之间重叠20 bp,ORF2和ORF3之间重叠1 bp.GX213病毒株全基因组序列分析显示,其与引起2014年至2015年亚洲部分地区暴发的新型人GⅡ.17型诺如病毒变异株CUHK-NS-613(GenBank ID:KU561248)同源性高(同源性高为99.5％).ORF1和ORF3区核苷酸和氨基酸序列都与CUHK-NS-613同源性高(分别为99.5％,99.4％;99.5％,99.2％).ORF2区分析序列发现其与CUHK-NS-491毒株(GenBank ID:KP698928)同源性高,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4％和99.8％,仅P1.1区发现了一个氨基酸的突变aa245P→S.另外,RdRp核苷酸和VP1氨基酸序列进化树分析显示该病毒株与人GⅡ.17型诺如病毒CUHK-NS-613和CUHK-NS-491的进化关系近,而与首次被发现的猴GⅡ.17型诺如病毒KM1509(GenBank ID:KX356908)次之.结论 本研究发现的GX213属于2014年至2015年在亚洲地区引起暴发的新型人GⅡ.17型诺如病毒变异株,提示GⅡ.17型诺如病毒为人猕猴共患病毒.
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活性氮类自由基参与SARS病毒感染猕猴肺损伤
重症急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)的病原体已得到确认[1],但SARS发病机理尚不清楚,自由基在SARS发病过程中的作用缺乏直接的实验证明.本文主要就SARS病毒感染猕猴引起肺损伤中的活性氮类自由基(reactive nitrogen species, RNS)作用进行初步探讨.
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庚型肝炎病毒致病性的动物实验研究
为进一步了解庚型肝炎病毒(HGV)的致病性，对3只国产猕猴(Macaca mulatta)于接种人HGV RNA阳性血清后进行了长达20周的随访观察。现将结果报告如下。
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猕猴实验性内毒素休克早期炎症相关细胞因子水平的检测
LPS(脂多糖)是内毒素的主要成分,虽不直接引起组织损伤,但可通过刺激某些内源性炎症介质,特别是细胞因子的过度分泌介导一系列病理生理反应,如血压过低、发热、组织坏死、血管内皮损伤、多器官功能衰竭,终导致死亡.
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SARS疫苗研究的动态
一、动物模型问题Fouchier等[1]首先将SARS-CoV经呼吸道感染猕猴(Cynomolgus macaque),发现猕猴能产生SARS症状,肺组织出现典型的人类SARS病理改变.该发现不仅为确认SARS的病原体提供了佐证,也表明猴子可用作抗SARS药物及疫苗研究的动物模型,中国学者在猴体重复出类似的结果.但随后,至少3家北美的实验室在重复该试验时遇到问题:无一只猴子出现明显的临床症状,猴子的肺部也未发现明显的病理改变.猴子的遗传背景可能影响其对SARS-CoV的易感性,故有些研究者已经放弃了以猴子作为SARS的动物模型[2].
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内毒素休克猕猴肺内血小板衍生因子和溶酶体变化
目的 研究猕猴在内毒素休克前后血气变化,肺的超微结构、溶酶体的变化、肺泡内血小板衍生长因子(PDGF)免疫组化的表现,探讨其在肺损伤中的意义.方法 猕猴11只,6只为内毒素组,制成内毒素休克模型,分别在内毒素攻击前、攻击60 min、攻击120 min时采血,检测血气;5只为对照组,也在相应时点采血.内毒素组120 min时杀死动物,取肺组织做超微结构、电镜酸性磷酸酶细胞组织化学、PDGF免疫组化检测.结果 内毒素组及对照组在内毒素攻击前、攻击60 min、120 min时气体交换指数无变化.内毒素组动物肺泡内见呼吸上皮、基底膜、血管内皮细胞损伤,细胞内溶酶体数量增多、破坏,PDGF阳性蛋白在肺泡间隔上沉积;而对照组动物肺泡内及血管内皮未见PDGF阳性染色、呼吸上皮和血管内皮无损伤,溶酶体结构正常.结论 休克早期就有了肺部的损害,PDGF可能参与了早期肺组织损伤过程;而此损伤未影响换气指数变化.
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猕猴肝移植死亡原因分析
目前我国医疗技术中人的肝移植技术已日趋成熟,器官保存液及各种新型免疫抑制剂的应用使肝移植的例数逐年增加,围手术期并发症明显下降,存活率不断提高.猴子的生理结构及解剖特点与人非常相似,猴子的肝移植研究能更好地为人类临床打下基础,具有非常重要的作用.但从2006年9月至2007年3月在我实验中心所做的猕猴同种异体肝移植中,14例猕猴,长存活时间38 h,其余存活10～15 h,成活时间短.现将手术过程及死亡原因分析如下,以便能更好地提高手术后猴子的成活率,为人类的临床手术提供一定的参考.
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诱发电位在GDNF与MSCs联合移植法治疗猴脊髓损伤评价中的应用
目的:应用诱发电位技术评价控释胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)与骨髓间充质干细胞(MSCs)源性神经元样细胞联合移植对猴脊髓损伤的治疗效果是否优于单纯细胞移植.方法:应用改良Allen's法制作猴脊髓损伤模型,实验组(4只)给予控释GDNF与MSCs源性神经元样细胞移植,对照组(4只)给予单纯MSCs源性神经元样细胞移植.进行运动诱发电位(MEP)和皮质体感诱发电位(CSEP)检测,比较两组间治疗4-5个月后诱发电位的差异.结果:联合移植组MEP潜伏期较单纯细胞移植组缩短(P<0.05)、波幅较单纯细胞移植组高(P<0.01);两组间CSEP的差异尤显著性意义.结论:联合移植法对于损伤脊髓运动传导功能的恢复优于单纯细胞移植法;诱发电位对于评价脊髓功能的恢复程度具有重要的价值.
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肌硬膜桥是哺乳动物中普遍存在的正常解剖结构
枕下区是人体解剖结构复杂的区域之一。近年来的研究发现枕下区深层肌肉及韧带和硬脊膜之间存在纤维连接，此纤维连接被称为肌硬膜桥。但以上发现均基于人体研究，肌硬膜桥是人类特有的解剖结构，还是哺乳动物普遍存在的解剖结构，目前尚未见报道。本研究采用鲸目的江豚，食肉目的狗，灵长目的猕猴和山魈，这3种哺乳纲不同目的动物作为研究对象，分别进行大体解剖和头颈部P45塑化断层切片的制作。观察结果显示3种纲目哺乳动物项部浅、深层肌肉有差别。江豚项部浅层存在原颈括约肌。狗项部浅层，斜方肌前存在臂头肌。狗，猕猴和山魈斜方肌下存在头菱形肌。尽管它们的项部浅、深层肌肉存在差别，但却都具有一个共同的结构。即项部深层肌肉和硬脊膜的纤维连接。此结构与人类肌硬膜桥结构类似。我们推测肌硬膜桥应该是普遍存在于哺乳动物的正常解剖结构。其存在应具有一定的生理功能，对于其功能的研究还需进一步展开。本研究从形态学上明确了肌硬膜桥在哺乳动物中的普遍存在，揭示了肌硬膜桥在哺乳纲三个目动物中的异同点，为进一步的肌硬膜桥的功能研究奠定了坚实的形态学基础，并为脊椎动物演化的规律提供了新的比较解剖学证据。
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近似熵在微波辐射致猕猴脑损伤检测中的应用
目的 基于近似熵与相对功率谱对微波辐射后猕猴脑电图进行分析,探讨应用近似熵衡量微波辐射对脑损伤程度的可行性.方法 雄性猕猴15只,根据平均功率密度不同,随机分为假辐射组、2 mW/cm2、5 mW/cm2、7 mW/cm2、11 mW/cm2微波辐射组,采用BIOPAC公司生产的MP-150多导生理记录及分析系统,分别于辐射前及辐射后即刻、1d、3d、7d、14 d和30 d,对猕猴脑电图(EEG)近似熵和δ、β频段相对功率谱进行检测.结果 (1)7 mW/cm2组近似熵于辐射后即刻明显下降,11 mW/cm2组近似熵于辐射后即刻、1d和3d明显下降.(2)7 mW/cm2组于辐射后即刻,δ频段相对功率谱显著升高,β频段相对功率谱明显下降；11 mW/cm2组于辐射后即刻、1d和3d,δ频段相对功率谱显著升高,而β频段相对功率谱则明显下降.(3)2 mW/cm2和5 mW/cm2组近似熵与相对功率谱于辐射后各时间点均未见明显变化.结论 (1)7 mW/cm2和11 mW/cm2微波辐射可引起猕猴脑电生理功能损伤,且与辐射剂量相关；(2)近似熵可客观反映微波辐射对脑功能的损伤,对其进行监测和预测,可望成为一个新的评价微波对脑损伤的敏感指标.
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生长抑素诱导猕猴外周血中性粒细胞凋亡
目的:观察生长抑素对猕猴外周血中性粒细胞的作用.方法:用生长抑素与猕猴外周血中性粒细胞共同孵育一定时间后,采用流式细胞仪、DNA电泳、电镜观察猕猴外周血中性粒细胞的形态变化,细胞DNA含量分布变化.结果:生长抑素能诱导猕猴外周血中性粒细胞凋亡,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成;电泳呈凋亡特征性Ladder带;流式细胞仪分析显示,PMN凋亡比例增高(22.1%vs50.5%.P＜0.01).结论:生长抑素能诱导猕猴外周血中性粒细胞凋亡.
