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靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建
目的:构建靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒.方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计并合成靶向PD-L1基因的5对sgRNA序列.为了进一步降低克隆背景和提高构建阳性率,在受体载体中引入毒性蛋白系统(Ccd).构建pX459-CcdB重组载体,将pX459-CcdB载体进行BbsⅠ酶切,将sgRNA插入到pX459-CcdB骨架载体中,转化到不含CcdA基因的宿主菌Stbl3中.酶切不完全引起的背景载体将因毒性蛋白的作用杀死宿主菌.转化后挑取阳性克隆,进行PCR和测序验证.结果与结论:经PCR和测序验证,重组质粒pX459-PD-L1-sgRNA构建成功,为下一步体内外敲除PD-L1基因和深入研究其在肿瘤免疫逃逸中的功能奠定了基础.
关键词： PD-L1 肿瘤免疫 CRISPR/Cas9 基因敲除 -
宫颈癌组织中 FOXP3、PD-1及 PD-L1蛋白的表达
目的：研究宫颈癌组织中FOXP3、PD-1及PD-L1蛋白的表达情况及其与临床病理特征的关系。方法：采用免疫组织化学SP法检测64例宫颈癌组织、40例宫颈上皮内瘤样病变（ CIN ）组织、18例正常宫颈组织中PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白的表达。结果：PD-1、FOXP3蛋白主要表达于肿瘤浸润淋巴细胞（ TIL），PD-L1蛋白主要表达于宫颈癌细胞及TIL。正常宫颈组织不表达PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白，宫颈癌组织中PD-1的表达显著高于CIN和正常宫颈组织（P＜0．05）；宫颈癌组织中PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白的表达与组织分化程度、FIGO分期有关（P＜0．05），与患者年龄、肿瘤直径、HPV感染或分型无关（P＞0．05）。宫颈癌组织中PD-L1与PD-1蛋白的表达呈正关联（rS ＝0．562，P＜0．001）。宫颈癌组织中FOXP3与PD-1、PD-L1蛋白的表达无关联（rS ＝0．218和0．257，P＞0．05）。结论：人子宫颈癌组织高表达PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白，且与肿瘤的发生发展、浸润密切相关。
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PD-1和PD-L1在胃癌组织中的表达及临床意义
目的 检测PD-L1和PD-1在胃癌组织中的表达情况,探讨其与患者临床病理特征和疾病进展的关系.方法 回顾性分析2015年2月至2016年1 1月在安阳市肿瘤医院行根治性手术的64例胃癌患者的临床资料,选取手术区标本作为观察组,随机选取癌旁组织标本作为对照组.观察对比两组PD-1和PD-L1的检测结果,分析其与患者临床病理特征和疾病进展的关系.结果 观察组标本PD-L1阳性率高于对照组(65.6％比0.0％),PD-1阳性率高于对照组(39.1％比0.0％),差异均有统计学意义(P＜0.05);浸润到浆膜层,有淋巴结转移,Ⅲ、Ⅳ期者PD-L1阳性率高于其他患者,差异有统计学意义(P＜0.05);PD-1表达水平和癌灶浸润情况、淋巴结转移情况、分期无关.结论 PD-1和PD-L1在胃癌组织中表达水平明显升高,且PD-L1的表达和患者病理特征关系密切,可能成为预测胃癌进展的新型分子标志物,阻断PD-L1/PD-1信号通路可能是对肿瘤患者展开免疫治疗的重要途径,为胃癌患者免疫治疗提供新思路.
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检测PD-L1和PD-1在胃癌组织中的表达情况及与患者临床病理和预后生存的关系
目的:分析胃癌组织中PD-L1和PD-1的表达情况,并探讨其与患者临床病理、预后生存之间的关系.方法:选取我院2011年6月到2012年6月间收治的胃癌患者100例作为研究对象,通过免疫组化法对术区病理组织标本、癌旁组织标本进行染色分析,计算PD-L1、PD-1的表达阳性率,并分析PD-L1、PD-1阳性结果与患者的病理特征、5年生存率之间的关系.结果:观察组和对照组标本中的PD-L1阳性率,PD-1阳性率,二者的表达结果之间无相关性.随着pTNM分期的升高,累及范围的增大,淋巴结转移的发生,PD-L1的阳性率不断升高,且不同亚组的比较有统计学差异,P<0.05;但PD-1的阳性率在各亚组组间比较无统计学差异(P>0.05).PD-L1、PD-1阳性患者的生存率均显著低于阴性患者,比较均有统计学意义(P<0.05).结论:通过胃癌组织中PD-L1、PD-1表达情况的分析,可以对患者的临床病理特征、预后情况进行预测.
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系统性红斑狼疮患者外周血B淋巴细胞PD-L1的表达
目的 探讨系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血B淋巴细胞PD-L1的表达及其在SLE发病中的意义.方法 应用免疫荧光标记和流式细胞仪技术检测SLE患者外周血B淋巴细胞上PD-L1的表达水平.结果 活动期SLE患者外周血B淋巴细胞CD19+、CD19+/PD-L1+的表达水平明显高于SLE非活动期患者(P＜0.05)和正常对照组(P＜0.05).结论 活动期SLE患者B淋巴细胞的PD-L1表达异常增加,其可能在SLE发病机制中起重要作用.
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急性排斥反应时移植肾组织中程序性死亡配体-1及其受体的表达
目的探讨急性排斥反应时移植肾组织中程序性死亡配体-1(PD-L1)及程序性死亡-1(PD-1)的表达及其与肾小管间质病理损害程度的关系.方法当肾移植患者发生急性排斥反应并经病理检查确认时,采取移植肾组织,以免疫组化和原位杂交染色法,观察肾组织中PD-L1和PD-1的表达,分析PD-L1阳性强度与肾小管-间质PD-l阳性细胞数、肾小管间质病理损害程度的关系.以正常肾组织为对照.结果急性排斥反应时,移植肾组织中的PD-L1及PD-1的表达较正常组织增多、增强(P＜0.01);肾小管PD-L1阳性强度与肾间质PD-1阳性细胞数呈正相关,与肾小管间质病理损害程度呈负相关.结论急性排斥反应时,PD-L1及PD-1的表达增强,它们可能在肾小管间质病理损害中起重要作用.
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抑制乳腺癌患者自体CD3AK细胞PD-1的表达对杀伤MCF-7/adr细胞的影响
目的 探讨抑制PD-1表达后的乳腺癌患者自体CD3AK细胞对乳腺癌MCF-7/adr细胞的杀伤作用.方法 采用慢病毒介导反转录技术将已构建的PD-1重组质粒转染入CD3AK细胞抑制PD-1的表达,流式细胞法检测PD-L1的表达情况;CD3AK细胞与MCF-7/adr细胞共培养,CCK-8法测定各组的杀伤率,分别由荷瘤BALB/c裸鼠尾静脉注入空白质粒组和PD-1质粒组细胞和0.9％氯化钠溶液,观察各组的抑瘤作用.结果 反转录技术可有效抑制CD3AK细胞PD-I的表达(P＜0.01);RT-PCR结果显示lentiviral vector/PD-1使CD3AK细胞PD-1基因表达水平降低;CCK-8结果 显示培养第14、21天的空白质粒组和PD-1质粒组对MCF-7/adr细胞的杀伤率分别为42.98％和62.68％,47.22％和66.95％ (P＜0.01);裸鼠体内实验表明,PD-1质粒组CD3AK细胞能够显著抑制肿瘤的生长,其抑瘤率可达74.8％.结论 MCF-7/adr细胞表面高表达PD-L1,抑制PD1的表达可有效提高CD3AK细胞的杀伤能力.
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非小细胞肺癌免疫治疗生物标志物研究进展
非小细胞肺癌约占所有肺癌类型的75％～80％,5年生存率仅为15％.近年来人们对肺癌精准治疗的认识明显提高,但非小细胞肺癌的治疗仍面临挑战,驱动基因阴性患者的治疗方式十分有限,晚期患者的预后仍较差.免疫治疗药物可以通过阻断免疫检查点使抗肿瘤T细胞免疫反应恢复或增强,或者T细胞受体转导的T细胞免疫疗法靶向大部分的肿瘤特异性抗原从而起到抗肿瘤作用.目前,仅免疫检查点治疗的临床试验表明,非小细胞肺癌中非选择性人群的客观缓解率为10％～20％,仍有大部分患者不能从免疫治疗中获益,故优势人群的筛选仍十分重要.PD-L1是目前常用的免疫治疗的疗效预测标志物,但仍存在一定的局限性,不能作为常规标志物应用于临床.另有相关研究表明:肿瘤突变负荷、肿瘤浸润淋巴细胞、微卫星不稳定等都是预测免疫治疗疗效的重要生物标志物.本文将对目前临床研究中关于免疫治疗的相关生物标志物新进展作系统综述.
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PD1/PD-L1激活促进癌症发生、发展和转移的研究进展
程序性死亡受体1(PD1)和程序性死亡配体1(PD-L1)是重要的负性免疫调节因子.T细胞表面PD1受体与肿瘤细胞表面表达的PD-L1配体结合,向细胞内传递调控信号,抑制T细胞活化与增殖,从而介导肿瘤细胞的免疫逃逸及对常规放化疗的抵抗.近年来,针对PD1/PD-L1的单克隆抗体靶向药物在非小细胞肺癌和黑色素瘤等实体肿瘤治疗中均取得了较好的疗效,显著改善了部分肿瘤患者的临床进展和不良预后.本文综述了PD1/PD-L1在肿瘤发生、发展和转移中的重要作用以及PD1/PD-L1抗体应用干肿瘤免疫治疗中的新进展.
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PD-L1、PD-L2 mRNA在OLP组织中的表达研究
目的:研究PD-L1和PD-L2 mRNA在OLP损害组织中的表达.方法:采用Real-time PCR方法,检测PD-L1和PD-L2 mRNA在20例OLP不伴异常增生、10例OLP伴轻度异常增生损害组织中的表达水平,并以10例健康人正常黏膜为对照.结果:PD-L1 mRNA在不伴异常增生组、伴轻度异常增生组的表达水平分别较正常对照组上调1.3倍、1.7倍,但3组之间均无显著性差异(p＞0.05).PD-L2 mRNA在不伴异常增生组的表达水平较正常对照组上调3.0倍,两者之间有显著性差异(p＜0.01);OLP伴轻度异常增生组的表达水平较正常对照组上调3.2倍,两者之间有显著性差异(p＜0.01);OLP不伴异常增生组与伴轻度异常增生组之间无显著性差异(p＞0.05).结论:PD-L2可能在OLP的发病机制中起重要作用,而PD-L1可能并未参与OLP的发病.
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口腔扁平苔藓组织中PD-L1和PD-L2的表达
目的:探讨PD-L1和PD-L2在口腔扁平苔藓(OLP)组织中的表达及意义.方法:用免疫组化方法检测30例口腔扁平苔藓组织和10例正常黏膜组织中PD-L1、PD-L2的表达,并对其表达与年龄、性别、病程、是否伴有异常增生等进行相关分析,以及对口腔扁平苔藓组织中PD-L1和PD-L2表达的相关性进行分析.结果:PD-L1在OLP组织的表达高于正常黏膜组织,差异有统计学意义(p=0.04),而PD-L2的表达亦高于正常组织,且具有统计学意义(P＜0.01).PD-L1、PD-L2的表达与性别、年龄、病程、临床分型、活检部位、是否伴有异常增生无关(p＞0.05).PD-L1和PD-L2在OLP组织的表达相关性无统计学意义(p＞0.05),但在OLP组织上皮层两者表达相关性有显著的统计学意义(R=1.000,p＜0.01).结论:PD-L1和PD-L2在OLP的发生及发展中起重要作用,可能成为治疗OLP的一个新的靶点.
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PD-L1在乳腺癌中的表达及其临床意义
目的 探讨程序性死亡分子1配体-1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)在乳腺浸润性导管癌中的表达水平,分析其与临床病理特征之间的关系.方法 收集96例乳腺浸润性导管癌标本及30例癌旁正常乳腺组织,用免疫组化SP法及实时定量PCR(Real time PCR)检测标本中PD-L1的表达,分析其表达差异及与临床病理特征之间的关系.结果 免疫组化法检测PD-L1主要表达于细胞浆,在浸润性导管癌中PD-L1的表达阳性率为35.42％ (34/96),癌旁正常组织中的表达阳性率为3.33％(1/30),差异有统计学意义(P＜0.05),PD-L1的表达与患者年龄、绝经史、家族史、肿块大小、淋巴结转移和肿瘤发生部位无统计学差异(P＞0.05),与临床分期、组织病理学分级之间有统计学差异(P＜0.05).实时定量PCR检测乳腺浸润性导管癌中PD-L1高表达,平均△Ct值为8.84±1.99,而在癌旁正常组织为低表达,平均△Ct值为14.2±2.68,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PD-L1在乳腺浸润性导管癌中的表达增加,且与乳腺癌的组织学分级和临床分期呈正相关.在临床病理中检测PD-L1的表达,可选择化疗药物,判断患者预后,及有望成为乳腺癌分子靶向治疗的新靶点.
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PD-L1/PD-1信号通路在脓毒血症的免疫机制中的研究进展
脓毒血症是各种微生物和免疫物质引起的全身炎症反应和宿主自身免疫性损伤,是严重创伤、损伤、外科大手术后常见的并发症,是危重患者死亡的主要原因[1-2].脓毒血症的主要病理生理机制是宿主免疫功能受损导致失去消灭入侵病原体的能力,增加了继发感染的易感性.过去10年间的基础和临床研究已经证实脓毒血症不仅会造成严重的感染,而且会使得适应性的免疫系统障碍和机体抗菌能力受损[3].越来越多研究表明,免疫功能失调在脓毒血症导致器官功能衰竭的发病过程中起着关键作用[4-5].近年来,程序性死亡配体-1/程序性死亡受体-1通路(PD-L1/PD-1通路)在脓毒血症引起的免疫负调控机制中的作用日益受到学者的关注[6].
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针药联合对荷瘤小鼠HSP70及局部免疫的影响
目的:探究瘤周围刺联合环磷酰胺(CTX)对4T1乳腺荷瘤小鼠HSP70及局部免疫的影响.方法:将造模成功的4T1乳腺荷瘤小鼠随机分为模型组、药物组、针刺组、针药组,其中模型组不干预;药物组隔天腹腔注射 CTX(50 mg/kg);针刺组予瘤周围刺(1次/d);针药组予腹腔注射CTX配合瘤周围刺.实验干预2周后测瘤质量计算抑瘤率,免疫组化(IHC)染色热休克蛋白(HSP)70后采用IPP6.0图像分析软件计算阳性表达结果,流式细胞术(FCM)检测肿瘤组织中CD4+CD25+Treg、PD-L1阳性表达情况.结果:针刺或CTX均可抑制肿瘤生长、降低HSP70表达,针刺联合CTX在抑制肿瘤生长和HSP70表达上具有协同作用.CTX可减少CD4+CD25+Treg细胞表达量、增加PD-L1阳性率,但针刺或针药联合对此无明显作用.结论:针刺联合CTX对肿瘤微环境中HSP70表达具有抑制作用,但对Treg细胞、PD-L1无明显作用.
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PD-L1蛋白在鼻咽癌中的表达及其临床意义
目的 探讨PD-L1在鼻咽癌中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组织化学技术对收集的162例鼻咽癌组织进行PD-L1蛋白的表达检测,并结合患者临床病理参数及预后信息,探讨其临床价值.结果 PD-L1蛋白表达水平与性别、年龄、PS评分、临床分期、吸烟情况等临床病理参数之间无显著差异(P＞0.05).PD-L1阳性组与阴性组3年总生存率分别为92.3％与80.0％,差异具有统计学意义(P =0.026).结论 PD-L1蛋白阳性鼻咽癌患者预后较好,有望成为鼻咽癌患者预后评估的生物标志物.
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PD-L1基因实时荧光定量RT-PCR法的建立及在大鼠肝移植中的应用
目的 建立real-time RT-qPCR(实时荧光定量RT-PCR)检测大鼠PD-L1的方法,应用该方法检测大鼠移植肝中PD-L1 mRNA的水平.方法 两袖套法复制大鼠肝移植耐受组(BN→BN)及排斥组( LEW→BN)模型,术后7d处死受体,检测肝功能ALT和AST水平,HE染色病理分析排斥程度,Trizol法提取移植肝总RNA并反转录为cDNA;选β-actin作为内参,复制SYBR Green I real-time RT-qPCR检测法.利用该方法检测移植肝中PD-L1和β-actin的初始模板量,PD-L1/β-actin计算PD-L1 mRNA的相对表达量.结果 异基因LEW→BN组出现急性排斥反应,ALT、AST排斥组均高于耐受组(均P＜0.05).RAI评分排斥组高于耐受组(均P ＜0.05).PD-L1扩增效率为98.8％,相关系数为0.996；溶解曲线为特异单峰；变异系数小于2.0％；移植肝中PD-L1 mRNA相对表达为耐受组[(0.95±0.10)×10-2]高于排斥组[(0.81±0.09)×10-2],差异有统计学意义(t=2.62,P=0.026).结论 成功建立了大鼠源PD-L1的real-time RT-qPCR检测方法,耐受组PD-L1的高表达提示其可能有利于大鼠移植肝的存活,为研究肝移植免疫耐受奠定了理论基础.
关键词： 肝移植 PD-L1 实时荧光定量RT-PCR SYBR Green I -
共刺激分子PD-L1在鼻咽癌组织中的表达和意义
目的 探讨共刺激分子PD-L1在鼻咽癌组织的表达和临床意义,以及PD-L1的表达和鼻咽癌Foxp3+淋巴细胞增多的相关性.方法 采用免疫组化方法检测共刺激分子PD-L1在64例鼻咽癌的肿瘤组织和20例慢性鼻咽炎组织的表达情况及Foxp3+淋巴细胞的分布.结果 PD-L1在鼻咽癌组织中阳性表达率为67.2％,明显高于其在慢性鼻咽炎组织中的表达,差异具有统计学意义(P＜0.05).PD-L1的阳性表达与鼻咽癌病人性别、年龄、临床分期及是否转移等指标均无显著相关性(P＞0.05),但与鼻咽癌组织中Foxp3+淋巴细胞增加有关,差异有统计学意义(P＜0.05),并且鼻咽癌PD-L1的表达也与Foxp3+/CD8+淋巴细胞比率增加正相关(P＜0.05).结论 鼻咽癌组织PD-L1在鼻咽癌组织中高表达,并与瘤内的调节性T细胞升高及CD8+细胞下降有关,其可能在鼻咽癌的发展中起到一定作用,有望成为免疫治疗的一个新靶点.
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TNF-α对人脐静脉内皮细胞活性及PD-L1蛋白表达的影响
目的 研究外源性肿瘤坏死因子α(TNF-α)对原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)活性及程序性死亡因子配体PD-L1蛋白表达的影响,探讨动脉粥样硬化的免疫机制.方法 体外培养HUVECs,加入不同浓度TNF-α持续刺激48 h,CCK-8法检测450 nm波长处吸光度值(OD值),计算细胞生长存活率.选同代细胞重复培养并干预,Western blot方法检测细胞PD-L1蛋白表达.使用SB203580阻断p38MAPK通路后再用TNF-α干预HUVECs,比较各组细胞PD-L1蛋白表达.结果 实验组HUVECs在450 nm波长处的吸光度值较空白对照组明显降低(P＜0.05),细胞存活率依次下降.实验组细胞PD-L1蛋白表达随TNF-α浓度增高逐渐降低(P＜0.05).TNF-α单独刺激组PD-L1蛋白表达较TNF-α与SB203580共刺激组明显降低(P＜0.05),SB203580阻断效应明显.结论 TNF-α可明显抑制HUVECs细胞活性,并降低PD-L1蛋白表达,p38MAPK通路可能参与了这一过程.
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冠心病患者外周血T淋巴细胞PD-L1的表达及意义
目的 研究程序性死亡配体-1(PD-L1)在冠心病患者外周血中T淋巴细胞上的表达及意义.方法 按照WHO关于冠心病诊断标准,将实验分为稳定型心绞痛(SA)组(n=23)、急性冠脉综合征(ACS)组(n=21)和正常对照组(n=18),三组均经冠状动脉造影证实.采集三组人群的外周血,用流式细胞技术及RT-PCR技术测定T淋巴细胞PD-L1蛋白及mRNA表达情况.结果 与正常对照组比较,SA组和ACS组外周血T淋巴细胞PD-L1蛋白及mRNA表达水平均显著升高(P<0.01);但SA组与ACS组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 冠心病患者外周血T淋巴细胞PD-L1表达上调,其可能在动脉粥样硬化斑块形成过程中起作用.
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非小细胞肺癌PD-L1过表达与EGFR基因突变的相关性研究
1 文献来源Azuma K, Ota K, Kawahara A, et al.Association of PD-L1 overexpression with activating EGFR mutations in surgically resected non small-cell lung cancer[J].Ann Oncol, 2014,25 (10):1935-1940.2 证据水平3a.3 背景·PD-1主要表达于T细胞表面,可以调节T细胞的活性及增殖.PD-1的配体PD-L1表达于多种肿瘤细胞上.PD-L1与PD-1结合可诱导活化的T细胞凋亡或者疲劳.·临床研究表明,阻断PD-L1与PD-1的相互作用可以增强T细胞的抗肿瘤活性.
