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伴或不伴海马硬化的颞叶内侧癫痫患者齿状颗粒细胞基因的差异表达分析
海马硬化(Hippocampal sclerosis,HS)是难治性颞叶内侧型癫痫中常见的神经病理学改变.在研究中,分析了伴或不伴HS的颞叶内侧癫痫患者齿状颗粒细胞的基因表达谱,揭示下一代测序方法可以从小同源细胞群收集的RNA产生可解释的基因组数据以及与HS相关的转录变化.手术切除伴或不伴有HS的颞叶内侧癫痫患者的海马,并通过激光捕获显微切割技术获得手术切除海马的齿状颗粒细胞,从而提取RNA,制备并扩增互补DNA (cDNA).对测序文库进行测序,将所得测序读数与参照基因组进行比对.差异表达分析用于确定伴或不伴HS患者之间的表达差异.结果发现,超过90％的RNA-Seq读数与参考对齐.获得的复样转录谱之间存在高度一致性.主成分分析显示,HS的存在与否是数据差异的主要决定因素.HS样本中上调的基因中,参与氧化磷酸化的基因有显著的富集.通过分析来自伴或不伴HS的颞叶内侧癫痫患者的手术切除的海马标本的齿状颗粒细胞的基因表达谱,已经证明了下一代测序方法用于从小均匀细胞群产生生物学相关结果的实用性,并提供了与该病理学变化相关的转录变化的一些见解.
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喉癌顺铂耐药细胞株RNA测序及整合分析
目的 顺铂(cisplatin,DDP)是喉癌患者常用的化疗药物之一,但是疗效欠佳,可能原因是多药耐药性的产生.本研究将筛选喉癌Hep-2细胞与Hep-2/DDP细胞株之间差异表达的RNA测序数据,包括信使RNA (messenger RNA,mRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)及微小RNA (microRNA,miRNA),并整合分析三者之间的相互关系,探讨喉癌多药耐药机制.方法 采用HiSeq4000测序平台对Hep-2及Hep-2/DDP细胞的lncRNA+mRNA建库测序,HiSeq2500测序平台进行miRNA建库测序;GenCLiP 2.0分析3种差异表达RNA的功能;并对miRNA与mRNA、lncRNA与miRNA、lncRNA与mRNA分别进行整合分析.RT-PCR实验验证相关miRNA和lncRNA在细胞株之间表达差异.结果 Hep-2及Hep-2/DDP细胞之间差异表达基因共有1 513个转录本,其中上调基因399个,下调基因580个,主要富集的功能有DNA损伤修复、活性氧簇、细胞死亡、凋亡、细胞周期静止和上皮间充质转换等.构建已知的分子相互作用网络的核心节点为上调基因血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)和下调基因蛋白激酶B1(protein kinaseB1,PKB1,又名AKT1);筛选出差异表达的lncRNA共4个,分别是MALAT1、LINC01315、AC092757.3和LINC01822;筛选到63个差异表达miRNA,其中下调miRNA有38个,上调miRNA有25个;整合分析表明,miRNA和lncRNA广泛参与DDP多药耐药机制.RT-PCR结果表明,MALAT1 (0.12±0.02)、AC092757.3(0.35±0.02)和MIR155(0.37±0.01)在Hep-2/DDP细胞中表达下调,P值分别为0.036、0.006和0.005;而MIR34A在Hep-2/DDP细胞(3.58±0.01)中表达上调,P=0.011.结论 喉癌多药耐药与启动DNA损伤修复、抑制细胞周期以及上皮间充质转化等密切相关,其中VEGFA和AKT1可能是核心基因.miRNA和lncRNA参与DDP多药耐药机制形成,MIR155、MIR34A、MALAT1和AC092757.3可能是主要调节的非编码RNA.
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基于转录组学的创伤性颅脑损伤基因表达变化
目的 探讨创伤性颅脑损伤后基因表达变化及颅脑损伤后的神经保护机制.方法 应用细胞损伤仪(CICⅡ)建立细胞牵张损伤模型,各项参数分别设定为:脉冲时间为50 ms、计量阀门压力为0.165 MPa,使气体脉冲压为(0.021 ±0.001) MPa.采用Trizol法提取损伤组和对照组的细胞RNA,进行mRNA测序,并对差异表达基因进行基因本体分析和生物信息分析软件(IPA)进行信号通路分析,并通过实时荧光定量PCR (qPCR)对定量结果进行验证.结果 在2个样本中,分别得到1 431万个和1 551万个读段,鉴定出15 018个基因在2个样本中均有表达.差异表达基因有1 424个,相较于对照组,损伤组上调1 198个基因,下调226个基因(P＜0.01).与对照组相比,损伤组缺氧诱导因子1α抗体(HIF-1 α)及ZFP36表达均下调,并发现了TBI后13个差异表达基因,构成了以HIF-1α和ZFP36为中心的调控网络.在该网络中,HIF-1α受EGLN2和ZFP36的调控,并与PER1相互作用,同时调控多个下游基因的表达,如H2AFX、ABCF2和SLC39A7.结论 颅脑损伤12h,HIF-1 α在mRNA水平分别受到ZFP36、HNRNPD和EGLN2的调控而下调,并进一步调节H2AFX的表达,进而阻止神经细胞凋亡,促进了神经细胞的损伤修复.
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基于外周血细胞基因表达谱筛选检测胃癌的差异表达基因
目的 分析胃癌患者外周血细胞基因表达谱特征,筛选检测胃癌的差异表达基因.方法 对21名胃癌患者和21名健康对照者外周血样本进行RNA测序,利用生物信息学方法获取胃癌的基因表达谱特征.从胃癌的差异表达基因中筛选候选基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术在25名胃癌患者和48名健康对照者外周血样本中进行验证.使用受试者工作特征曲线(ROC)和Logistic回归分析评估差异表达基因筛查胃癌的潜力.结果 在胃癌患者与健康对照者外周血测序样本中检测到1258个差异表达基因(642个基因上调,616个基因下调).经过滤后选择差异显著的30个基因在新样本中进行qRT-PCR验证,其中3个基因(C1QB、MMP9和SMIM1)仍然具有差异性.Logistic回归分析显示3个基因联合鉴别胃癌的灵敏性为92％,特异性为72.92％,ROC曲线下面积为0.8708.结论 胃癌患者外周血细胞基因表达谱发生显著改变,并发现3个差异表达基因在新样本中仍然具有差异性.该研究为检测胃癌提供了一种有前途的非侵入性qRT-PCR方法.
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基于高通量测序的骨骼肌分化相关长非编码RNA的鉴定
在细胞的生长、分化及个体发育过程中,长非编码RNA均发挥了重要的调控作用.然而在以往的研究中,人们主要关注蛋白编码基因的功能,对长非编码RNA的了解非常有限.为了研究polyA-minus长非编码RNA对骨骼肌细胞分化的意义,本研究以小鼠C2C12成肌细胞为研究对象,利用polyA-minus RNA反向富集技术和高通量RNA测序,分析了这类基因转录本在该过程中的表达变化,旨在发现具有调控作用的长非编码RNA基因.在本工作中,我们不仅鉴定了904条新的长非编码RNA转录本,还阐明了这些长非编码RNA和蛋白编码基因在各关键分化节点的表达调控情况,并进一步将这些长非编码RNA分为9种不同的调控类型.我们获得的研究成果有可能为肌肉疾病的治疗提供新的分子靶标.
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RNA-Seq技术在转录组研究中的应用
RNA测序(RNA-Sequencing,RNA-Seq)是指通过对mRNA反转录形成的cDNA片段进行测序,可以有效地获取生物体在特定的生理环境下的全部转录本信息.RNA-Seq从转录水平研究基因功能及基因结构,揭示特定的生物学过程,分析生物体的差异表达基因,发现新基因及进行基因功能注释等,已广泛应用于生命科学、疾病诊断和预防及药物研发等领域.本文综述了RNA-Seq的优势及在转录组研究方面的应用和前景,并对其中有待进一步研究的问题进行展望.
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RNA测序研究筛选血管紧张素Ⅱ诱导的心脏重构候选基因
目的 研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心脏重构的机制和筛选潜在治疗靶点.方法 大鼠心脏成纤维细胞(CFSs)加入10 nM AngⅡ后培养12h,对照组未加入AngⅡ.从2组样品中提取RNA后,检测细胞基因表达水平.使用R语言中的limma软件包筛选两组样本间的差异表达基因(DEGs),并通过富集分析探讨它们的功能和参与的信号通路.此外,通过蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建揭示它们在蛋白水平的关系.结果 共筛选了126个上调基因和140个下调差异表达基因.根据富集分析发现:其中的ACACB,IL1B,IL1A,NOS2和MMP3与免疫反应、血管生成的调控、超氧代谢过程和羧酸结合生物过程高度相关.PPI网络构建显示:ACACB和MPP3是两个主要节点.结论 ACACB,IL1B,IL1A,NOS2和MMP3这五种基因,可能是AngⅡ诱导心脏重构的重要候选标志物.
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c-kit突变型与野生型胃肠道间质瘤中 基因表达谱的鉴定
背景与目的:胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)是常见的胃肠道间质肿瘤.GIST概念提出以后,因为其独特的分子生物学及临床特征,而受到广泛的关注.在大部分的GIST中,都发现了c-kit的突变.但是对于c-kit在胃肠道间质中的分子机制仍然知之甚少.该研究旨在从表达谱水平宏观了解c-kit突变对于肿瘤的影响.方法:收集c-kit突变型与野生型GIST样本,抽提RNA,建库,进行RNA测序.对差异表达的基因进行富集分析.结果:c-kit突变型与野生型患者中表达谱存在差异,发现了263个显著性差异的基因.结论:c-kit的突变广泛参与肿瘤的各种生物学过程与信号通路.由c-kit突变引起的差异表达基因主要富集在内质网应激、JNK、Hedgehog、FoxO等信号通路中,以及谷氨酰胺、谷氨酸代谢、mRNA代谢、组蛋白去甲基化等生物学过程.
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吉非替尼获得性耐药非小细胞肺癌细胞中差异表达环状RNA分析
目的:建立吉非替尼获得性耐药非小细胞肺癌细胞株,并筛选和分析耐药前后差异表达的环状RNA (circular RNA,circRNA).方法:利用吉非替尼敏感性非小细胞肺癌细胞株H292(简称为H292_S),采用逐步加药法建立吉非替尼获得性耐药株(命名为H292_R).CCK-8法检测吉非替尼对2种细胞增殖的抑制作用;RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)法筛选2种细胞中差异表达的circRNA.实时荧光定量PCR法验证RNA-seq结果,并结合统计学和生物信息学方法对差异circRNA来源基因的生物学功能进行分析.结果:吉非替尼对H292_S和H292_R细胞增殖的半数抑制浓度分别为(108.63±0.32)nmol/L和(982.37±2.62) nmol/L,2者间差异有统计学意义(P值均＜ 0.05),耐药细胞H292_R对吉非替尼的耐药指数为9.04.2种细胞中存在36个差异表达circRNA,其中耐药细胞中24个circRNA表达上调(P值均＜ 0.05),12个circRNA表达下调(P值均＜0.05):GO富集分析发现,异常表达的circRNA主要涉及调节细胞生长增殖、蛋白转运和基因转录等生物学过程;KEGG通路分析发现,异常circRNA的信号通路主要涉及细胞质DNA感受通路、核因子κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)、胞吞和凋亡等通路.实时荧光定量PCR法验证2种细胞中差异表达circRNAhsa_circ_ 0000567和hsa_circ_ 0000620的表达水平差异,结果显示耐药细胞中这2个circRNA水平均明显上调(P值均＜0.05),与RNA-seq结果相符.结论:筛选出吉非替尼获得性耐药相关的差异表达circRNA,这有助于更深入地阐明菲小细胞肺癌耐药的机制,并可能为其早期诊断提供生物学标志.
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转录组测序数据中cSNP和表达差异基因的分析方法
目的 确立本次转录组测序数据中编码区单核苷酸多态性(cSNP)和表达差异基因的分析方法,筛选出可能导致蛋白质功能改变的单核苷酸多态性(SNP)位点和不同表型细胞中存在的表达差异基因.方法 对正常培养的胃癌细胞系MKN28和SGC7901进行RNA测序(RNA-Seq),将测序数据与参考基因组进行比对,对测序的reads数、测得的基因数、MKN28和SGC7901中各自表达上调的基因数、SNP数及可变剪接形式进行统计学分析.运用在线的软件和数据库并结合计算机编程,对2株胃癌细胞系转录组测序数据中的SNP进行筛选和功能预测;对2株细胞中表达差异基因GO聚类结果进行分析比较.结果 筛选并预测了8种类别709种基因的SNP,分析出了6个经预测能够导致蛋白功能改变的SNP位点.对表达差异基因的分析得到了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在2株细胞中的表达情况;经Western blotting和PCR验证了部分分析结果.结论 确立了1种转录组测序后cSNP数据的分析方法,该方法能够对大量SNP数据进行高效筛选和分析;通过聚类分析后再比较得到了一组在MKN28中高表达而在SGC7901中低表达的蛋白激酶基因;这些结果为后续实验提供了依据.
关键词： 编码区单核苷酸多态性 转录组 RNA测序 表达差异基因 胃癌 -
单细胞转录组测序在眼科研究领域中的应用
单细胞转录组测序技术(single-cell RNA-sequencing,sc RNA-seq)是从单个细胞水平分析细胞转录组的表达谱,用于鉴定细胞特异性标记物,发现罕见细胞类型、细胞亚型,揭示细胞之间的差异表达,成为研究复杂生物体系细胞异质性的有效方法,已广泛应用于干细胞、器官发育、神经系统、肿瘤、免疫、微生物等多个研究领域.近年来,该技术在眼科研究领域的应用也日渐增多.随着现代分子生物学与生物信息学的进展,高通量、低成本、高效的商业化测序平台不断涌现.本文主要阐述sc RNA-seq的几项重要技术应用的优缺点和该技术在眼科研究领域中的应用.在未来的研究中,该技术可能扩展到更多的眼部相关疾病的研究中,逐渐应用于临床,指导疾病的诊断及治疗.
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RNA-Seq分析小鼠腭发育关键时期基因的时空表达
目的:构建小鼠腭发育时期差异表达基因库(differentially expressed genes bank,DEGB),探究腭发育关键调控因子和调控机制.方法:分别收集C57BL/6孕鼠妊娠13.5、14.5、15.5、16.5 d(embryonic day,Ed)胚胎腭板,RNA测序技术筛查差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),选择部分基因进行功能注释,定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)验证和免疫组织化学染色.结果:腭发育第一阶段(Ed13.5～Ed14.5)筛出243个DEGs(27个下调,216个上调);第二阶段(Ed14.5～Ed15.5)筛出208个DEGs(30个下调,178个上调);第三阶段(Ed15.5～Ed16.5)筛出262个DEGs(31个下调,231个上调).其中微小RNA(micro RNA,miRNA)和晶体蛋白家族多个成员表达变化显著.免疫组织化学结果显示Ed13.5～Ed16.5腭间充质中分泌型磷酸蛋白1(secreted phosphoprotein,Spp1)表达量逐渐升高.结论:miRNA家族、晶体蛋白家族成员以及Spp1基因在腭形成时期可能发挥关键作用.
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核糖开关在细菌耐药性中的应用进展
近年来，多重耐药菌日益泛滥，细菌耐药现状越来越严峻，传统的抗生素的抗菌作用有限，急需我们研发新的抗菌策略。核糖开关(riboswitch)是直接结合小分子化合物及代谢物发生构象变化而调控下游基因表达的RNA片段。随着核糖开关研究的不断深入，发现其在研发新型抗生素的靶点、与配体结合的抗菌效应、测序技术应用及发现新型耐药机制方面都有极大的应用潜力。核糖开关的发现拓宽了抗菌机制，为耐药性研究提供了新的思路，将会在医疗领域发挥重大作用。本文就其在核糖开关细菌耐药性的潜在应用做一综述。
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全面分子筛选:从RT-PCR到RNA测序
到目前为止,对肿瘤和非肿瘤中mRNA表达的分析主要是通过RT-PCR方法.认为它是测定特定靶基因的拷贝数的金标准.RT-PCR的应用提示RNA转录水平可以辅助对各种疾病患者进行分类和预测其预后,这为一些重要的临床试验提供了依据.然而,定量PCR数据质量的固有变异性使其很难重复,并且分析某个基因需要在实验室耗费大量时间.此外,比较基因在不同的实验中的表达水平往往很困难,并且需要复杂的标准化方法.多年来,许多已开发的技术均未能很好地应用于临床.RNA测序是一个新的、简单而有效的用来测定转录组的构成及发现新的外显子或基因的方法.该技术的优点是可重复性高,测序范围广,对RNA样本量的要求低,即使没有基因组测序也能够检测新的转录和剪接.然而,这种RNA测序技术不可能取代目前的RT-PCR方法,但能够根据需求及医院和实验室的资源与其互补.先以RNA测序确定出部分基因,再利用RT-PCR方法进行进一步的检测.这两个互补的技术能够识别肿瘤所有的分子特征,若作为常规分析应用于癌症实验室,将有助于对病人的分类,同时可以协助肿瘤学家做出临床决策.
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早产小鼠胎盘差异表达基因谱的建立及分析
目的:通过筛选早产小鼠胎盘的差异表达基因(DEGs),探讨早产相关因子和早产分子机制.方法:性成熟Balb/c小鼠按雌∶雄比例2∶1合笼交配,妊娠第15.5天随机分为两组(早产模型组6只,对照组6只),分别予子宫注射脂多糖(LPS)或无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS),6小时后处死小鼠并取出胎盘组织.随机挑选对照组胎盘3个和LPS早产模型组胎盘4个,采用RNA测序技术筛选胎盘差异表达基因,并进行基因本体(GO)分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析.结果:检测到早产差异表达基因508个,其中高差异表达基因353个,低差异表达基因155个.主要的炎症相关的基因有:核因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素34(IL-34)、核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)、信号转导及转录激活因子(STAT2、STAT3)、酪氨酸蛋白激酶3(JAK3)、促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)、血管生长因子(VEGF)、基质金属蛋白(MMP)1、8、10、12、干扰素γ(IFN-γ)和趋化因子(CxCL1、Cx3 CL、CCR2、CxCl2).而常见的早产相关炎症因子IL-1β、IL-6表达并未见上调.GO功能注释分析显示差异表达基因主要参与免疫调节、器官组织发育、细胞分化等生物进程.KEGG通路分析提示早产差异表达基因富集于NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路、JAK/STAT信号通路、MAPK信号通路和趋化因子信号通路.结论:早产小鼠胎盘差异表达基因在Go和KEGG通路上显著富集,主要集中在免疫系统进程,并通过NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路、JAK/STAT信号通路、MAPK信号通路和趋化因子信号通路等激活炎症反应,导致早产的发生.
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下一代测序技术在前列腺癌的研究进展
作为西方发达国家男性第二位死亡率的肿瘤,前列腺癌近年来在我国发病率呈迅速上升趋势,早期诊断、治疗对前列腺癌预后具有重要意义.下一代测序技术具有高通量、低成本、反应耗时短的优势,可以进行基因突变检测、单核苷酸多态性测定、基因测序、RNA测序、表观遗传学检测以及染色体结构分析,为在基因水平研究前列腺癌发病机制、预测前列腺癌风险性及预后提供了广阔的科研平台.本文对下一代测序技术在前列腺癌中的研究进展及临床应用前景进行综述.
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人结肠癌第二代RNA测序数据的计算生物学研究流程
目的以人结肠癌RNA 测序数据分析为例，介绍新一代高通量中的RNA-seq 技术在转录组与基因表达谱方面的应用。方法基于Linux 平台的开源分析软件和人结肠癌RNA 测序数据，建立完整的RNA-seq 测序数据处理和分析流程，并对其中的软件选择、质量控制、下游分析进行讨论。结果基于现有主流的 RNA-seq 计算生物学分析技术，建立起了一套免费开源的RNA 测序计算生物学处理和分析流程，并从中鉴定出了数个在结肠癌表达中存在显著差异的基因。结论这项研究为RNA-seq 数据清理、计算建模和分析提供了具有良好操作性的方案。作为一个临床肿瘤RNA-seq 研究范本，以供从事于类似研究的临床科研工作者参考。
