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N-乙酰半胱氨酸对哮喘小鼠肺组织HMGB1、RAGE表达的影响
目的 检测高迁移率族蛋白B1(HMGB1)及晚期糖基化终产物受体在小鼠哮喘模型肺组织表达及分布.以及N-乙酰半胱氨酸(NAC)对其影响.方法 SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为对照组、哮喘组及哮喘+NAC处理组.每组7只.建立哮喘模型.用RT-PCR法检测肺组织HMGB1及晚期糖基化终产物mRNA表达水平,免疫组化法检测两者在肺组织的分布.结果 HMGB1 mRNA表达在3组中分别为0.88±0.02,0.86±0.05,0.98±0.05;晚期糖基化终产物mRNA表达在3组中分别为1.20±0.20,1.21±0.08,1.58±0.21.相对于对照组,哮喘组的HMGB1和晚期糖基化终产物表达未发生显著性改变(P0.05);相对于对照组和哮喘组,两者在NAC组表达均显著增加,具有统计学意义(P<0.05).免疫组化染色可见HMGB1主要分布于支气管及肺泡上皮细胞,在细胞核、胞浆及胞膜均可见.晚期糖基化终产物主要分布于肺泡上皮,表达于胞膜上.结论 HMGB1及其受体晚期糖基化终产物介导的信号转导通路可能参与哮喘气道氧化应激,但其确切的调控机制及在哮喘中的作用尚待深入研究.
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人可溶性晚期糖基化终产物受体的原核表达及活性鉴定
目的构建人可溶性晚期糖基化终产物受体(hsRAGE)His融合蛋白表达载体并在原核细胞表达与纯化.方法PCR扩增hRAGE基因编码区的胞质外段,利用分子克隆技术将其重组于pET-14b载体中.利用酶切、序列分析鉴定克隆正确性.转化大肠杆菌BL21(DE)3,用异丙基b-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达.以尿素对获得的包涵体进行处理,用金属螯合亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性.以Western印迹和ELISA法对融合蛋白的免疫原性及与AGE的结合活性进行鉴定.结果克隆的hsRAGE完全正确,经过表达与纯化,获得了相对分子质量约45 000的融合蛋白.纯化得到的变性蛋白经复性后可被相应抗体识别.所得到的hsRAGE具有与AGE相互结合的活性,并能够抑制AGE诱导的内皮细胞NF-kB的表达.结论成功地构建了hsRAGE融合蛋白原核表达载体且获得高效表达,得到大量的复性蛋白;该蛋白具有特异的免疫原性,保持与AGE的结合活性,并能够有效阻断AGE-RAGE相互作用.
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绿茶多酚抑制晚期糖基化终产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖
目的本研究观察绿茶多酚对晚期糖基化终产物(AGEs)刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响.方法体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)应用不同浓度的AGEs分别刺激VSMCs并设立对照组进行比较,将不同剂量的绿茶多酚与AGEs共同作用并设立对照组进行比较,采用非放射性的MTS/PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态.结果与对照组相比,晚期糖基化终产物对血管平滑肌细胞增殖具有明显的刺激作用.在晚期糖基化终产物刺激下,绿茶多酚可明显抑制血管平滑肌细胞的生长.AGEs对p44/42 MAPK磷酸化蛋白表达有显著的增强作用,此作用可被绿茶多酚抑制.结论本研究提示绿茶多酚可抑制晚期糖基化终产物诱导的血管平滑肌细胞增殖及p44/p42MAPK磷酸化蛋白的表达.
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重组平颏海蛇磷脂酶A2抑制晚期糖基化终产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖
目的观察重组平颏海蛇磷脂酶A2(rPLA2)对晚期糖基化终产物(AGEs)刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响.方法体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs),应用不同浓度的AGEs分别刺激VSMCs并设立对照组进行比较,采用非放射性的MTS/PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态.结果与对照组相比,AGEs对VSM-Cs增殖具有明显的刺激作用(P＜0.05).在AGEs刺激下,rPLA2可明显抑制VSMCs的生长(0.753±0.098vs.1.100±0.226,P＜0.05).结论 rPLA2可抑制晚期糖基化终产物诱导的血管平滑肌细胞增殖.
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柿叶黄酮对晚期糖基化终产物诱导的血管外膜成纤维细胞增殖的影响
目的观察柿叶黄酮对晚期糖基化终产物诱导的血管外膜成纤维细胞增殖的影响.方法体外培养成纤维细胞,应用柿叶黄酮与晚期糖基化终产物共同进行作用并设立对照进行比较,采用非放射性的MTS/PES法确定成纤维细胞的增殖状态.结果各组的细胞增殖率分别为对照组(0.840±0.061);细胞增殖率分别为(1.330±0.055)、(1.210±0.119)和(0.792±0.060)、柿叶黄酮50μg/ml组(0.829±0.056);AGEs 50μg/ml联用柿叶黄酮50μg/ml组(0.947±0.072).统计分析显示低至10μg/ml的AGEs仍能明显刺激成纤维细胞的增殖(P＜0.05),并呈现剂量依赖性(P＜0.05).柿叶黄酮单独作用对成纤维细胞细胞增殖率无影响(P＞0.05);柿叶黄酮对AGEs诱导的成纤维细胞增殖有明显的抑制作用(P＜0.05).结论柿叶黄酮能明显抑制由晚期糖基化终产物刺激的血管外膜成纤维细胞增殖,
关键词： 成纤维细胞/药物作用 柿 黄酮 晚期糖基化终产物 细胞增殖 -
免疫化学染色图像分析法检测细胞核因子κB
目的探讨一种简便、安全、可定量的细胞核因子κB(NF-κB)活性的检测方法.方法以晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白(HSA-AGE)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC),NF-κB/P65免疫化学染色后,分析细胞NF-κB/p65核/浆的阳性染色比,以经典的凝胶迁徙率泳动分析法作对照.结果HSA-AGE可激活HUVECNF-κB,呈时间、剂量依赖关系,两种方法检测的趋势一致.结论免疫化学染色的图像分析法可用于定量检测NF-κB的活性.
关键词： 细胞核因子κB/检测 晚期糖基化终产物 凝胶迁徙率泳动分析 免疫化学 -
晚期糖基化终产物对人肝细胞株LO2增殖和凋亡的影响
目的:研究晚期糖基化终产物(AGEs)对人正常肝细胞株LO2的作用.方法:以体外培养的LO2细胞株为研究对象,采用MTT法测定不同质量浓度(0、3.75、7.5、15、30、60 g/L)AGEs对LO2生长的抑制作用,应用流式细胞仪分析细胞的凋亡情况,RT-PCR分析不同质量浓度AGEs处理LO2后其IL-1β,TNF-α,HMGB1的基因转录水平变化.结果:当LO2细胞在AGEs质量浓度分别为3.75、7.5、15、30、60 g/L保温48 h后,细胞的增殖均受到显著性抑制,且抑制作用具有剂量依赖性.流式细胞仪分析发现AGEs促使LO2发生凋亡,凋亡率亦随AGEs浓度增高而增加.RT-PCR方法检测显示,AGEs使LO2细胞中IL-1β,TNF-α,HMGB1的基因mRNA的表达水平增高.结论:AGEs可抑制人正常肝细胞株LO2的增殖和诱导其凋亡,并能上调IL-1β,TNF-α和HMGB1基因的表达.
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晚期糖基化终产物对人肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响
目的: 研究晚期糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)对人肾小管上皮细胞株(HKC)的细胞毒性作用.方法:以体外培养的HKC细胞为研究对象,采用MTT法测定不同质量浓度(0、50、100、200、400、800 mg/L) AGEs对HKC生长的抑制作用,应用流式细胞仪分析细胞的凋亡情况,RT-PCR分析不同浓度AGEs处理HKC后其IL-1β,TNF-α,HMGB1基因的转录水平变化.结果:AGEs质量浓度为100、200、400、800 mg/L时分别刺激HKC细胞24和48 h后,均能显著抑制细胞的增殖,且抑制作用具有时间和剂量依赖性.流式细胞仪分析发现,AGEs能促使HKC发生凋亡,凋亡率亦随AGEs浓度的增高而增加.RT-PCR方法检测显示,AGEs使HKC细胞IL-1β、TNF-α、HMGB1基因的表达上调.结论:AGEs可抑制人肾小管上皮细胞的增殖,并诱导其发生凋亡,此作用可能与其上调IL-1β、TNF-α和HMGB1基因的表达有关.
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晚期糖基化终产物通过肾素-血管紧张素系统上调内皮细胞血管生成样蛋白-4的表达
[目的]观察晚期糖基化终产物对内皮细胞血管生成样蛋白-4表达的影响及作用机制.[方法]不同浓度晚期糖基化终产物(AGE)干预内皮细胞24 h,实时荧光定量PCR和免疫印迹检测血管生成样蛋白-4 mRNA和蛋白的表达,酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测细胞上清和裂解液中血管紧张素Ⅱ的浓度,异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖漏出率和跨内皮电阻检测内皮细胞的通透性.预氯沙坦(10.mol/L)预处理内皮细胞后,观察Angptl-4和内皮细胞通透性的变化.[结果]AGE上调内皮细胞血管生成样蛋白-4的mRNA和蛋白的表达(P＜0.05),升高细胞上清及裂解液中血管紧张素Ⅱ的水平,增加内皮细胞的通透性(P＜0.05),氯沙坦预处理后能减轻AGE介导的这些改变(P＜0.05).[结论]AGE可能通过激活内皮细胞内的肾素-血管紧张素系统,上调血管生成样蛋白-4表达的机制,增加内皮细胞的通透性.
关键词： 晚期糖基化终产物 内皮细胞 肾素-血管紧张素系统 血管生成样蛋白-4 -
代谢综合征患者晚期糖基化终产物与血管内皮功能的相关性
目的 探讨代谢综合征(metabolic syndrome)患者血浆中晚期糖基化终产物(advanced glycation endproducts,AGEs)与血流介导内皮依赖性血管舒张功能(flow-mediated vasodilatation,FMD)的关系.方法 采用流行病学方法随机抽取180例随访者作为研究对象,其中非代谢综合征(NMS)患者60例(NMS组),非糖尿病代谢综合征(NDMMS)患者60例(NDMMS组),糖尿病代谢综合征(DMMS)患者60例(DMMS组),采用飞利浦IE33超声杌测定FMD及硝酸甘油介导血管肉皮功能(nitroglycerin-induced vasodilatation,NMD),ELISA法检测受试者血浆中AGEs含量.结果 NDMMS组及DMMS组AGEs含量高于NMS组(P＜0.05),且DMMS组高于NDMMS组(P＜0.05)；DMMS组FMD低于NDMMS组及NMS组(P＜0.05)；NDMMS组及DMMS组NMD低于NMS组(P＜0.05),且DMMS组低于NDMMS组(P＜0.05)；AGEs与FMD及NMD呈负相关(r=-0.23,P＜0.05;r=-0.19,P＜0.05).多元逐步回归分析显示年龄及AGEs是FMD的危险因素,而高密度脂蛋白胆固醇是FMD的保护因素.结论 AGEs可能是致血管内皮功能障碍的危险因素之一.
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晚期糖基化终产物对脂肪细胞产生活性氧的诱导作用及其机制
目的 观察晚期糖基化终产物(AGEs)对脂肪细胞产生活性氧(ROS)的影响及机制.方法 3T3-L1前脂肪细胞体外培养并诱导分化为成熟的脂肪细胞,以小鼠血清白蛋白(MSA)作为阴性对照,用不同浓度(25、50、100 μg/mL)AGEs共同孵育不同时间(0、5、15、30 min及1、3 h)后,荧光探针2′,7′-二氯荧光素乙二酯测定细胞ROS生成水平,间接反映ROS的产生量.分别应用酶特异性抑制剂预处理脂肪细胞,观察AGEs-MSA刺激脂肪细胞生成ROS的变化.结果 AGEs能诱导脂肪细胞产生ROS,ROS的产生量随MSA氧化程度的升高和AGEs-MSA浓度的增加而增多.AGEs诱导脂肪细胞产生的超氧阴离子能被NADPH氧化酶的阻断剂DPI和apocynin明显抑制,不能被其他酶的阻断剂所抑制.结论 AGEs能够诱导脂肪细胞产生ROS,其部分机制可能与NADPH 氧化酶激活有关.
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慢性肾功能衰竭患者血清晚期糖基化终产物与颈动脉粥样硬化、微炎症的关系
目的:本研究拟通过应用ELISA法检测慢性肾功能衰竭(CRF)患者血清晚期糖基化终产物(AGEs)水平,同时测血肾功能水平(Scr)、内生肌酐清除率(Ccr)、C反应蛋白(CRP)等指标及B超测量颈动脉內膜中层厚度(IMT),来探讨CRF患者AGEs的变化水平,AGEs与微炎症、动脉粥样硬化之间的相互作用.方法:选择60例(慢性肾脏病Ⅳ～Ⅴ期)患者,分为两组:肾功能衰竭未透析组30例(简称肾衰组);肾功能衰竭血液透析组30例(简称血透组),并设正常组30例.检测上述患者的血清AGEs及CRP、BUN、Cr等指标及测定IMT.结果:血透组与正常组、血透组与肾衰组、肾衰组与正常组的AGEs、Scr、Ccr、CRP、IMT比较均有明显差异(P＜0.05);AGEs与Scr、CRP、IMT及CRP与IM了之间均具有正相关性(P＜0.01);AGEs与Ccr则存在负相关性(P＝0.003).结论:AGEs的潴留部分是由于肾功能损害对AGEs的清除减少;肾功能衰竭患者存在着一定的微炎症-动脉粥样硬化状态:AGEs在肾衰患者动脉粥样硬化的发生、发展中起着重要的作用,有可能促进其心血管病变的发生或加重.
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沉默信息调节因子1去乙酰化NF-κBp65减轻糖基化终产物诱导的RAW264.7细胞炎症反应
目的:观察沉默信息调节因子1(SIRT1)对晚期糖基化终产物诱导的RAW264.7细胞NF-κB乙酰化水平及炎症的影响. 方法:体外培养RAW264.7细胞,用含不同浓度梯度(50、100、200、400 mg/L)的糖基化终产物刺激 RAW264.7 细胞24 h 及分别以白藜芦醇(100 μmol/L)及Ex527 (10 μmol/L)预处理RAW264.7细胞30 min后,再给予AGEs(400 mg/L)作用24 h,采用ELISA的方法检测RAW264.7细胞的炎症因子IL-1β及TNF-α的产生和Western blot方法检测SIRT1及乙酰化NF-κBp65蛋白的表达. 结果:糖基化终产物组RAW264.7细胞乙酰化NF-κBp65蛋白的表达及炎症因子IL-1β及TNF-α的水平显著高于对照组(P < 0.05),SIRT1蛋白的表达明显低于对照组(P < 0.05),以上指标均呈剂量依赖性. 白藜芦醇具有逆转糖基化终产物的作用,下调乙酰化NF-κBp65蛋白的表达,降低炎症因子的产生,与糖基化终产物组比较差异具有显著性(P< 0.05);而抑制SIRT1使糖基化终产物诱导的乙酰化NF-κBp65水平、IL-1β及TNF-α蛋白水平升高.结论:晚期糖基化终产物降低SIRT1蛋白的表达诱导炎症因子的产生,白藜芦醇激活SIRT1使NF-κBp65去乙酰化从而抑制RAW264.7细胞炎症反应.
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晚期糖基化终产物在糖尿病性动脉粥样硬化中的临床病理意义
动脉粥样硬化 (atherosclerosis,AS)以血管内皮细胞( vascular endothelia cell,VEC)受损、功能障碍为起始,继而血浆脂质侵入内皮下,引起单核 /巨噬细胞浸润及中膜血管平滑肌细胞( vascular smooth muscle cell,VSMC)迁移至内膜下过度增殖,并吞噬脂质形成以泡沫细胞为基础的脂质核心,同时分泌多种促炎细胞因子,并产生大量细胞外基质、胶原、弹力纤维形成脂质核心外周纤维帽,终演进至晚期不稳定 AS斑块.业已证实,糖尿病患者体内发生 AS早于无糖尿病的正常人群,且其 AS病理进展亦明显增快,即所谓加速性 AS.目前研究表明,糖尿病机体内长期增高的血糖,可与机体多种蛋白成分发生糖基化反应,终生成晚期糖基化终产物( advanced glycation end products,AGEs),后者通过一系列的血管病理作用,加速 AS的病理发生、发展.
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线粒体功能障碍在晚期糖基化终产物致肾小球内皮细胞通透性增加中的作用机制
目的：探讨晚期糖基化终产物（AGEs）对大鼠肾小球内皮细胞（rGEnC）通透性的影响及线粒体功能障碍在其中的作用。方法采用原代培养的 rGEnC，予 AGEs 80 mg／L 作用24 h，采用跨内皮细胞电阻抗和异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白滤过率观察通透性的变化，MitoSOX 试剂盒检测细胞内活性氧，JC-1荧光标记法检测线粒体膜电位（△Ψm），荧光素酶检测系统测定三磷酸腺苷（ATP）的生成，蛋白免疫印迹法检测 NF-E2相关因子2（Nrf2）的表达。结果AGEs 可引起 rGEnC 通透性升高，活性氧产生增加，采用叔丁基对苯二酚（tBHQ）（20μmol／L）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）（10 mmol／L）和抗 AGE 受体抗体（100 mg／L）预处理后，上述 AGEs 作用被抑制。AGEs 可引起 rGEnC △Ψm 下降，ATP 和 Nrf2减少，而 anti-RAGE 抗体可抑制△Ψm 下降和 ATP 减少， tBHQ 则能抑制△Ψm 下降和 Nrf2减少。结论AGEs 可导致 rGEnC 线粒体功能障碍，引起活性氧产生增加，从而导致 rGEnC 间通透性增加。
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黄芪保护晚期糖基化终产物诱导内皮细胞凋亡机制研究
目的 本研究旨在观察体外条件下晚期糖基化终产物(AGE)诱导内皮细胞凋亡机制以及黄芪的影响.方法 体外培养人冠状动脉内皮细胞,根据AGE诱导内皮细胞凋亡的有效浓度,分为正常对照组、AGE刺激组、AGE刺激加低、中、高浓度黄芪多糖组(终浓度分别为100、200和400 mg/L).MTS方法分析细胞增殖率,激光共聚焦检测细胞内氧自由基ROS变化及用ELISA法检测人凋亡相关因子FAS水平.结果 ①AGE修饰的人血清白蛋白可以诱导血管内皮细胞凋亡,呈浓度依赖,而中、高浓度黄芪多糖可以抑制该作用(P＜0.01);②黄芪多糖可下调AGE诱导的ROS水平;③AGE组可促使血管内皮细胞FAS分泌明显升高(P＜0.01),中、高浓度黄芪多糖可降低AGE诱导FAS的水平,在400 mg/L浓度明显,且与ROS抑制剂NAC比较差异无显著性(P＞0.05).结论 黄芪可抑制晚期糖基化终产物诱导内皮细胞凋亡,其效应可能与ROS通路相关.
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糖尿病大鼠阴茎组织AGES的变化及其测定方法比较
目的:研究糖尿病大鼠阴茎组织AGES含量的变化,比较竞争性酶联免疫(ELISA)法和荧光分析法测定AGES的优缺点.方法:用葡萄糖和血红蛋白在体外孵育形成Hb-AGES,免疫新西兰兔,制备AGES抗血清,建立竞争性ELISA法,同时用此方法和荧光分析法测定大鼠阴茎组织AGES含量.结果:糖尿病各组阴茎组织AGES水平均较对照组明显升高(P＜0.001),胰岛素治疗可降低阴茎组织AGES水平(P＜0.05).采用竞争性ELISA法和荧光分析法获得的结果具有良好的相关性.结论:糖尿病大鼠阴茎组织AGES水平升高是勃起功能障碍发生的重要机制.荧光分析法简单易行,竞争性ELISA法特异性较好,均可用于测定组织AGES含量.
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中药复方活血通对糖尿病大鼠肾组织晚期糖基化终产物影响的研究
目的 观察中药复方活血通对糖尿病大鼠晚期糖基化终产物(AGEs)的影响,探讨中药复方活血通防治糖尿病慢性并发症的作用机制.方法 采用链脲佐菌素糖尿病大鼠模型,随机分为预防组和治疗组,给予中药复方活血通灌胃,并以氨基胍作为对照,治疗12周,观察中药复方活血通对糖尿病大鼠血糖和肾组织AGEs的影响.结果 中药复方活血通预防组和治疗组血糖、中药复方活血通预防组、治疗组和氨基胍组肾组织AGEs均较模型组为低(P＜0.01);氨基胍组血糖高于中药复方活血通预防组(P＜0.05),与模型组比较,差异也有显著性(P＜0.05).结论 中药复方活血通可能通过降低血糖,抑制终末期糖基化终产物在肾皮质中的形成,延缓糖尿病慢性并发症的进一步发展.
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茯苓四逆汤对慢性心衰患者晚期糖基化终产物的影响
目的 观察茯苓四逆汤对慢性心力衰竭(心衰)患者的临床疗效及对血清晚期糖基化终产物(AGEs)水平的影响.方法 86例心衰患者随机分为治疗组及对照组各43例.治疗组予茯苓四逆汤配合西医常规治疗,对照组予西医常规治疗.两组以2周为1疗程,连续治疗6个疗程.观察两组疗效、中医证候积分、血清AGEs水平、劳动耐力、生存质量、左室射血分数(LVEF)、左室收缩末内径(LVEDs)、左室舒张末直径(LVIDd)等指标变化.结果 总有效率治疗组为93.02％,优于对照组的69.77％ (P＜ 0.05);治疗组在改善中医证候积分、生存质量、6 min步行距离(6MWT)、血清AGEs水平、LVEF、LVIDd、LVEDs等指标方面优于对照组(P＜0.05或P＜ 0.01).结论 茯苓四逆汤能够改善心衰患者临床症状,提高生存质量,这可能与其调节血清AGEs作用相关.
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解聚复肾宁对糖尿病大鼠血清AGEs和肾RAGE表达的影响
目的:探讨解聚复肾宁(JieJufushenning,JJFSN)对糖尿病(Diabetes mellitus,DM)大鼠血清晚期糖基化终产物(Advancedglycation end products,AGEs)和肾脏晚期糖基化终产物受体(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)表达的作用.方法:建立链脲佐菌素(Streptozotoein,STZ)诱导的sD大鼠DM模型,将成模DM大鼠随机分为4组:DM模型组(B组),JJFSN组(c组),氨基胍(Aminoguanidine,AG)组(D组),JJFSN+AG组(E组),另设正常对照组(A组).采用相应干预措施处理12周.常规方法测定12周末各组大鼠血糖、肾功、24h尿蛋白定量(24hPro)和尿肌酐;荧光分光光度法测定血清AGEs水平;免疫组化法测定肾脏RAGE表达.结果:C组、D组和E组大鼠血糖、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、24hPro定量明显低于B组,但高于A组;尿肌酐明显高于B组(P＜0.05),但低于A组;c组、D组和E组血清AGEs水平和肾脏RAGE表达水平均明显低于B组,其中D组低于C组,以E组低,但仍高于A组.结论:JJFSN具有AG类似作用,可抑制蛋白质非酶糖基化反应,减少血清AGEs牛成和肾脏RAGE表达;并具有降低血糖、24hPro、BUN、Scr的作用;联合使用JJFSN和AG比各自单独使用作用更明显.
关键词： 解聚复肾宁 氨基胍 晚期糖基化终产物 晚期糖基化终产物受体 糖尿病大鼠
