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103Pd放射性核素支架抑制损伤血管平滑肌细胞增殖的实验研究
[目的]采用兔腹主动脉损伤致再狭窄的动物模型,探讨钯-103(103pd)放射性核素支架对损伤血管中膜平滑肌细胞增殖的影响.[方法]选用雄性新西兰兔50只,随机分为普通支架组及核素支架组,设正常对照.分别于术后3、7、14、28及56 d取材,进行病理形态学、透射电镜、免疫组化(增殖细胞核抗原PCNA、细胞周期素蛋白Cy-clinE)及原位杂交(C-myc mRNA)实验观察.[结果]①光镜下发现,核素支架组管腔狭窄程度明显低于普通支架组,术后第56天显著(P＜0.01);②透射电镜显示,术后3～28 d,核素支架组中膜血管平滑肌细胞增殖明显低于普通支架组,7 d时达峰,为13.78%±0.64% vs 19.53%±0.44%(P＜0.01);③免疫组化显示,术后3～28 d核素支架组PCNA及Cyclin E表达均低于普通支架组,7 d为表达高峰,PCNA为16.35%±0.79% vs 24.36±0.55%,Cy-clin E为14.78%±1.07% vs 22.65%±1.00%(P＜0.01).④对C-myc mRNA进行原位杂交显示,术后3～28 d核素支架组的表达明显低于普通支架组,7 d达峰值,为17.48%±0.53% vs 25.34%±0.87%(P＜0.01);⑤C-mycmRNA与PCNA相关性分析提示二者呈明显正相关(P＜0.01).[结论]103Pd放射性核素支架通过抑制损伤血管中膜平滑肌细胞的增殖,降低再狭窄的程度,从而减少再狭窄的发生率.
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支架植入对兔血管平滑肌细胞PCNA和Cyclin E表达及细胞凋亡的影响
【目的】观察支架植入后对血管中膜平滑肌细胞增殖和凋亡的影响，探讨支架植入后再狭窄的发生机制。【方法】将雄性新西兰兔50只随机分为球囊组和支架组，设正常对照。分别于术后第3、7、14、28、56天取材研究：①用免疫组化检测血管中膜平滑肌细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞周期蛋白E（Cyclin E）的表达；②用TUNEL染色法测定血管中膜平滑肌细胞的凋亡。【结果】与对照组比较，支架组和球囊组PCNA、Cyclin E表达及细胞凋亡均有显著增加。支架组与球囊组比较，①PCNA和Cyclin E表达明显增加，术后第7天，支架组和球囊组PCNA阳性率为24.36%±0.55% vs 18.74%±1.09% (P<0.01)，Cyclin E阳性率为22.65%±1.00% vs 17.68%±1.10% (P<0.01)；②支架组血管中膜平滑肌细胞的凋亡也较球囊组显著增加，大凋亡率在术后第7天，12.46%±1.13% vs 5.54±0.53% (P<0.01)；③PCNA和Cyclin E的阳性率与平滑肌细胞凋亡阳性率的比值，球囊组大于支架组。【结论】支架组较球囊组导致明显的平滑肌细胞增殖，同时也导致更显著的平滑肌细胞凋亡，使支架植入后再狭窄的程度减轻。
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洛沙坦抑制平滑肌细胞增殖和神经肽Y作用的关系
【目的】 探讨洛沙坦(Losartan)对高血压病人血管重塑的作 用机制以及肾素-血管紧张素系统和神经肽Y(NPY)在高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病发 生的作用。【方法】 实验分为对照组、Losartan组、NPY组及Losartan+NPY 4组，应用生物 化学方法(MTT)和荧光免疫组化定量技术(ACAS 570共聚焦激光扫描显微细胞仪)，每组扫描 细 胞总数在200个以上，观察Losartan对体外培养血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响和与NPY作 用的关系。【结果】 对照组、Losartan组、NPY组及Losartan+NPY 4组VSMC增殖活度(吸光 度表示)分别为0.223 9±0.001 0、0.204 5±0.001 3、0.262 6±0.002 5、0.244 0±0.001 3，增殖细胞核抗原(PCNA)荧光值分别为1 543±200、1 339±233、1 649±233 、1 545±256。Losartan可抑制体外培养和NPY作用下VSMC的增殖，与对照组相比，VSMC增 殖活度和PCNA 的表达均明显降低(P<0.01)。【结论】 Losartan对高血压的治疗既有Losartan对VSMC 增殖的抑制作用，也有对NPY等缩血管因素的拮抗作用。
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脑动脉平滑肌细胞培养
脑血管平滑肌的舒缩是引起脑血管疾病发生的重要病理变化.血管平滑肌细胞功能的调节依赖胞浆游离Ca2+浓度.用共焦激光显微镜可以测试-个细胞内的Ca2+动态,但所用细胞需粘附在培养皿上且不能被液体冲掉,因此即使使用原代细胞也需培养一段时间.如没有共焦激光显微镜,使用RF-5000荧光分光光度计只能测定悬浮细胞内Ca2+浓度的动态变化,这就需要大量的活细胞才能测试.因此必须建立脑血管平滑肌细胞培养方法.本实验用改进的组织贴块法培养牛脑血管平滑肌细胞,方法简便,经济,通过电镜鉴
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血管平滑肌细胞中ABCA1对炎症因子的调节及其意义
目的:观察在8-Br-cAMP作用下,ABCA1对血管平滑肌细胞中细胞问黏附分子-1(ICAM-1)及单核细胞趋化因子-1(MCP-1)mRNA和蛋白质及IL-1β蛋白质表达的影响,在细胞水平证实ABCA1对动脉粥样硬化(AS)的影响.方法:复苏培养人主动脉平滑肌细胞CC2571,8-Br-cAMP(0.5 mmol/L)刺激3、6、12、24h后,荧光定量RT-PCR、Western蛋白印迹法及ELISA法检测ABCA1、ICAM-1、MCP-1及IL-1β mRNA和蛋白质表达量;用ABCA1的反义寡核苷酸(100 nmol/L)抑制ABCA1的表达,观察8-Br-cAMP刺激下上述指标的改变.结果:予8-Br-cAMP刺激后,主动脉平滑肌细胞CC2571中ABCA1、ICAM-1、MCP-1的mRNA和蛋白及IL-1β蛋白质表达均增高,给予反义寡核苷酸转染后8-Br-cAMP刺激3、6 h上述指标的mRNA表达降低,12、24 h蛋白质表达降低.结论:在主动脉平滑肌细胞,ABCA1可增加8-Br-cAMP诱导的炎症因子表达,参与AS的发生.
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恒磁场对血管紧张素Ⅱ诱导的人脐动脉血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及机制
目的:研究恒磁场对血管紧张素Ⅱ(angiotensin,AngⅡ)诱导的人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖及胞浆内游离钙离子浓度的影响.方法:建立Ang Ⅱ诱导的人脐VSMC增殖模型.5 mT恒磁场垂直作用于VSMC,用四唑盐比色法和3H-TdR掺入法检测增殖数量,流式细胞仪分析细胞周期.激光共聚焦显微镜技术观察恒磁场对VSMC胞浆游离钙离子浓度的影响.结果:5 mT的恒磁场能逆转AngⅡ所致的人脐动脉VSMC数量增多,阻止VSMC由静止期(G0/G1期)进入DNA合成期(S期)和有丝分裂期(G2/M期).5 mT的恒磁场作用10～50 min 使胞浆内钙离子浓度明显下降.结论:5 mT的恒磁场能抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖,对胞浆内的钙离子浓度有明显减少作用,适宜强度的恒磁场抑制VSMC增殖,是一种具有应用前景的治疗再狭窄的方法.
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过氧化氢酶过度表达对血管平滑肌细胞增殖的影响
目的:探讨腺病毒载体介导的过氧化氢酶基因转染对体外培养的人血管平滑肌细胞增殖的影响.方法:用含过氧化氢酶基因的重组腺病毒(AdCat)转染人血管平滑肌细胞,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法观察血管平滑肌细胞的增殖活性,同时用流式细胞术观察血管平滑肌细胞细胞周期的变化.结果:MTT比色法分析显示AdCat组明显抑制细胞增殖,与对照组相比差异有显著性(P＜0.05);细胞周期分析发现AdCat组G0/G1期分布百分率显著高于对照组,而S、G2/M期分布百分率显著低于对照组,细胞增殖能力下降(P＜0.05).结论:腺病毒载体介导的过氧化氢酶基因转染能抑制人血管平滑肌细胞的增殖.
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重组腺病毒AdCat转染增加血管平滑肌细胞中过氧化氢酶表达
目的:制备含过氧化氢酶基因的重组腺病毒,转染血管平滑肌细胞,观察过氧化氢酶表达水平.方法:将过氧化氢酶cDNA亚克隆至pShuttle-CMV中,将其和pAdEasy-1在细菌内进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAdEasy-1-Cat,再转染Ad-293细胞,包装成重组腺病毒颗粒;经纯化获取重组腺病毒AdCat.转染血管平滑肌细胞,Western blot鉴定细胞中过氧化氢酶表达.结果:正确构建了重组腺病毒载体,获得高滴度重组腺病毒,转染血管平滑肌细胞后过氧化氢酶高表达.结论:重组腺病毒AdCat转染增加血管平滑肌细胞中过氧化氢酶表达,为用过氧化氢酶基因进行再狭窄的防治打下了基础.
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川芎嗪对兔血管平滑肌细胞增殖及c-fos和c-myc基因表达的影响
目的:观察川芎嗪对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及c-fos、c-myc基因表达的影响.方法:对高脂诱导动脉粥样硬化模型兔体外培养的主动脉VSMC增殖模型应用3H-TdR掺入、流式细胞仪和cDNA探针原位杂交方法观察川芎嗪对VSMC增殖和c-fos、c-myc基因表达的影响.结果:川芎嗪可显著抑制兔VSMC增殖,使处于G1期的VSMC显著增多,S期和G2+M期的细胞减少;同时抑制VSMC中c-fos和c-myc基因的表达.结论:川芎嗪对VSMC增殖有显著抑制作用,其机制可能与抑制VSMC中c-fos和c-myc基因表达有关.
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兔动脉粥样硬化后血管平滑肌层肉碱棕榈酰基转移酶-1的表达变化
目的:观察兔动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)后血管平滑肌层肉碱棕榈酰基转移酶-1(carnitine patmitoyl transferase,CPT-1)mRNA表达变化,从能量代谢的角度去探讨AS形成的机制.方法:通过高胆固醇喂养建立兔AS模型,设对照组(普通饲料,n=8)、高脂组(高胆固醇饲料,n=9),第9周和第20周检测血清血脂水平包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL);第25周留取兔升主动脉、胸主动脉标本,病理形态学观察升主动脉组织学变化并进行病理形态学定量分析;逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)测定胸主动脉血管平滑肌层CPT-1 mRNA的表达.结果:高脂饮食诱导兔高胆固醇血症和AS模型,外周血TC、TG、LDL升高,病理组织学显示内膜(Ⅰ)/中层(M)厚度比值(I/M)、I+M、内膜/中层面积比值(SI/SM)增大,AS血管平滑肌层CPT-1表达下调,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:高胆固醇喂养明显升高兔血脂水平,AS血管平滑肌层CPT-1表达显著下调.
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硒对动脉平滑肌细胞增殖作用机制的探讨
目的:探讨硒(Se)拮抗同型半胱氨酸(hemocysteine,HCY)刺激大兔动脉平滑肌细胞(VSMCs)增殖的作用机制.方法:首先将兔胸主动脉 VSMCs进行培养,然后加入 250、 500、 1 000、 2 000、 4 000 μ mol/L不同浓度的 D,L-HCY,经 MTT方法的检测,选择 VSMCs增殖率适宜的浓度;在加入适宜 1 000 μ mol/L HCY的 VSMCs中再分别加入 50、 100、 200 μ mol/L不同浓度的硒代蛋氨酸(Se-Met).经姬姆萨染色,通过流式细胞技术观察细胞周期,提取细胞基因组 DNA进行琼脂糖凝胶电泳及谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的测定.结果:不同浓度的 Se-Met使 HCY作用的 VSMCs生长明显受到抑制(P< 0.05).但姬姆萨染色没有发现凋亡小体.流式细胞术检测到 S期细胞显著减少(P< 0.05),未检测到凋亡峰.基因组 DNA经琼脂糖电泳也没有发现细胞凋亡的典型梯状图谱.结论: HCY的促细胞增殖作用可能是通过氧化应激介导的,而 Se-Met可以拮抗 HCY的促平滑肌细胞增殖作用.因实验结果未见与细胞凋亡有关,Se-Met浓度与谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活性呈正相关,故考虑 Se-Met作用机制之一是与细胞的氧化应激反应有关.
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IFN-γ对血管内膜损伤后平滑肌细胞增殖和内膜形成的影响
目的:为临床应用γ干扰素(IFN-γ)防治经皮冠状动脉成形术后再狭窄提供理论依据.方法:建立兔髂动脉再狭窄动物模型,动态观察体内给予重组γ干扰素(rIFN-γ)对血管内膜平滑肌细胞(vSMCs)增生和内膜形成的抑制作用.结果:rIFN-γ可显著抑制1周和2周时内膜面积,抑制率分别为60.00%和66.67%;抑制1周和1个月时内膜vSMCs表达增殖细胞核抗原,抑制率分别为88.50%和58.89%.结论:IFN-γ通过抑制vSMCs的增生减少内膜的形成并可能用于临床防治再狭窄.
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gax基因与血管平滑肌细胞增殖
gax基因是一个主要存在于心血管系统的同源盒基因,能显著抑制血管平滑肌细胞增殖,有望成为防治动脉粥样硬化和经皮血管介入治疗后再狭窄的靶基因.
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流式细胞仪对缺氧条件下大鼠肺动脉平滑肌细胞周期和细胞凋亡的测定
慢性阻塞肺病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)发展的一个重要病理进程就是肺血管结构改造,表现为动脉平滑肌细胞异常的增生肥大,导致血管中膜增厚血管肌化,成纤维细胞增殖等变化.各种病因作用于机体终导致缺氧.本实验通过培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMC)来进行缺氧处理,可以从细胞水平上探明缺氧在COPD中的作用.本实验是利用流式细胞技术对通过缺氧处理的培养ASMC细胞进行细胞周期和细胞凋亡可以方便快捷地检测各种细胞参数.
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姜黄素在糖基化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞脂质聚积中的作用机制研究
目的 研究姜黄素在糖基化低密度脂蛋白(AGE-LDL)诱导的血管平滑肌细胞脂质聚积中的作用机制.方法 体外制备并检测AGE-LDL,将AGE-LDL及不同浓度的姜黄素作用于大鼠血管平滑肌细胞系A7r5,分别设置空白对照组、AGE-LDL处理组、10μmol/L姜黄素处理组、20μmol/L姜黄素处理组和10、20μmol/L姜黄素+3-MA处理组;Western blot检测B类I型清道夫受体(SRB1)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、自噬相关蛋白Beclin和SQSTM1/p62蛋白表达水平;油红O染色检测脂质聚积程度.结果 体外糖基化修饰的LDL硫代巴比妥反应显著降低、电泳迁移率明显增加,表明AGE-LDL构建成功.Western blot实验结果显示,与空白对照组相比,姜黄素处理组明显上调AGE-LDL诱导的SRB1的表达,并具有一定的浓度依赖效应.姜黄素还能够抑制p-GSK3β和p-mTOR的表达水平,增加细胞的自噬水平(beclin表达升高和p62表达下降).油红O染色实验证实,AGE-LDL处理组脂质聚积明显,而姜黄素各处理组脂质聚积减弱,但3-MA各处理组脂质聚积进一步增加.结论 姜黄素可促进血管平滑肌细胞SRB1表达,抑制其脂质聚积,机制可能与通过GSK-3β/mTOR途径增加自噬相关蛋白表达有关.
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Wnt3a通过整合素连接激酶调节血管平滑肌细胞迁移和黏附
目的 探讨重组Wnt3a蛋白对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移和黏附的影响及相关机制.方法 原代培养大鼠VSMCs,实验分为Wnt3a组和对照组,通过Transwell实验检测VSMCs的迁移能力,细胞基质黏附实验检测VSMCs黏附细胞外基质的能力,Western blot检测VSMCs中β-连环蛋白(β-catenin)、磷酸化β-catenin(Ser675)、糖原合成激酶3β(GSK-3β),磷酸化GSK-3β(Ser9)、整合素连接激酶(ILK)的蛋白表达水平.结果 Wnt3a组中VSMCs迁移的数量明显高于对照组(P<0.05).与对照组相比,Wnt3a组中VSMCs黏附于胶原Ⅰ的数量和光密度值均显著增加(P<0.05),且Wnt3a组中磷酸化β-cate-nin(Ser675)、磷酸化GSK-3β(Ser9)和ILK蛋白的表达水平均显著上调(P<0.05).结论 Wnt3a可以通过ILK调节VSMCs迁移和黏附.
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胃促生长素对人主动脉平滑肌细胞增殖及线粒体融合蛋白2表达的影响
目的 通过体外培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs),研究胃促生长素(ghrelin)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及线粒体融合蛋白2(Mfn-2)表达的影响.方法 体外培养HASMCs,第4～6代细胞用于试验.给予不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L)的ghrelin 或10-6 mol/L ghrelin不同时间(0、6、12、18、24 h)处理,用四甲基偶氮唑蓝比色(MMT)法观察其对HASMC增殖的影响.RT-PCR,Western blot方法检测不同处理方法对Mfn-2表达的影响.结果 10-7～10-5 mol/L的ghrelin可明显抑制HASMC增殖,浓度为10-6 mol/L抑制作用为明显(P<0.01).ghrelin在6～24 h内均能明显抑制HASMC增殖,在24 h达高峰(P<0.01).10-6 mol/L ghrelin能明显上调Mfn-2 mRNA和蛋白的表达(P<0.01).10-6 mol/L ghrelin在18 h上调Mfn-2 mRNA和蛋白表达的作用为明显(P<0.01).结论 ghrelin可能通过上调Mfn-2的表达来抑制HASMC增殖.
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缬沙坦对血管平滑肌细胞增殖、迁移及p-ERK1／2、p-P38表达的影响
目的：观察缬沙坦（Val）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激下大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）的增殖与迁移及对p-ERK1／2、p-P38表达的影响。方法组织贴块法培养VSMCs ，取3～5代细胞进行实验。采用MTT法检测Val对AngⅡ诱导下细胞增殖的影响，采用划痕试验法进行细胞迁移实验，采用蛋白质印迹法检测VSMCs中ERK1／2、p-ERK1／2、P38、p-P38的表达。结果（1）AngⅡ能明显促进VSMCs的增殖，AngⅡ促进VSMCs增殖的作用能被Val和PD98059所抑制，并且Val呈浓度依赖性抑制VSMCs增殖。SB23015能明显促进VSMCs增殖。（2）细胞经AngⅡ作用后，迁移活性明显增加，Val及PD98059抑制AngⅡ诱导的大鼠VSMCs迁移，但SB23015作用与之相反。（3）Val和 PD98059能抑制AngⅡ的促VSMCs胞内p-ERK1／2表达的作用，而SB23015则能增强这种作用。Val和SB23015能抑制AngⅡ的促VSMCs胞内p-P38表达的作用，而PD98059则对此无显著影响。（4）Val单独作用于VSMCs时，对细胞的增殖、迁移及p-ERK1／2、p-P38的表达均无明显影响。结论（1）Val呈浓度依赖性抑制AngⅡ诱导VSMCs的增殖和迁移。（2）Val抑制AngⅡ诱导VSMCs的增殖和迁移与其抑制AngⅡ诱导的p-ERK1／2的表达相关。（3）p-P38对AngⅡ诱导的p-ERK1／2的激活起负调节作用。
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6-姜酚降低血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞衰老的机制研究
目的：探讨6‐姜酚对血管平滑肌细胞（VSMCs）病理衰老的影响及机制。方法培养的VSMCs细胞，给予血管紧张素Ⅱ（A ng Ⅱ）刺激及6‐姜酚干预，采用β‐半乳糖苷酶染色检测细胞衰老变化，流式细胞术检测细胞周期分布，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测mTOR蛋白表达及其底物P70‐S6K磷酸化水平。结果 Ang Ⅱ显著增加VSMCs的β‐半乳糖苷酶染色率、G0/G1期停滞、mTOR蛋白表达及P70‐S6K磷酸化，而6‐姜酚能显著干预上述 Ang Ⅱ诱导的细胞衰老表型及相关信号分子变化。结论6‐姜酚可能通过抑制mTOR/P70‐S6K降低Ang Ⅱ诱导的VSMCs衰老。
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酶消化法分离老龄SD大鼠血管平滑肌细胞
目的 采用酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞,为血管疾病的研究提供大量的原代平滑肌细胞.方法 无菌取老龄SD大鼠主动脉,采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化分离血管平滑肌细胞,自然纯化及差速贴壁纯化血管平滑肌细胞,免疫组化鉴定平滑肌细胞α肌动蛋白.结果 免疫组化染色显示细胞纯度在95%以上.结论 酶消化法用于血管平滑肌细胞的培养有利于获得大量的高纯度细胞供实验研究.
