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Cl-通道在小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖中的作用
为探讨Cl-通道在小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖中的作用 , 采用细胞计数和氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入实验,并结合fura-2荧光测定细胞浆Ca2+ 浓度等技术,研究了Cl- 通道阻断剂对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响.结果发现,Cl-通道阻断剂4,4-二异硫氰酸二丙乙烯2,2-二磺酸(DIDS,0.01 μmol/L～0.1 mmol/L)可抑制5%小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖,其作用具有时效性和量效性,其它Cl-通道阻断剂如茚满羟基丙酸 (IAA- 94 ,0.1 μmol/L～1 mmol/L)、5-硝基-2-(3-苯丙氨基)苯甲酸(NPPB,0.1 μmol/L～1 mmo l/L)、4-乙酰氨基-4-异硫氰酸-2,2-二磺酸(SITS,0.1 μmol/L～1 mmol/L)、二苯丙氨基-2,2-二羧酸 (DPC,0.1 μmol/L～1 mmol/L)和速尿(10 μmol/L～1 mmol/L)等均无此作用,且DIDS对电压依赖性钙通道没有直接的影响.结果提示小牛血清可以开放DIDS敏感的Cl-通道,且该通道可能在小牛血清引起的血管平滑肌细胞增殖的调控上起着一定的作用.
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雌二醇对大鼠血管内皮素1和平滑肌细胞增殖的影响(摘要)
8周龄雌性Wistar大鼠随机分为双侧卵巢切除组卵巢切除后大鼠血浆E2水平显著下降,血浆和组织ET-1均明显升高;肌注E2后血浆E 2水平明显升高(P< 0.05),血浆和组织ET 1回落到假手术组水平.
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血管内皮生长因子预防血管成形术后再狭窄的机理
为探讨血管内皮生长因子预防血管成形术后再狭窄的机理，构建含人血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒，感染体外培养的血管平滑肌细胞，将人脐静脉内皮细胞和血管平滑肌细胞分别分成对照组、H2O2处理组和H2O2 + 血管内皮生长因子处理组，采用WST-1比色法、原位末端标记法及流式细胞术检测各组细胞光密度值和凋亡发生情况。结果发现，人脐静脉内皮细胞中，与对照组和H2O2 + 血管内皮生长因子处理组比较,H2O2处理组光密度值降低,凋亡细胞明显增加；血管平滑肌细胞中上述改变相反。提示H2O2能促进平滑肌细胞增殖，诱导内皮细胞凋亡，抑制内皮细胞增殖及平滑肌细胞凋亡，促进再狭窄的发生，而血管内皮生长因子能拮抗H2O2的作用，有利于再狭窄的防治，为血管内皮生长因子预防再狭窄提供新的理论依据。
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白细胞介素10抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的信号途径
为探讨白细胞介素10抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的细胞信号机制，采用3H-TdR掺入的方法检测血管平滑肌细胞 DNA合成，32P-ATP掺入检测丝裂素活化蛋白激酶和蛋白激酶C活性，蛋白免疫印迹杂交及免疫沉淀方法检测粘着斑激酶蛋白表达及其活性变化。结果显示，白细胞介素10呈浓度依赖性抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖，同时下调血管紧张素Ⅱ引起的丝裂素活化蛋白激酶、蛋白激酶C和粘着斑激酶信号的激活（P<0.05或P<0.01）。因此白细胞介素10可能通过下调血管紧张素Ⅱ刺激的丝裂素活化蛋白激酶、蛋白激酶C和粘着斑激酶等增殖相关信号的激活而抑制其刺激的血管平滑肌细胞增殖。
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氟伐他汀对兔髂动脉内皮剥脱后增生内膜的影响及其作用机制的探讨
为探讨氟伐他汀对内膜增厚的影响及其与细胞增殖、细胞凋亡的关系，将雄性新西兰白兔56只随机平分为用药组和非用药组，用高胆固醇饮食和球囊导管剥脱内皮造成动脉粥样内皮损伤，分别在内皮损伤后1、2、4和8 w处死动物并取髂动脉，用常规HE染色、免疫组织化学染色、原位细胞凋亡检测和计算机图像分析方法，观察氟伐他汀对动脉新生内膜厚度和内膜/中膜厚度比、平滑肌细胞增殖和细胞凋亡的影响。结果发现，用药组的新生内膜厚度和内膜/中膜厚度比明显薄于非用药组 (P<0.01)， PCNA阳性细胞率及Actin含量均明显少于非用药组 (P<0.05)，细胞凋亡率随用药时间延长而逐渐增高，且各时间点均高于非用药组 (P<0.05)。以上提示，氟伐他汀能有效抑制血管内膜过度增生，可能与其抑制平滑肌细胞增殖并可促进细胞凋亡有关。
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导向药物转化生长因子α-Sporin对增殖平滑肌细胞生长的抑制作用
为证实生物导向药物对平滑肌细胞增殖的作用，用SPDP化学联结法合成了转化生长因子α-Saporin，通过MTS比色法观察了转化生长因子α-Saporin对培养中的增殖平滑肌细胞的细胞毒性作用，并用氚标胸腺脱氧嘧啶核苷掺入法进一步探讨了转化生长因子α-Saporin对平滑肌细胞的DNA合成的影响以及过量转化生长因子α对转化生长因子α-Saporin的受体竞争抑制作用。结果发现，联结后的转化生长因子α-Saporin可明显抑制平滑肌细胞的增殖，而Saporin的抑制作用却很弱。转化生长因子α-Saporin对培养的平滑肌细胞氚标胸腺脱氧嘧啶核苷掺入量有明显抑制作用，与对照组比较氚标胸腺脱氧嘧啶核苷掺入量降低了39.1% （P=0.0017），而在加入表皮生长因子受体的配体转化生长因子α后可明显竞争抑制转化生长因子α-Saporin对平滑肌细胞增殖的细胞毒性作用。实验结果提示：转化生长因子α-saporin通过表皮生长因子受体介导已具有较Saporin明显增强的细胞毒性作用，本实验为转化生长因子α-saporin在经皮腔内冠状动脉成形术术后再狭窄的临床防治中的应用的研究提供初步的实验依据。
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氯沙坦对血管平滑肌细胞内单核细胞趋化因子-1表达的影响
为了探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂氯沙坦对血管平滑肌细胞内单核细胞趋化蛋白-1表达的影响，以培养幼兔主动脉平滑肌细胞为研究对象，分别给予不同浓度血管紧张素Ⅱ和/或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂氯沙坦，采用免疫组织化学、原位杂交与酶联免疫吸附技术检测不同处理组平滑肌细胞内单核细胞趋化蛋白-1蛋白及其mRNA表达和平滑肌细胞培养介质中单核细胞趋化蛋白-1含量的变化。结果发现，10-6～10－10 mol/L 血管紧张素Ⅱ呈剂量依赖性地增加平滑肌细胞内单核细胞趋化蛋白-1蛋白及其mRNA表达水平，增高培养介质中单核细胞趋化蛋白-1蛋白含量（P均< 0.001）。10-5～10-7 mol/L氯沙坦预处理使血管紧张素Ⅱ刺激的平滑肌细胞内单核细胞趋化蛋白-1蛋白及其mRNA表达水平及培养介质中单核细胞趋化蛋白-1蛋白含量明显减低（P均 < 0.001）。以上结果提示，氯沙坦可拮抗血管紧张素Ⅱ所致的平滑肌细胞内单核细胞趋化蛋白-1的表达与分泌，这可能有助于减轻或防治某些病理状态下血管平滑肌细胞的增殖与迁移。
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川芎嗪对血管平滑肌细胞增殖及表达c-myc基因的影响
为观察川芎嗪对血管平滑肌细胞增殖的影响,在建立凝血酶诱导的体外培养的兔主动脉血管平滑肌细胞增殖模型后,应用免疫细胞化学方法观察川芎嗪对血管平滑肌细胞表达c-myc基因蛋白的影响;并用流式细胞术观察了血管平滑肌细胞增殖周期的变化.结果发现,川芎嗪能够显著抑制凝血酶诱导的血管平滑肌细胞c-myc基因蛋白表达增加,使血管平滑肌处于G1期的细胞数显著增多,S期和G2+M期的细胞数显著减少.结果提示,川芎嗪对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖有显著抑制作用,其机制与抑制c-myc 基因表达有关.
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细胞内游离钙离子在神经肽Y刺激血管平滑肌细胞增殖中的作用
为探讨细胞内游离钙离子在神经肽Y刺激血管平滑肌细胞增殖过程中的变化,以体外培养的血管平滑肌细胞模型为研究对象,运用激光共聚焦显微镜和免疫荧光组织化学技术,定量和动态观察了神经肽Y对血管平滑肌细胞内游离钙离子浓度与血管平滑肌细胞增殖间的相互关系.结果发现,神经肽Y组中血管平滑肌细胞的增殖活度(MTT法)和增殖细胞核抗原的表达较对照组明显增强;与此同时,神经肽Y作用下体外培养的血管平滑肌细胞内游离钙离子浓度也逐渐升高.此结果提示,神经肽Y刺激血管平滑肌细胞增殖的细胞内信号传导机制与神经肽Y提高细胞内游离钙离子浓度有关.
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不同切应力下的内皮细胞条件培养基对平滑肌细胞增殖和胶原合成的影响
为研究不同切应力下内皮细胞条件培养基对平滑肌细胞和胶原合成的影响,建立平行平板流动腔模型,模拟产生定常层流,采用3H-胸腺嘧啶核苷掺入法和胃蛋白酶消化法,测定细胞DNA和胶原合成量.实验发现,与单用10%牛血清DMEM培养基比较,静态培养的内皮细胞条件培养基促使平滑肌细胞 DNA和胶原合成,3H-胸腺嘧啶核苷掺入量从749±53 cpm/103细胞上升至1 202±63 cpm/103 (P<0.01),平滑肌细胞掺入2,3-3H-羟脯氨酸量从30±6 cpm/103细胞上升至47±4 cpm/103细胞(P<0.01).内皮细胞在10和25 dyn/cm2切应力剪切18 h后,内皮细胞条件培养基对平滑肌细胞DNA和胶原合成促进效应分别下降了10.41%±5.66%、 23.97%±6.23%和45.71%±2.93%、64.53%±2.42% .由此提示内皮细胞所受血流切应力减小后,其条件培养基能促使平滑肌细胞的增殖和胶原合成.
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P85磷酯肌醇-3激酶-蛋白激酶C-ζ复合物对血管紧张素Ⅱ激活平滑肌细胞p70核蛋白体S6激酶的调节作用
作者以前的研究发现蛋白激酶C-ζ介导血管紧张素Ⅱ经Ras-MEK途径激活血管平滑肌细胞丝裂素活化的蛋白激酶MAPK或细胞外信号调节激酶ERK1/2.本文研究了P85磷酯肌醇-3激酶-蛋白激酶C-ζ复合物核蛋白体激酶p70S6激酶活性的调节作用及其信号传递途径. Western Blot分析显示正常培养的血管平滑肌细胞表达p70S6激酶、p85磷酯肌醇-3激酶和蛋白激酶C-ζ.100 nmol血管紧张素Ⅱ和 10 μg/L 血小板源生长因子刺激并不影响p70S6激酶、p85磷酯肌醇-3激酶和蛋白激酶C-ζ表达. p70S6激酶磷酸转移酶活性分析发现血管紧张素Ⅱ与血管平滑肌细胞作用5 min 即开始激活p70S6激酶, 20 min达高峰, 并呈剂量依赖性.磷酯肌醇-3激酶抑制剂wortmannin (10 nmol)、蛋白激酶C-ζ抑制剂Pseudo Z (50 μmol) 和p70S6激酶抑制剂rapamycin (100 μg/L) 均可明显阻断血管紧张素Ⅱ诱导的p70S6激酶激活.有趣的是,我们观察到p85磷酯肌醇-3激酶和蛋白激酶C-ζ受血管紧张素Ⅱ和血小板源生长因子刺激后均向Ras转位并与之结合, 抗Ras抗体可将p85磷酯肌醇-3激酶或蛋白激酶C-ζ混合沉淀, 抗p85磷酯肌醇-3激酶抗体亦可使蛋白激酶C-ζ沉淀下来. 提示Ras、p85磷酯肌醇-3激酶和蛋白激酶C-ζ三种蛋白结合在一起形成一个功能复合体,Wortmannin和Pseudo Z可阻断这个功能复合体的形成.此外,血管紧张素Ⅱ和血小板源生长因子与血管平滑肌细胞孵育24 h 明显促进细胞增殖,氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入率增加约50%, Wortmannin和非特异性蛋白激酶C抑制剂Chelerythine均抑制血管紧张素Ⅱ和血小板源生长因子对血管平滑肌细胞的促增殖作用.综合上述结果, 说明血管紧张素Ⅱ通过Ras-磷酯肌醇-3激酶-蛋白激酶C-ζ途径激活p70S6激酶和刺激血管平滑肌细胞增殖, p85磷酯肌醇-3激酶-蛋白激酶C-ζ复合物在其中起重要调节作用.
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碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6促进大鼠血管平滑肌细胞增殖的协同作用
为观察碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6促进血管平滑肌细胞增殖的协同作用,采用大鼠主动脉贴块法培养血管平滑肌细胞,用5-溴-2-脱氧尿嘧啶掺入法和细胞计数法观察碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6对平滑肌细胞增殖的影响.结果发现, 0～10.0 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子和0～100 μg/L白细胞介素6能促进平滑肌细胞增殖,且呈剂量依赖性,1.0 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和1.0 μg/L白细胞介素6促进细胞增殖,且48 h内呈时效依赖性,作用高峰在24 h,两者合用促进细胞增殖作用大于两者单用作用之和,呈协同作用.
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25-羟基胆固醇促进培养的家兔主动脉中膜细胞体外钙化
为研究主动脉中膜细胞体外钙化情况以及25-羟基胆固醇对此过程的促进作用,采用贴块法分离培养主动脉中膜细胞,并进行von Kossa染色以显示钙化,生物化学检测细胞不溶性钙,放射免疫法测定培养上清液中骨钙素含量.发现原代细胞有两种生长表现:一种细胞平行生长,不形成结节,von Kossa染色阴性;另一种易形成结节,von Kossa染色阳性.对照组传代细胞培养28天无结节形成,von Kossa染色阴性.而实验组,即25-羟基胆固醇处理组有细胞结节形成,von Kossa染色阳性,培养上清液中骨钙素增多.由此可见体外培养的主动脉中膜细胞有两种亚型,一种为平滑肌细胞的表型;另一种为微血管周细胞型细胞,能使其细胞外基质钙化.25-羟基胆固醇可以促进这一体外钙化过程.周细胞型细胞钙化过程中骨钙素合成增多,推测骨钙素可能参与了主动脉的钙化.
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肝素及小肝素分子对培养平滑肌细胞的双重调节作用
为研究肝素及小肝素分子对培养的平滑肌细胞生长的作用,以探讨其是否可以作为一种抗血管平滑肌细胞增殖的药物,采用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法观察肝素及小肝素分子对培养的人主动脉平滑肌细胞合成DNA的影响.肝素及小肝素分子的量以糖醛酸表示,以其浓度计算(18、 35和70 mg/L).结果发现,肝素及小肝素分子对生长良好的平滑肌细胞有抑制作用,不同浓度肝素的抑制率分别为66%、69%和69%,而不同浓度小肝素分子抑制率分别为60%、68%和67%.肝素及小肝素分子对生长不良的平滑肌细胞有促增殖作用,肝素促增殖率为149%、140%和180%,小肝素分子为207%、246%和309%.结果提示肝素及小肝素分子对培养不同状态的平滑肌细胞有抑制或促进增殖的双重调节作用.
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内皮素对离体肺动脉及肺动脉平滑肌细胞的作用
通过发现内皮素对肺动脉及肺动脉平滑肌细胞功能的可能影响,以便进一步探讨内皮素在缺氧性肺动脉高压发病中的作用.取大鼠肺动脉制成3 mm长的血管环,让血管环在佳静息张力下平衡一段时间后,按累积法向浴槽内加入内皮素1,用二道生理记录仪记录不同浓度的内皮素1对血管环收缩功能影响.另采取单层贴壁培养家兔肺动脉中膜平滑肌细胞,在低血清培养条件下,加入不同浓度的内皮素1,分别用氚标胸腺嘧啶和氚标亮氨酸掺入率来评估内皮素1对肺动脉平滑肌细胞DNA和蛋白质合成的促进作用.结果发现: ①内皮素1能引起肺动脉剂量依赖性收缩(r=0.935, P<0.05),在(1～12)×10-9mol/L浓度范围内,内皮素1所引起的血管张力迅速上升,由40±6 mg上升至347±12 mg, 当浓度高于12×10-9mol/L时,收缩张力上升速度减慢.②当内皮素1浓度为1×10-11～1×10-8mol/L时,肺动脉平滑肌细胞氚标胸腺嘧啶脱氧核苷和氚标亮氨酸掺入率呈现剂量依赖性增加(r分别为0.756和0.840, P<0.05),其EC50分别为10.87 mol/L和8.54 mol/L.结果提示,内皮素具有较强的肺血管活性.
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葡萄糖和胰岛素对大鼠血管平滑肌细胞磷脂酶A2活性的影响
为观察葡萄糖和胰岛素对血管平滑肌细胞磷脂酶活性的影响,在培养基中分别加入一定浓度的葡萄糖或(和)胰岛素与大鼠血管平滑肌细胞共同孵育72 h后,分别测定培养上清液中磷脂酶A2活性和Na+-K+依赖式ATP酶活性,磷脂酶A2活性检测采用[3 H]-油酸标记法, Na+-K+依赖式ATP酶活性检测采用以ATP.2Na为底物的比色法.结果发现大鼠血管平滑肌细胞暴露于高糖或(和)高胰岛素环境中,上清液中磷脂酶A2活性增加,而Na+-K+依赖式ATP酶活性下降,并在一定浓度范围内呈剂量依赖性.葡萄糖浓度由5.6 mmol/L增加到33.0 mmol/L,上清液中磷脂酶A2活性由(4.2±0.2)×1012/(min.L)增加到(9.2±0.2)×1012/(min.L);而Na+-K+依赖式ATP酶活性由4.8±1.02 μmol/(g.min)下降到2.06±0.99 μmol/(g.min).胰岛素浓度由5.0 Mu/L增加到1 000 Mu/L,上清液中磷脂酶A2活性由(3.8±0.4)×1012/(min.L)增加到(11.8±0.6)×1012/(min.L);而Na+-K+依赖式ATP酶活性由4.0±1.68 μmol/(g.min)下降到2.19±1.02 μmol/(g.min),且进一步发现这一效应在作用24 h后才显著,高糖和高胰岛素有协同作用.结果提示磷脂酶A2活性增高与糖尿病时动脉粥样硬化形成有关,合理应用磷脂酶A2抑制剂有助于防止或延缓糖尿病并发动脉粥样硬化的发展.
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雌二醇抑制大鼠动脉损伤后内膜增生
为探讨雌二醇对去势大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的影响,选择8-10周S-D大鼠,雌性、雄性各21只,各分三组:非去势对照组(n=7)、去势对照组(n=7)和实验组(n=7,去势+雌二醇).腹腔注射雌二醇三天后,以2.0F经皮腔内冠状动脉成形术球囊损伤左颈总动脉.动脉损伤两周后处死大鼠,测量内膜面积、内膜面积与中膜面积的比值.结果发现,雄性实验组内膜面积(0.072±0.020 mm2 )、内膜面积与中膜面积的比值(0.533±0.037)均显著小于非去势对照组(0.110±0.018 mm2和0.740±0.051, P均<0.01)和去势对照组(0.098±0.014 mm2和0.701±0.040,P均<0.05).雌性实验组内膜面积(0.061±0.015 mm2)、内膜面积与中膜面积比值(0.525±0.030)均显著小于去势对照组(0.101±0.018 mm2和0.710±0.031, P均<0.01),但与非去势对照组(0.078±0.012 mm2和0.619±0.041)差异不显著(P均>0.05).提示雌二醇能抑制去势大鼠动脉损伤后内膜增生.
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家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基抑制血管平滑肌细胞增殖
为探讨血管平滑肌细胞自分泌和旁分泌对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用,采用家兔主动脉贴块培养法培养血管平滑肌细胞,并制备平滑肌细胞条件培养基. 采用孔径100 kDa和10 kDa的Millipore滤膜,将平滑肌细胞条件培养基分部.平滑肌细胞增殖测定采用宝灵曼试剂盒XTT法.结果提示,家兔血管平滑肌细胞条件培养基抑制血管平滑肌细胞的增殖,浓度50%的平滑肌细胞条件培养基抑制血管平滑肌细胞的增殖率高达45%,且该生长抑制活性物质具有剂量依赖、加热56℃ 30 min稳定和分子质量小于10 kDa的特点.
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三七总皂甙对人高脂血清诱发的胎儿血管平滑肌细胞增殖的抑制作用
为观察三七总皂甙对高脂血清刺激的人胎儿血管平滑肌细胞增殖的抑制作用.利用体外细胞培养技术,用人高脂血清造成血管平滑肌细胞增殖的模型并通过MTT测定、细胞计数及透射电镜下的细胞超微结构的观察等方法,观察了三七总皂甙对人胎儿血管平滑肌细胞的保护作用.结果发现,人高脂血清可明显刺激人胎儿血管平滑肌细胞的增殖并引起其表型的改变.而三七总皂甙可呈浓度依赖性地抑制血管平滑肌细胞的增殖并可显著抑制高脂血清对血管平滑肌细胞的促增殖作用.此结果提示,三七总皂甙的抗动脉粥样硬化作用可能部分是通过抑制血管平滑肌细胞异常增殖来实现的.
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凝血酶对大鼠血管平滑肌细胞血小板源性生长因子基因表达的影响
为了研究凝血酶对血管平滑肌细胞血小板源性生长因子基因表达的影响,探讨凝血酶刺激血管平滑肌细胞增殖的机制,通过培养SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞 ,以3H-TdR掺入率作为评价凝血酶促血管平滑肌细胞增殖的指标 ;用反转录聚合酶链反应检测凝血酶对血管平滑肌细胞血小板源性生长因子A链mRNA表达的影响;用Dot blot检测凝血酶对血管平滑肌细胞血小板源性生长因子B链mRNA表达的影响. 结果表明,凝血酶促血管平滑肌细胞增殖呈浓度依赖性和时间依赖性,血管平滑肌细胞在基础状态下可检测到血小板源性生长因子A和B链mRNA表达,凝血酶刺激血管平滑肌细胞后2 h 血小板源性生长因子A 链mRNA表达开始增加,4～6 h达高峰,持续12 h,24～48 h 恢复正常.提示凝血酶对血管平滑肌细胞具有较强的促增殖作用,凝血酶促血管平滑肌细胞的增殖作用部分可能是通过诱导血管平滑肌细胞血小板源性生长因子A链mRNA的表达来实现的.
