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从胚胎干细胞基本生命活动研究肾为先天之本的思路
肾为先天之本,主藏精,其精气促进人体的生长、发育和生殖,是人体生命活动的原动力.现代医学与生命科学已明确地表明,人体的发育始于受精卵,而受精卵本身就是一种全能干细胞;受精卵以及随后形成的胚胎干细胞体系构成生长发育与修复的源泉.因此,从中医肾的角度理解胚胎干细胞,观察补肾(滋肾阴、温肾阳)对胚胎干细胞增殖、衰老、凋亡等基本生命活动的影响与干预,以及补肾对胚胎干细胞功能关键决定基因等基因转录、表达以及功能的影响,为中医肾理论研究以及正在进行的胚胎干细胞研究提供新的线索与起点.
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小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养及饲养层制备
目的 建立小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层,用于胚胎干细胞的培养.方法 取孕13～ 15d的昆明种小鼠,分离原代成纤维细胞,在37℃时,用0.25％胰蛋白酶(含0.04％ EDTA)消化组织块5min,重复消化多次,24h首次换液,培养3d后传代.采用10μg/mL丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞3h,制备出的饲养层细胞能有效地抑制胚胎干细胞的分裂,且不影响其活力.结果 胎鼠分离原代成纤维细胞经10μg/mL丝裂霉素C处理后,细胞仍保持分泌多种生长因子的能力,在10d内既不增殖,也不死亡,能够很好的维持胚胎干细胞克隆的生长.结论 该方法制备的饲养细胞层适用于胚胎干细胞的培养.
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胚胎干细胞与聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯共培养细胞补片的初步研究
目的 干细胞移植是具有治疗心血管疾病潜力的有效方法,但是细胞移植过程中缺乏有效的载体会大大影响其成活和增殖.聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯P(3HB-co-4HB)是一种能够完全降解的,具有良好物理特性的高分子材料.探讨P(3HB-co-4HB)这种三维材料是否适合胚胎干细胞在上面生长,并生成细胞补片.方法 复苏小鼠胚胎干细胞,传代培养,消化离心后重悬细胞,用悬滴法形成拟胚体(embryid bodies,EB),将拟胚体与P(3HB-co-4HB)膜共培养;72 h共培养后固定并进行扫描电镜和共聚焦显微镜观察细胞黏附情况,DAPI荧光染色观察细胞在P(3HB-co-4HB)膜上形态.结果 胚胎干细胞在培养皿中贴壁生长良好,形态正常;拟胚体同P(3HB-co-4HB)膜共培养72 h后,所有拟胚体都在三维材料表面良好生长,爬膜率为100％;Confocal显微镜和扫描电镜观察到在2 mm的三维膜上,拟胚体生长贴附在生物膜上,细胞形态正常.结论 ESC在P(3HB-co-4HB)表面生长、增殖形成细胞补片.P(3HB-co-4HB)可作为干细胞治疗多种疾病的支架材料之一.
关键词： 胚胎干细胞 细胞补片 聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯 三维培养 -
胚胎干细胞的研究进展及其应用前景
胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是来源于囊胚内细胞团的一种多能细胞,具有分化的多向件和长期增殖的能力,已被广泛用于生命科学的许多领域,它潜在的医学应用也成为世界范围内的研究热点.本文综述了胚胎干细胞在诱导分化为表皮样干细胞、神经细胞、造血干细胞等方面的研究进展及其临床应用前景.
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胚胎干细胞移植治疗缺血性心脏疾病的研究进展
缺血性心脏疾病是威胁人类健康的头号杀手之一.冠状动脉阻塞引起心肌梗死,伴随心肌细胞大量死亡,损失的心肌细胞将被没有收缩功能的疤痕组织所替代,终导致心力衰竭.近年来,移植外源性干细胞替代受损心肌的治疗策略得到人们越来越多的关注,并取得诸多进展.其中,胚胎干细胞具有无限增殖和多向分化的特点,在向心肌细胞分化、与宿主心肌细胞整合和心肌电信号传导方面具有优势,因此,在移植治疗心肌梗死方面具有广阔的应用前景.然而,胚胎干细胞终应用于临床治疗晚期心脏疾病仍面临许多问题.本文就胚胎干细胞及其来源的细胞移植应用于缺血性心脏疾病治疗的研究进展作一综述.
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人类心血管系统疾病干细胞模型的研究进展
随着干细胞和人类遗传学研究的发展,患者特异细胞和组织模型已逐步进入到应用阶段.本文概述了在心血管疾病遗传模型方面利用多能干细胞的途径,包括ES细胞系的基因修饰,特异疾病iPS细胞的生成,先祖细胞的分离扩增等.以有效的方式利用这些干细胞模型,将推动疾病机理和药物治疗研究.
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与心肌细胞共培养的小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞分化
目的 探讨心肌细胞促进胚胎干细胞(ESCs)分化为心肌样细胞的诱导作用.方法 收集小鼠3.5 d胚龄的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,4～5 d后取内细胞团接种在饲养层上分离培养出ESCs.取3～5代ESCs,先将ESCs悬浮培养形成2～3 d的拟胚体(EBs),再与新生大鼠心肌细胞共培养诱导向心肌细胞分化,相差显微镜下观察分化细胞的形态学变化,免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)、α-肌动蛋白(α-actin)的表达.结果 诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的拟胚体出现,12 d时第2组约有93%的拟胚体出现节律性收缩,显著高于其他各组,均表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、β-actin,心肌细胞直接接触诱导组其分化比率达56.5%,高于其他各组,并且分化的细胞形态较单一.结论 心肌细胞和心肌细胞裂解液均可诱导ESCs向心肌细胞定向分化,且心肌细胞的诱导作用强于心肌细胞裂解液.
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小鼠胚胎干细胞来源的神经干细胞的稳定传代体系探索
目的 探讨体外诱导、获取均一的神经干细胞群(NSCs)的有效方法,并建立神经干细胞体外稳定传代扩增体系.方法 首先采用无血清的诱导培养基贴壁诱导mESCs形成神经上皮祖细胞(NPCs).然后将经添加表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子-2(FGF2)的无血清培养基短暂悬浮培养后的NPCs再贴壁培养,诱导形成NSCs.通过细胞系46C监测NPCs的形成,同时对分化细胞进行定量PCR和免疫荧光染色,在不同水平检测细胞分化效果.结果 mESCs神经诱导5 d出现大量Soxl+的NPCs；NPCs悬浮培养后,进一步诱导可得到形态均一的NSCs.第2代和第6代NSCs的神经干细胞标志定量PCR检测结果为:Pax6、Nestin、Mashl、BLBP高表达.第8代NSCs免疫荧光染色显示90％以上的细胞均为Nestin、RC2和Pax6阳性.结论 成功诱导mESC生成神经干细胞群,并且可以在体外连续稳定的传代.
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人胚胎干细胞抑制人肝癌细胞系SK-Hep1增殖并促进凋亡
目的 探究在人胚胎干细胞hESCs与人肝癌细胞系SK-Hep1共培养微环境中,hESCs对SK-Hep1人肝癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响.方法 建立hESCs与SK-Hep1人肝癌细胞系的非接触式共培养体系,将与hESCs共培养的SK-Hep1细胞作为实验组,单独培养的SK-Hep1细胞作为对照组.MTT法检测SK-Hep1细胞的增殖能力;Transwell小室法检测SK-Hep1的侵袭与迁移能力;Hoechst33258染色后观察共培养后SK-Hep1细胞核的变化;流式细胞术检测SK-Hep1细胞凋亡率.结果 与hESCs共培养后,SK-Hep1细胞的增殖能力受到抑制,随着时间增加,抑制效果越显著(P<0.05);细胞侵袭、迁移穿过Transwell小室的数量显著减少(P<0.05);发生核固缩、变形和浓染的SK-Hep1细胞较对照组增多;细胞凋亡比率较对照组显著增加(P<0.05).结论 人胚胎干细胞对SK-Hep1人肝癌细胞系有抑制作用.
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拟胚体贴壁时间对小鼠胚胎干细胞心肌分化的影响
目的 观察拟胚体(EB)贴壁时间对小鼠胚胎干细胞(ESC)心肌分化的影响并研究其机制.方法 用悬滴培养法促进ESCs形成EBs.EBs在不同的分化天数贴壁,观察搏动EBs百分比,RT-PCR检测Nkx2.5,GATA4和β-MHC mRNA表达,Western blot检测Src家族酪氨酸激酶磷酸化水平.结果 分化第3,4天贴壁组搏动EB百分比及Nkx2.5,GATA4,β-MHC表达水平显著低于分化第5,6和7天贴壁组(P ＜0.05);EB贴壁能够使Src激酶磷酸化水平升高,Src激酶阻断PP2能够抑制贴壁诱发的Src激酶磷酸化水平升高(P＜0.05);对于分化第4天贴壁组,在分化第4～6天使用PP2能够增加搏动EBs百分比及β-MHC表达水平(P＜0.05).结论 EB贴壁时间是影响ESC心肌分化的一个重要因素.在分化第4天或者之前贴壁可以显著抑制心肌分化,其机制可能是EB贴壁激活了Src激酶.
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小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞
目的 建立小鼠胚胎干细胞(mESCs)分化为胰岛素分泌细胞的体外诱导体系.方法 mESCs经拟胚体(EB)阶段,筛选出nestin阳性细胞,扩增培养后,用不同浓度烟碱对nestin阳性细胞进行诱导,观察诱导细胞的形态变化,并进行免疫组化染色、流式细胞仪分析和胰岛素分泌实验.结果 不同大小EB中nestin阳性细胞比例不同,直径为100 μm大小EB中较多.nestin阳性细胞经烟碱诱导15 d后,可形成分泌胰岛素的胰岛样细胞团,大部分细胞团胰岛素抗体检测为阳性.以10 mmol/L烟碱诱导分化后得到的胰岛素分泌细胞较0 mmol/L和5 mmol/L多,这些细胞在不同浓度葡萄糖刺激下能分泌不同量胰岛素.结论 10 mmol/L烟碱诱导小鼠ESCs 15 d,可获得较多胰岛素分泌细胞.
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食蟹猴胚胎干细胞的培养及向神经细胞诱导分化
目的 建立食蟹猴胚胎干细胞系体外培养体系,并诱导其向神经细胞分化,为在体移植实验奠定基础.方法 用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,长期培养食蟹猴胚胎干细胞.在无血清培养基中添加小鼠重组Noggin的方式诱导其向神经细胞分化,并对分化各阶段细胞进行免疫组化染色检测分化效果.结果 食蟹猴胚胎干细胞在饲养层上成克隆样生长,可以长期扩增超过20代并保持胚胎干细胞的特性.诱导向神经细胞分化约14 d,即可形成呈玫瑰花环样的神经前体细胞结构,可见大量Nestin阳性细胞,及部分Tuj-1阳性细胞;分化约21 d时,可见大量Nestin阳性细胞以及大量Tuj-1阳性细胞;分化超过35 d,可见GFAP阳性细胞,而Tuj-1阳性细胞减少.结论 成功建立食蟹猴胚胎干细胞的培养体系,在此基础上诱导其分化可获得大量神经前体细胞,尤其是早期神经细胞.
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FGF9和CHIR99021诱导胚胎干细胞形成肾脏样结构
目的 在体外诱导胚胎干细胞(ESCs)向肾脏细胞分化,并自发形成包含肾小球、近端小管、远端小管以及血管网络的肾脏样结构.方法 在体外将 ESCs 培养至40%~50%汇合度.然后在成纤维细胞生长因子9 (FGF9)与肝糖原合成激酶3β受体的选择性抑制剂CHIR99021的作用下,诱导ESCs分化形成肾脏样结构,对该肾脏样结构分别进行免疫荧光染色检查与电镜检查,以观察其内部结构并且成像记录.结果 通过细胞因子FGF9与CHIR99021的作用,成功诱导ESCs分化形成了肾脏样结构,结构鉴定证实其中有肾小球、近端小管、远端小管以及血管网络的存在.结论 利用ESCs分化可以形成包含完整肾单位及血管网络的肾脏样结构,其结构类似于正常肾脏.
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维甲酸定向诱导小鼠核移植胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化
目的 初步探讨体外条件下定向诱导小鼠核移植胚胎干细胞分化为雄性生殖细胞的条件,建立有效诱导分化技术平台.方法 分离BALB/c小鼠NT-ESCs样集落并鉴定.NT-ESCs消化后分4组:1)采用维甲酸诱导NT-EBs向雄性生殖细胞方向分化;2)未分化的NT-ESCs;3)分化培养前的NT-EBs;4)自主分化的NT-EBs;5)小鼠胚胎成纤维细胞.RT-PCR法检测各组Oct-4、VASA、Scp3、Sry、Tex14和β-actin的mRNA表达;免疫荧光染色法检测VASA、Scp3蛋白表达.结果 NT-ESCs集落性生长,符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性.NT-EBs维甲酸诱导组Oct-4、VASA、Scp3、Sry、Tex14和β-actin均有表达,对照组为阴性;NT-EBs细胞诱导分化后Scp3荧光强度为(+);实验组VASA荧光强度(+)也优于对照组的(±).结论 采用维甲酸诱导可促进核移植胚胎来源NT-ESCs分化为雄性生殖细胞.
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干细胞及其诱导技术在培育成体细胞、筛选药物和移植实验中的作用
利用干细胞及其诱导技术在实验室内培育出的成体细胞，可以为干细胞的基础研究及未来开展的针对人类疾病的临床移植试验创造条件。此外，干细胞及其诱导技术在药物筛选中也能发挥积极的作用。
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胚胎干细胞增殖分化相关基因
胚胎于细胞是从早期胚胎内细胞团中分离得到的,可以长久维持对称性自我更新的未分化状态,也可以分化成机体几乎所有类型的细胞.多种基因参与了胚胎干细胞增殖分化的调节.现对胚胎干细胞增殖分化相关基因进行综述.
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胚胎干细胞移植治疗帕金森病的研究进展
帕金森病(PD)是一种以中脑多巴胺神经元丢失为特征的中枢神经系统退行性疾病.近年来发现,胚胎干细胞(ESC)在体外可诱导分化为多巴胺能神经元,认为ES细胞是移植治疗PD较为理想的细胞,有着广泛的治疗前景.本文综述近年来治疗PD的临床研究、胚胎干细胞体外诱导产生多巴胺能神经元的方法及其应用进展.
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人脂肪组织源性间充质干细胞分离与体外培养
各种疾病所导致的器官衰竭严重地危害着人类的健康,降低了患者的生活质量.干细胞所具有的自我复制和多向分化能力使它成为挽救器官衰竭、进行组织修复的理想种子细胞.在特定的条件下它可以分化为中胚层起源的多种组织细胞,如成骨细胞、软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、血管内皮细胞、肌细胞及神经星状细胞等.目前干细胞主要来源于骨骼肌卫星细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞等,近几年国外有研究显示脂肪组织中也含有大量具有多向分化潜能的干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs),而目前国内应用脂肪组织分离及培养干细胞的报道极少.本研究拟将对ADMSCs进行分离和体外培养,并对其生长方式进行观察.
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小鼠囊胚内细胞团的生长行为
胚胎干细胞[1](ES细胞)是由着床前内细胞团(ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养而建立的克隆细胞系.能够广泛的分化成各种组织细胞,具有潜在的科研及应用价值.
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特异siRNA下调卵巢癌H08910细胞NAC-1基因表达并抑制生长
近研究发现,卵巢癌中存在卵巢癌于细胞(cancer stem cells,CSCs)[1],且与卵巢癌发生发展及其多药耐药密切相关[2].这些研究结果提示,卵巢癌干细胞足卵巢癌防治过程中重要靶细胞.NAC-1(nucleus aceumbens-1)蛋白属于BTB/POZ转录因子家族成员,通过BTB/POZ结构域形成二聚体,与一些核蛋白相互作用,调节细胞生物学活性,参与胚胎干细胞的自我更新和多能性分化.
