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胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定
目的 探讨胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定的方法,为胎儿和早产儿骨骼肌发育程序化的研究提供实验基础. 方法 Sprague-Dawley大鼠孕18 d时剖宫取出胎鼠,手术显微镜下取胎鼠四肢骨骼肌肌肉,采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离胎鼠骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法进行纯化.原代培养的生长培养基为(DMEM/F12+ 20％ FBS+ 10％ HS+5 ng/ml bFGF).分化培养基为(DMEM/F12+ 2％ HS).CCK-8法绘制胎鼠骨骼肌卫星细胞生长曲线图,细胞免疫组化染色鉴定纯化后细胞的肌源性标志蛋白Desmin,观察分化培养基条件下骨骼肌卫星细胞的成肌分化特性. 结果 胎鼠原代骨骼肌卫星细胞在培养的第3天进入对数生长期,5～6d达增殖平台期;纯化后的细胞90％以上表达结蛋白(Desmin).在分化培养基的诱导下细胞之间相互融合形成具有自发节律性收缩特性的多核肌管. 结论 采用消化法和差速贴壁法分离纯化胎鼠骨骼肌卫星细胞,能够获得高活性和高纯度的具有成肌分化能力的骨骼肌卫星细胞.
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人脂肪组织源性间充质干细胞分离与体外培养
各种疾病所导致的器官衰竭严重地危害着人类的健康,降低了患者的生活质量.干细胞所具有的自我复制和多向分化能力使它成为挽救器官衰竭、进行组织修复的理想种子细胞.在特定的条件下它可以分化为中胚层起源的多种组织细胞,如成骨细胞、软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、血管内皮细胞、肌细胞及神经星状细胞等.目前干细胞主要来源于骨骼肌卫星细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞等,近几年国外有研究显示脂肪组织中也含有大量具有多向分化潜能的干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs),而目前国内应用脂肪组织分离及培养干细胞的报道极少.本研究拟将对ADMSCs进行分离和体外培养,并对其生长方式进行观察.
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2.8大鼠成体干细胞食管下段移植的实验研究--一种可能治疗胃食管反流病的新方法
目的GERD是一种常见的消化道疾病.目前治疗GERD的主要方法是:①改变生活方式;②药物治疗;③外科手术治疗;④内镜治疗.虽然上述方法都有一定的治疗效果,但也都存在一定不足,因此迫切需要探索一种彻底有效的治疗方法.研究成体干细胞(骨骼肌卫星细胞和骨髓间充质干细胞)注射到食管下段的可行性,探索利用成体干细胞移植治疗GERD的新方法.
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CD34在体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞发育的免疫组织化学研究
目的观察CD34在发育中的体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞中的分布,探讨CD34在发育中的大鼠骨骼肌卫星细胞中的作用.方法原代培养骨骼肌卫星细胞,第1次传代后,取贴壁2、4、8、16、24、48和72 h的细胞行CD34多克隆抗体的免疫组织化学染色.结果CD34免疫阳性反应存在于发育中的骨骼肌卫星细胞中,但在形成肌管后,细胞核免疫反应转为阴性,同时成纤维细胞呈弱阳性反应.结论CD34在发育中的骨骼肌卫星细胞中有一定量的分布,它可能在骨骼肌的生理发育中起某种调节作用.
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干细胞因子在体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞表达和发育的免疫组织化学研究
目的观察干细胞因子(SCF)在发育中的体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞中的分布,探讨SCF在大鼠骨骼肌卫星细胞中的作用. 方法原代培养骨骼肌卫星细胞,经两次传代后,取培养2、4、8、16、24、48、72h的细胞行SCF单克隆抗体的免疫组织化学染色. 结果 SCF免疫阳性反应物存在于发育中的骨骼肌卫星细胞中,形成肌管后,细胞核呈强阳性反应. 结论 SCF在发育的骨骼肌卫星细胞中有表达,它可能在骨骼肌的生理发育中起某种调节作用.
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骨骼肌卫星细胞的培养及其在骨骼肌组织工程研究中的应用
近年来,随着组织工程技术的不断发展,生命科学、材料科学及制造科学的相互渗透,使得体外构建人体组织和器官的功能性替代物成为可能.骨骼肌卫星细胞作为组织工程的种子细胞在体外扩增至一定数量后与生物可降解三维支架材料结合,植入患者体内来修复缺损及恢复生理功能.目前对肌卫星细胞的体外培养已进行了较多研究,而对于肌卫星细胞的体外生长、增殖、鉴定,以及与组织工程三维支架的相互作用和生物功能的研究尚处于发展阶段,文中将对这些方面的研究进展作一综述.
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rhBMP-2对骨骼肌卫星细胞增殖与粘附的影响
目的:探讨人重组骨形态发生蛋白(rhBMP)-2对骨骼肌卫星细胞增殖与粘附的影响.方法:体外分离与培养骨骼肌卫星细胞,分别用0、50、100、500、1000 ng/ml的rhBMP-2诱导培养基培养48h.利用MTT法测定细胞增殖能力的变化,通过荧光法测定接种后1h的粘附细胞率.结果:rhBMP-2可促进骨骼肌卫星细胞的增殖,这种作用从BMP浓度为500ng/ml即可表现出来,并随着浓度的增加而越发明显.在rhBMP-2作用下骨骼肌卫星细胞的粘附率增高,在500ng/ml的浓度时达高,但当BMP浓度进一步增加时,细胞粘附率却不再增加.结论:rhBMP-2可促进骨骼肌卫星细胞的增殖,增强其粘附特性.
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脂肪酸对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响
目的：近年来,脂肪酸对细胞分化的影响作用一直受到广泛关注。研究发现,脂肪酸可以通过调节过氧化物酶体增殖激活受体( PPAR)或其他转录因子而调控组织分化。单不饱和脂肪酸亚油酸( LA)和油酸( OA)在促进骨胳肌细胞的增殖和分化过程中具有重要作用。多不饱和脂肪酸如花生四烯酸( AA)和二十二碳六烯酸( DHA)还可以通过改变细胞膜的脂质分布,从而促进大鼠成肌细胞的分化。然而,脂肪酸是否能够影响牛骨骼肌细胞的发育,以及脂肪酸的摄取与骨骼肌卫星细胞分化的关系,仍不清楚。方法：本研究通过向牛骨骼肌卫星细胞( muscle-derived satellite cells,MDSCs)培养体系中添加三种不同的脂肪酸(棕榈酸PA、油酸OA和二十二碳六烯酸DHA ),以探讨不同脂肪酸对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响。结果：PA、OA和DHA作用浓度均为50 umol/L,以2%马血清为对照,诱导分化牛骨骼肌卫星细胞。分化96h后分别收集细胞,采用免疫荧光染色,实时定量PCR和Western blot技术检测细胞分化过程中相关的标志性基因MyoG( Myogenin)和MyHC( Myosin Heavy Chian)的表达变化进而探讨脂肪酸对体外培养的牛骨骼肌卫星细胞分化程度的影响；此外,通过荧光定量RT-PCR法检测脂肪酸代谢途径中关键基因CPT2( Carnitine palmi-toyltransferase 2,肉碱棕榈酰转移酶Ⅱ)、DGAT2( Diacylglycerol acyltransferase 2,二酰甘油酰基转移酶Ⅱ)和ELOVL3(Fatty acid elongase 3,脂肪酸链延长酶III)的表达变化,进而探讨脂肪酸摄取对骨骼肌卫星细胞脂肪酸代谢的影响。实验结果显示,PA、OA和DHA处理的牛骨胳肌卫星细胞能够促进肌卫星细胞的分化。3种脂肪酸处理的细胞中脂肪酸代谢中的关键基因CPT2、DGAT2和ELOVL3的表达量显著增加。结论：脂肪酸( PA、OA、DHA)能够促进牛骨骼肌卫星细胞的分化,从而为探明肌肉发育和分化的分子机制提供帮助。
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Podocan在牛骨骼肌卫星细胞中的作用及调控
目的：：细胞外基质( ECM)在细胞发育,组织修复,调控细胞增殖、分化、粘附和迁移方面具有十分重要的作用。小的富含亮氨酸的重复蛋白( SLRP )家族属于细胞外基质中的一类重要的非胶原蛋白。Podocan,是一个大约由600个氨基酸组成的分泌蛋白,属于SLRP家族中的第五亚类蛋白。 Podocan在肾脏、心脏、肝脏、胰腺和血管的平滑肌细胞中均有表达,其对平滑肌细胞的迁移和增殖具有负调控作用,可以调节内膜的增生。本实验室在前期研究工作中通过对牛骨胳肌卫星细胞增殖分化过程的高通量测序结果表明, Podocan在牛骨胳肌卫星细胞中具有一定的表达,随着卫星细胞的分化,其表达量呈显著增加,推测其能够参与牛骨胳肌卫星细胞的分化,与牛肌肉的发育和成熟具有密切关系。方法：本研究以体外培养的牛骨胳肌卫星细胞为实验材料,以2%马血清分别诱导细胞分化2 d、3 d、4 d和5 d。收集细胞,采用荧光定量RT-PCR和Western Blot的方法分别检测不同分化程度的牛骨胳肌卫星细胞中Podocan mRNA和蛋白的表达水平。通过免疫荧光染色的方法检测Podocan在细胞中的表达定位。此外,本研究构建Podocan的过表达载体以及shRNA干扰和CRISPR干扰载体,以脂质体2000的方法转染骨骼肌卫星细胞,分别实现Podocan的过表达和抑制,以荧光定量RT-PCR和Western Blot的方法检测Podocan的过表达和抑制效果,同时检测骨骼肌卫星细胞分化的标志基因MyoG ( Myogenin )和MyHC ( Myosin Heavy Chian )的mRNA和蛋白表达水平变化。结果：随着牛骨骼肌卫星细胞分化的进行,Podocan的mRNA和蛋白表达量显著增加,免疫荧光定位结果显示其主要分布在成熟的在肌管的细胞中,而未分化的细胞其表达量较低。 Podocan的过表达和抑制载体能够显著增加或抑制其在牛骨骼肌卫星细胞中的表达量,且MyoG和MyHC mRNA和蛋白表达水平的检测结果显示,Podocan的表达增加和抑制能够促进或减少骨骼肌卫星细胞分化的程度。结论：Podocan在牛骨骼肌卫星细胞的分化过程中具有重要的调控作用,其促进肌肉分化的分子机制深入探索能够为肌肉生长发育机理的研究及提高肌肉产量的肉牛生产提供帮助。
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小鼠成体骨骼肌卫星细胞提取及纯化方法的改进
目的 建立一种快速高效的小鼠成体骨骼肌卫星细胞的提取、纯化的实验方法.方法 通过布比卡因预处理激活肌卫星细胞,48小时后,以混合酶一步消化法及改良纯化法从成年骨骼肌中分离高纯度卫星细胞,并与普通差速贴壁法、反复差速贴壁法及Percoll非连续密度梯度离心法等纯化方法相比较.结果 通过改良提取、纯化法所得到的骨骼肌卫星细胞纯度可达到(82.53±3.16)%,明显高于普通差速贴壁法、反复差速贴壁法及Percoll非连续密度梯度离心法(P<0.05),并具有很好的增殖及分化能力.结论 通过采用改良成体骨骼肌卫星细胞提取及纯化法,能快速高效地获取高纯度肌卫星细胞.
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CM-DiI标记在小鼠骨骼肌卫星细胞移植治疗心肌梗死中的示踪研究
目的 探讨CM-Dil标记小鼠骨骼肌卫星细胞后移植治疗心肌梗死的体外体内示踪作用.方法 CM-Dil标记纯后小鼠骨骼肌卫星细胞,检测标记率及荧光情况,观察CM-Dil对细胞增殖分化的影响.小鼠心梗模型心肌内注射标记后的卫星细胞,于移植后1、3、7、14,21、28天取出心脏行冰冻切片,观察移植细胞在体存活分化情况.结果 CM-Dil标记骨骼肌卫星细胞效率达(93.3±0.95)％,3代后仍保持红色荧光,对细胞增殖及分化无明显影响.标记细胞移植1无后即可见细胞团聚,3天后细胞排列整齐,4周后仍可见移植细胞.结论 CM-Dil细胞标记液标记骨骼肌卫星细胞,安全简单,并可示踪移植后细胞的存活分化情况.
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不同类型的细胞移植治疗心力衰竭的简评
心肌细胞是终末分化细胞.心肌损伤后,细胞凋亡、瘢痕替代、心肌重构,终发展成心力衰竭,使传统内科治疗陷入被动无奈的境地.1990年以来探索着不同类型的细胞作心肌移植,以求改善心功能,其中包括了胚胎心肌细胞、骨骼肌卫星细胞、胚胎干细胞及骨髓干细胞等作心肌的细胞移植,有如在黑暗摸索中看到一缕曙光,掀起一股研究的热潮,甚至被勇敢的应用于临床.但就现状来说,急于推向临床还存在不少问题,在实际应用中还应理智地客观对待.为此本文对几种不同来源的细胞在心肌细胞移植中存在的问题略作评述.
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骨骼肌卫星细胞移植对心肌梗死区残存心肌细胞体积的影响
目的研究自体骨骼肌卫星细胞移植对梗死心肌残存心肌细胞体积的影响.方法自犬臀部取骨骼肌,体外提取、培养、扩增骨骼肌卫星细胞,4',6-diamidino-2-phenylindone(DAPI)荧光标记,经结扎的左冠状动脉前降支远端灌注移植入自体急性心肌梗死区域.2、4、8周后处死动物,取心肌标本行组织形态学及心肌细胞体积检测.结果梗死区部位观察到带荧光的卫星细胞及肌纤维,部分已分化成横纹肌并以闰盘相连.正常心肌细胞随梗死时间增长,可见细胞切面积及体积增加,呈现肥大趋势.骨骼肌卫星细胞移植治疗组梗死区残存心肌细胞肥大明显,细胞切面积、面积、体积与对照组比较差异有显著意义.细胞肥大以细胞宽度及厚度为主,细胞长度未见明显变化.结论骨骼肌卫星细胞移植入梗死心肌,可促使梗死区残存心肌细胞肥大,从而利于心肌收缩力的恢复.
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耐力运动促进骨骼肌卫星细胞线粒体能量代谢及其对成肌分化的影响
目的:观察耐力运动训练对骨骼肌卫星细胞线粒体能量代谢的影响,并探讨其对成肌分化的调控机制.方法:C57BL/6小鼠随机分为安静对照组(N组)和运动训练组(T组).12周训练后,两步酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,免疫化学染色鉴定卫星细胞纯度.原代培养并体外诱导成肌分化,倒置显微镜观察卫星细胞成肌分化程度.分别在分化0h和24h测定线粒体呼吸功能、ATP合成活力、膜电位和MyHC、COXⅣ、AMPK、p-AMPK、p21蛋白表达量.结果:免疫化学染色显示desmin阳性细胞＞90％,表明获取的卫星细胞纯度高.HE染色结果显示T组腓肠肌肌纤维横截面积显著高于N组(P＜0.05).分化Oh时,T组态3呼吸速率(ST3)、呼吸控制比(RCR)、线粒体ATP合成活力、p21表达较N组显著升高(P＜0.05),p-AMPK表达显著降低(P＜0.05).分化24h时,T组肌管形成数量及MyHC表达较N组显著升高(P＜0.05),ST3、RCR、ATP合成活力、膜电位、p21及COXⅣ表达显著增加(P＜0.05),p-AMPK表达显著降低(P＜0.05).结论:耐力运动训练可提高未分化卫星细胞线粒体能量代谢水平,继而抑制AMPK活化而增加p21表达,从而促进成肌分化的启动和进程.
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机械生长因子促骨骼肌卫星细胞增殖作用途径的初步研究
目的:研究机械生长因子促进骨骼肌卫星细胞增殖的量效关系及可能的作用途径.方法:选用4周龄雄性SD大鼠1只,无菌条件下取后肢肌肉,采用改进的两步酶消化法结合差速贴壁技术,分离及纯化骨骼肌卫星细胞.免疫细胞化学法鉴定骨骼肌卫星细胞.取第3代骨骼肌卫星细胞,随机分为对照组、DMEM对照组、MGF组(M组)、LY+ MGF组(LM组)、PD+ MGF组(PM组)和LY+PD+ MGF组(LPM组),同步化后,相应组细胞换用含有PI3K特异性抑制剂LY294002(30μM)及MEK特异性抑制剂PD98059(50 μM)的生长培养基预阻断12 h后,再用含有MGF(25 ng/ml)的生长培养基继续培养24 h后,用CCK-8比色法、BCA比色法观察不同抑制剂干预下SC的增殖及总蛋白含量.结果:1、PM组和LPM组OD值均显著低于M组(P＜0.01),而LM组OD值与M组无显著差异.2、LM组、PM组、LPM组SC总蛋白含量均显著低于M组.结论:MEK/Erk途径在MGF对卫星细胞促增殖方面有较重要作用.
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外源性机械生长因子对大鼠骨骼肌卫星细胞生物学特性的影响
目的:研究机械生长因子(MGF)促离体培养的骨骼肌卫星细胞增殖的佳浓度,并观察该浓度对细胞生长曲线、总蛋白及凋亡情况的影响.方法:选用雄性SD大鼠1只,无菌条件下取后肢肌肉,采用改进的两步酶消化法结合差速贴壁技术,分离及纯化骨骼肌卫星细胞.取第3代骨骼肌卫星细胞,分别采用终浓度为15、25、50、100、200 ng/ml的MGF进行干预,作为实验组;另以单纯加入100 μl生长培养基作为对照组,以加入100μl DMEM作为阴性对照组.同步化后,于培养24 h后加入CCK-8溶液.采用CCK-8比色法检测不同浓度MGF下细胞的增殖情况并筛选出佳浓度后,绘制生长曲线,同时运用BCA法及Hoechst 33342、PI双染法测定佳增殖浓度的MGF对卫星细胞蛋白合成及细胞凋亡的影响.免疫细胞化学法鉴定骨骼肌卫星细胞.结果:①终浓度为15、25、50、100 ng/ml的MGF均有促进骨骼肌卫星细胞增殖的作用(P＜0.01),其中25 ng/ml MGF促增殖作用佳.②与对照组相比,MGF组细胞生长曲线左移,倍增时间、平台期均缩短.③与对照组相比,25 ng/ml MGF作用48 h即对骨骼肌卫星细胞有明显的增殖效果(P＜0.05);与对照组相比,25 ng/ml MGF作用骨骼肌卫星细胞48 h和72 h时,其总蛋白含量显著增加(P＜0.05);与对照组相比,25 ng/ml MGF作用72h、96h,骨骼肌卫星细胞的平均凋亡指数显著减小(P＜0.05).结论:①机械生长因子可促进体外培养的大鼠骨骼肌卫星细胞增殖,佳浓度为25 ng/ml;②25 ng/ml MGF可以使骨骼肌卫星细胞提前进入平台期,缩短生长周期;③25ng/ml MGF可以抑制骨骼肌卫星细胞的凋亡.
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骨骼肌特异性microRNA-206在骨骼肌卫星细胞再生过程中的表达
尽管运动性骨骼肌损伤(Exercise-induced Skeletal Muscle Injury)和修复一直是运动医学界研究的热点问题之一,但是骨骼肌损伤后再生修复过程中的许多机制性问题并未解决.卫星细胞的发现推动了骨骼肌再生研究的飞速发展.现已证实,所有哺乳动物的骨骼肌都具有再生能力,卫星细胞是肌肉损伤后功能修复的唯一来源.卫星细胞位于肌细胞膜与基膜之间,正常生理状态下处于静息状态,肌肉损伤时被激活进入分裂期,不断增殖、融合为肌管,随后收缩蛋白和调节蛋白开始表达,胞质中出现肌原纤维,核移位于细胞边缘,分化成为成熟的肌纤维.近年来的研究表明,microRNA可能在卫星细胞的增殖分化过程中起到重要作用.
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机械牵拉诱导骨骼肌卫星细胞激活的分子机制研究进展
了解卫星细胞激活过程中的控制因素,有利于设计出更好的促进骨骼肌发育和修复方案,以应用到运动科学(提高运动员机能表现)和健康科学(特别是肌肉萎缩和Sarcopenia的治疗方法)领域.1骨骼肌卫星细胞的激活卫星细胞的激活是提供新的肌细胞核(融合成新的肌纤维或当前肌纤维肥大)的第一步,骨骼肌发育、损伤修复的过程中同样需要卫星细胞的激活.在成体骨骼肌中,处于静息状态的卫星细胞只在适当的条件(损伤、运动刺激、牵拉或去神经)下被激活(进入细胞周期)[1].激活的卫星细胞移位到损伤位点,进行DNA复制,增殖、分化融合到肌纤维上或形成新的肌纤维,通过这种途径,肌细胞核增加,也为骨骼肌肥大奠定基础.
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多种生长因子联合使用对体外培养人骨骼肌卫星细胞免疫组化表达及分裂指数的影响
1 材料和方法1.1 材料收集武汉大学人民医院病理科2000～2006 年临床手术切取的骨瘤周围正常骨骼肌标本25例,年龄小8岁、大18岁、平均13岁,其中男性18例、女性7例.
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细胞移植治疗心肌梗死的研究与展望
细胞移植是治疗心肌梗死的一种新策略,本文对目前应用于临床研究的骨骼肌卫星细胞移植及骨髓干细胞移植治疗心肌梗死的进展进行综述.上述两种细胞移植均具有来源丰富、无排斥反应的特点,而且通过研究观察表明,上述两种细胞移植后,心脏功能均能得到改善,故具有美好发展前景.但二者亦均具有不足之处和需要解决的问题,还需进一步研究与探索.
