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伪狂犬病毒脑炎临床观察与脑脊液二代测序鉴定
目的 通过对病因未明的脑炎患者的临床评估与脑脊液二代测序(NGS)病原体筛查,诊断伪狂犬病毒(PRV)脑炎,描述其临床特征.方法 选择2016年12月至2017年12月基于北京协和医院神经科牵头的脑炎多中心临床登记研究,并根据北京脑炎协助组脑炎诊断标准入组病因未明的脑炎病例,进一步进行病因筛查,对疑似感染性脑炎而病因未明者行脑脊液二代测序.结果 共收集到4例疑似PRV脑炎病例,均为从事生猪与生猪肉产销的人员.急性起病,表现为迅速进展的重症脑炎,癫痫大发作、意识障碍、呼吸障碍,需要ICU救治,3例呼吸机支持.2例合并双侧视网膜炎,神经影像学提示灰质受累为主的坏死性脑炎,受累部位包括边缘系统、基底节区与中脑,无明显出血改变.脑脊液压力升高,脑脊液白细胞升高(6 ～64)×106/L,脑脊液细胞学为淋巴细胞性炎症.对2例患者进行脑脊液NGS,检测到伪狂犬病毒,未检测到其他病原体,其他临床病原学检测结果阴性.阿昔洛韦、静脉免疫球蛋白与激素治疗部分有效,末次随访4例患者的改良Rankin评分分别为3、5、5和6分.结论 伪狂犬病毒可感染人而导致脑炎、视网膜炎.对于病因不明的脑炎病例,如果流行病学、临床表现、脑脊液与影像学符合该病,应尽快进行脑脊液PRV核酸检测,及时诊断和治疗.
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杜氏/贝氏肌营养不良症433个家系的基因突变分析
目的 对无亲缘关系的杜氏/贝氏肌营养不良症(DMD/BMD)家系进行DMD基因突变分析,探讨DMD基因突变特点,并主要阐明DMD基因点突变在中国汉族人群中的分布模式.方法 在2010年3月至2014年12月郑州大学第一附属医院收集的433个无亲缘关系的中国汉族DMD/BMD家系中,首先应用多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术对DMD/BMD家系进行DMD基因79个外显子进行缺失或重复的分析;应用PCR扩增技术针对MLPA单个外显子缺失的样本排除MLPA假阳性;对应用MLPA技术已排除DMD基因大片段缺失和重复的117个家系中的先证者,应用二代测序(NGS)技术对DMD基因79个外显子进行点突变分析,应用Sanger测序对点突变进一步验证.结果 在433个无亲缘关系的中国汉族DMD/BMD家系中,应用MLPA技术在316个家系中检测到DMD基因存在外显子大片段缺失和重复突变;其中MLPA检测的57单个外显子缺失样本,应用PCR扩增技术和Sanger测序发现3个新的点突变包括:2个无义突变c.1729G ＞T[p.Glu577X]、c.3346A＞T[p.Lys1 116X]和1个移码突变c.8605_8606delGT[p.Val2869ThrfsX25].应用NGS(Ion PGM高通量平台)和Sanger测序在117个MLPA阴性结果家系对DMD基因进行直接测序,在96个家系中检测到DMD基因92个不同点突变,包括46个新突变、42个已知致病突变和4个可疑多态位点(rs189143447、rs202008454、rs200213555、rs187617705).46个新突变包括16个无义突变(c.100A＞T[p.Lys34X]、c.1201C＞T[p.Gln401X]、c.1707C＞A[p.Cys569X]、c.1831G＞ T[p.Glu611X]、c.1912C＞ T[p.Gln638X]、c.2213C＞G[p.Ser738X]、c.3673_3673delA[p.Ile1225X]、c.3774C＞A[p.Cys1258X]、c.4858G ＞T[p.Glu1620X]、c.5764A ＞T [p.Lys1922X]、c.6035T＞G[p.Leu2012X]、c.6408G＞A[p.Trp2136X]、c.7717C ＞T [p.Gln2573X]、c.7864G ＞T[p.Glu2622X]、c.8184_8185insT[p.Lys2729X]、c.8215C＞T[p.Gln2739X]),5个错义突变(c.139G＞A[p.Gly47Arg]、c.238G＞C[p.Ala80Pro]、c.335G ＞T[p.Trp112Leu]、c.804A ＞C [p.Leu268Phe]、c.1149G ＞T [p.Glu383Asp]),6个剪切位点突变(c.2293-3C＞A、c.2380+ 1G＞T、c.3277-1G＞C、c.4519-7A＞G、c.5740-15G＞T、c.7661-1G＞C),16个缺失突变(c.688_688delA[p.Met230CysfsX14]、c.1760_1791del32[p.Thr587IlefsX37] 、c.2271_2271delA [p.Asp774ThrfsX22] 、c.2281_2285delGAAAA[p.Glu761SerfsX10]、c.2527_2527delG[p.Glu843SerfsX3]、c.3405_3405delC[p.Asn1135LysfsX18]、c.4450_4450delC[p.His1484ThrfsX14]、c.4770_4770delA[p.Thr1590ThrfsX5]、c.4937 _4937delA[p.Glu1646GlyfsX11] 、c.5253_5256delATTA [p.Lys1751LysfsX2] 、c.5654_5654delA [p.Gln1885ArgfsX6]、c.7441_7441delG[p.Glu2481AsnfsX13]、c.7860_7860delC[p.Ile2620IlefsX18]、c.8668-8668delG/c.8668+ 1-8668+1delG、c.9009_9009delC[p.Thr3003ThrfsX18]、c.9021_9021delT [p.Ile3007IlefsX14])和3个插入突变(c.305_306insG[p.Gly102GlyfsX4]、c.3116_3117insA [p.His1039GlufsX11]、c.9197_9198insATCTC[p.Ser3066SerfsX25]).87.4％ (83/95)点突变破坏了阅读框(46个无义突变、24个移码突变、13个剪切突变).结论 结合应用MLPA技术、NGS技术、Sanger测序可为患者提供经济高效的基因诊断服务.研究发现的点突变多数是可预测的提前终止密码子或导致剪接缺陷,导致肌营养不良蛋白功能缺陷.
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37例遗传性球形细胞增多症基因突变特征分析
目的 揭示遗传性球形细胞增多症(HS)红细胞膜蛋白基因突变特征.方法 应用二代测序技术检测2015年4月至2018年1月临床明确诊断的51例HS患者红细胞膜蛋白基因突变情况,将检出并预测为红细胞膜蛋白基因有害突变的37例患者纳入研究,分析基因突变构成、突变类型及与临床表现型的关系.结果 37例HS患者中,ANK1突变17例(45.9％)、SPTB突变14例(37.8％)、SLC4A1突变5例(13.5％)、ANK1突变复合SPTB突变1例(2.7％),未发现SPTA1及EPB42突变.红细胞膜蛋白基因突变类型中无义突变(36.8％)和错义突变(31.6％)常见.在检出的38个突变位点中,34个为新发突变(89.5％).16例HS患者进行父母基因验证,6例(37.5％)为遗传获得突变,10例(62.5％)为自发突变.HS患者外周血细胞参数与红细胞膜蛋白突变基因类型无关;轻型+中间型患者SPTB突变构成比更高,重型患者ANK1突变构成比更高,但差异无统计学意义(P=0.664).结论 中国HS以ANK1和SPTB基因突变常见,突变类型主要为错义突变和无义突变;不同HS相关基因突变与HS严重程度间无明显相关.
关键词： 遗传性球形细胞增多症 二代测序 红细胞膜蛋白 突变 -
二代测序在家族遗传性高危胃肠肿瘤筛查中的应用
目的:探索二代测序技术对家族遗传性高危胃肠肿瘤患者进行遗传筛查的意义及高危因素在筛选患者中的价值.方法:选取2016年3月至2016年4月收治于北京大学肿瘤医院的322例结直肠癌及胃癌患者,筛选出25例遗传性胃肠肿瘤高危患者,运用二代测序技术对患者的外周血白细胞DNA进行42个遗传性肿瘤综合征相关基因的胚系检测.结果:24%(6/25)患者检测出遗传性肿瘤相关基因的病理性胚系突变,其中50%(3/6)患者肿瘤组织的免疫组织化学检测表现为错配修复蛋白表达缺失,83% (5/6)患者发病年龄≤50岁且具有恶性肿瘤家族史.发生胚系突变的6例遗传性肿瘤相关基因分别为MYH基因错义突变1例, APC基因缺失突变1例和遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)相关基因的突变4例(包括MLH1、MLH3、TGFBR2的错义突变和MSH6的无义突变各1例),且提供了MLH3的胚系致病突变的家系验证.结论:通过二代测序技术对本研究入组的25例患者进行家族遗传性肿瘤综合征的筛查,检测出遗传性肿瘤相关基因的胚系致病突变6例,提示运用二代测序技术对家族遗传性高危消化道肿瘤患者进行遗传筛查具有提高检测阳性率的临床应用价值.
关键词： 家族遗传性消化道肿瘤 二代测序 胚系突变 -
基于NGS的弥漫大B细胞淋巴瘤预后相关基因突变研究进展
弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是一种高度侵袭性的恶性淋巴瘤,发病的分子机制尚未完全明确.二代测序(next generation sequencing,NGS)是一项日趋成熟的基因检测技术,近年来已广泛应用于DLBCL的基因研究.基于上述研究的靶向治疗也取得了一系列进展,使得基因突变在DLBCL中成为新的研究热点.本文就DLBCL预后相关基因突变研究进展进行综述.
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乳腺癌基因组学研究进展
乳腺癌的发生是由体细胞突变引起。研究乳腺癌的体细胞突变谱有助于明确乳腺癌发生发展的生物学过程。应用二代测序技术对乳腺癌基因组学的研究有了一系列新的认识。二代测序技术检测到新的乳腺癌相关基因，这些基因的突变频率较低，不同患者的突变基因却涉及某些通路的失调。某些乳腺癌基因组中可识别特异性突变签名，但一般不反映环境暴露。尽管所有肿瘤中瘤内异质性均存在亚克隆突变，均有一个优势克隆占全部乳腺癌细胞的50%以上。乳腺癌基因组学旨在促进向个体化医学转化，基于基因组信息的乳腺癌分子分型和个体化治疗将在不远的将来成为现实。
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微小残留病检测在多发性骨髓瘤移植后患者中的应用现状与思考
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者的治疗疗效在近十年来不断提高,特别是在新药联合移植治疗后,其无进展生存期(progression free survival,PFS)和总生存期(overall survival,OS)均大幅延长.对于患者的疗效而言,传统意义的评效标准完全缓解(complete response,CR)已经不能满足其对预后的指导,微小残留病(minimal residual disease,MRD)的评估应运而生,其检测方法发展较快.血清游离轻链(serum free light chain,sFLC)、流式细胞术、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、二代测序(next-generation sequencing,NGS)和PET-CT等各项技术层出不穷.本文就上述各检测手段在MM移植后患者中的应用现状予以综述.
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基因突变检测在骨髓增生异常综合征诊疗中的应用
骨髓增生异常综合征(MDS)是一种由遗传学异常驱动的克隆性造血干细胞或祖细胞性疾病,通常表现为全血细胞减少、病态造血及向白血病转化的高风险.细胞形态学和细胞遗传学异常是目前确立MDS诊断的主要参数.近年来,随着基因测序技术,尤其是二代测序技术的快速发展和广泛应用,大多数MDS患者可检出基因突变.本文就基因突变在MDS诊断、分型、危险度分层和治疗中的应用作一评述.
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胃癌HER-2的异质性表达和耐药的研究进展
胃癌是一种高发的恶性肿瘤,对它的早期诊断和正确治疗十分必要.现发现,HER-2(表皮生长因子受体)的表达,与胃癌的发生发展有着密切的关系.但由于HER-2突变或异常扩增的异质性,在对晚期胃癌和胃食管连接部腺癌的患者进行诊断和治疗时,存在一定的困难和误区,故本文将从HER-2的异质性表达对胃癌诊治的影响作一综述.
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ND3基因突变导致的线粒体脑肌病重叠综合征二例
目的：孤立的线粒体电子传递链复合物Ⅰ缺陷是线粒体病常见的原因之一，可导致几种独特的临床综合征。方法本文报道2例 NADH 脱氢酶（ND）基因突变导致的线粒体脑肌病的临床资料，分析该2例线粒体脑肌病患者的临床表现，头颅影像学，血乳酸，血生化，血氨基酸，尿有机酸等，脑电图（EEG），肌电图（EMG）和神经传导速度，以及线粒体全基因二代测序和线粒体相关核基因的检查。结果例1患者部分症状符合线粒体脑肌病伴乳酸血症和卒中样发作（MELAS），部分症状符合伴破碎红纤维肌阵挛癫痫（MERRF）。该患者头颅 MRI 除 MELAS 常见的皮质病变外，还可见中脑和四叠体对称性异常信号，符合Leigh 综合征（LS）影像学表现。线粒体基因二代测序发现 MT ND3，10158T>C 突变。例2患者临床表现完全符合 MELAS 的临床特征，但头颅 MRI 可见中脑红核双侧对称性病变，又符合 LS 的影像学特征。线粒体全基因二代测序发现 ND3，10191T>C 突变。结论对于难以解释的神经系统症状和体征，尤其有多系统受累表现，即使临床表现不符合某种独特的线粒体病综合征，也要提高警惕，避免漏诊。
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应用二代测序技术招测罕见病的遗传学研究
罕见病目前国际上对其没有统一的标准,一般指临床发病率低,较少见的疾病.罕见病在欧洲定义是发病率＜ 1/2 000的,在美国指患病人数＜20万的疾病,而中华医学会遗传学分会2010年将那些患病率＜1/500000或新生儿＜1/10 000发病率的疾病定义为罕见病[1-3].二代测序技术能够平行对多个靶基因进行测序,目前开始逐渐应用在在符合孟德尔遗传罕见病的研究[4,5].本研究应用二代测序法对2例临床罕见病患者进行基因筛查,以期明确病因.
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采用二代测序技术对卵圆孔未闭家系进行基因突变筛查与分析
目的 对1例卵圆孔未闭(patent foramen ovale,PFO)家系所有成员进行致病基因筛查研究.方法 收集该家系所有成员资料包括临床表现、体格检查、心电图、超声心动图.抽取先证者及其家系成员外周血,提取基因组DNA,应用二代测序法(心血管病检测Panel)对先证者及家系内其余PFO患者进行候选基因突变检测.结果 该家系中有血缘关系的9人中共7人被证实罹患卵圆孔未闭.二代测序未发现可以解释PFO患者主要临床表型的致病/疑似致病性变异,也未发现与其他表现有PFO的综合征相关的基因存在异常.结论 该PFO家系家族聚集性提示可能存在遗传基因的异常,虽然采用二代测序进行基因筛查结果为阴性,但不能排除体细胞突变或其他遗传因素影响可能,进一步随访检测寻找致病基因对于该家系患者仍尤为重要.
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IRF6基因与新疆地区维吾尔人群非综合征性唇腭裂：基于二代测序技术的分析
背景：目前缺乏关于新疆维吾尔族非综合征性唇腭裂相关易感基因研究相关遗传资料。目的：探讨IRF6基因与新疆地区维吾尔人群非综合征性唇腭裂的相关性。
方法：选择久居新疆的维吾尔族非综合征性唇腭裂患者100例和同期上呼吸道感染儿童60例做对照组，用第二代测序技术对IRF6基因编码区、5’UTR区及第一外显子前500 bp进行测序。
结果与结论：将测序结果与基因组数据库进行比较，共发现11个高频SNPs位点：rs861019、rs7552506、rs2235377、rs2235371、rs2013162、rs7545538、rs7545542、rs12403006、rs846808、rs34743335、rs2235373。rs7545538(C>G，P=0.007)，rs7545542(C>T，P=0.044)和rs2235373(G>A，P=0.049)等位基因分布在病例组与对照组间差异有显著性意义(P<0.05)；rs7545538基因型分布在病例组与对照组间差异有显著性意义(P=0.037)；余位点等位基因与基因型分布在病例组与对照组间差异无显著性意义(P>0.05)。对以上11个高频SNPs进行单倍型分析，共构成2个单倍体域，第一个单倍体域常见的单倍型有4种：CCGGT>CCGAT>CACAT>TAGAC，其中有意义的单倍型为CCGAT(P=0.032)；第二个单倍体域常见的单倍型有3种：TAC>ATG>TAG，其中有意义的单倍型为TAC(P=0.009)，TAG(P=0.003)。分析结果发现，IRF6基因与非综合征性唇腭裂的发生可能存在相关性。 -
成人急性淋巴细胞白血病二代测序结果29例分析
急性淋巴细胞白血病(aALL)是一种异质性明显的血液系统恶性肿瘤,基因突变是其发病过程中的重要环节[1].二代外显子测序技术作为一种高通量的检查手段,能够较快检出患者的突变基因,对疾病的诊断和预后分析有重要意义[2].现对进行了二代测序的29例ALL患者的基因突变情况进行分析,探究基因突变与其他临床及实验室指标的关系,分析基因突变对诱导化疗疗效及生存期的影响.
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肥胖症遗传学研究
肥胖症日益严重威胁公众健康,其是环境和遗传因素相互作用的结果.早期的遗传学研究使用候选基因法和连锁分析寻找肥胖相关基因,收效甚微.然而,全基因组关联研究(GWAS)的出现极大地加快了发现肥胖相关基因的步伐.鉴于GWAS至今只能解释很少一部分肥胖症的遗传度(＜10％),故需要利用多种方法发现肥胖基因以促进对肥胖症的理解.
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应用二代测序技术助解胃癌术后睾丸转移性腺癌诊治研究
目的 探讨二代测序技术在肿瘤疑难病例诊治中的作用.方法 北京大学肿瘤医院于2014-11-18应用传统病理组织学检查手段及二代测序和分子进化遗传分析(MEGA)对1例胃癌术后7年发现睾丸转移性腺癌病人的病理组织及外周血进行检测及诊断.结果 病理学专家一致认为睾丸转移性腺癌来源于胃癌,而基因检测结果提示病人睾丸肿瘤可能并非7年前切除的胃癌转移.结论 新的基因检测技术对传统的病理组织学诊断提出了挑战,有必要在临床研究中积累更多数据以将其更好地应用于临床实践.
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应用基因组杂交、单核苷酸芯片及二代测序技术开展植入前染色体异常诊断
流产是导致妊娠失败的常见原因,其中因染色体异常导致的流产占早期自然流产的一半.胚胎染色体异常一部分是由于胚胎发育异常,一部分与遗传相关.我国普通人群中染色体异常的发生率为0.5％～1.0％,而在有不良孕产史的患者中发生率则高达2％～ 10％[1].随着辅助生殖技术的发展,体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的临床妊娠率有了显著提高,但胚胎着床率却维持在20％左右,其中染色体异常是造成人类胚胎低着床率和早期妊娠丢失的一个很重要原因[2].
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原因不明矮小症致病基因研究(附77例报告)
目的 应用靶向捕获二代测序技术检测原因不明矮小症致病基因,并分析其与临床表型的相关性.方法 收集2007年至2015年在上海交通大学医学院附属瑞金医院儿内科就诊的临床诊断为原因不明矮小症77例患儿的临床资料.制备包括与生长相关的187个基因编码区序列的基因panel,对77例患儿进行二代测序,根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)指南评判变异位点,筛选出致病基因,并通过Sanger测序验证,分析患儿基因型和临床表型相关性.结果 检测到5例存在致病性变异;1例存在可能致病性变异;1例变异意义不明确.这7种变异均为杂合.1例ACAN基因存在致病性变异p.D2407fs,表现为矮小及骨龄偏大;3例发现PTPN11基因存在已知致病性变异,分别为p.A72G、p.I282V和p.P491S,确诊为Noonan综合征;1例COL2A1基因存在已知致病性变异p.R904C,确诊为Stickler综合征;l例COMP基因存在可能致病性变异p.D401N,可造成多发性骨骺发育不良;1例为家族性矮小患儿,发现GHSR基因新发杂合变异p.S289Y,其骨龄发育落后,基因型与临床表型一致,目前评判意义不明确.结论 发现ACAN基因杂合缺陷与骨龄发育超前的特发性矮小相关.COMP基因p.D401N变异,可能与多发性骨骺发育不良有关.GHSR基因新发杂合变异p.S289Y,可能导致矮小,须进一步功能实验验证.
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二代测序技术在结直肠癌基因组测序中应用的研究进展
二代测序技术在结直肠癌（CRC）领域中的应用已经越来越广泛。根据测序目的的不同，二代测序技术主要分为全基因组测序、全外显子测序、转录组测序和靶向深度测序等。本文简要概述了这几种二代测序技术在CRC基因组研究中的应用。
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二代测序法分析儿童肺炎支原体肺炎肺泡灌洗液中Th1/Th2的平衡
目的 应用二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)检测肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)患儿肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中,Th1细胞因子IFNγ、Th2细胞因子IL-4的表达水平及免疫应答的平衡变化趋势.方法 提取支气管异物、MPP轻症及重症患儿BALF样本,应用NGS技术中转录组测序技术进行深度测序,根据基因表达量检测IFNγ、IL-4表达水平,并计算IL-4/IFNγ比值;采用Real-timeqPCR法对样本的IFNγ、IL-4、IL-4/IFNγ相关趋势进行验证.结果 MPP轻症患儿BALF中IL-4、IFNγ表达水平及IL-4/IFNγ比值均较支气管异物对照组升高,MPP重症患儿BALF中IL-4、IFNγ水平较轻症组和支气管异物对照组升高,IL-4/IFNγ比值较支气管异物对照组升高,较轻症组有所下降.结论 在MPP患儿免疫反应中,MPP轻症及重症患儿BALF中两类细胞因子均有所升高,IL-4/IFNγ比值变化趋势表明Th1/Th2存在失衡现象,MPP轻症组、重症组与支气管异物对照组相比,平衡向Th2移动,因此,平衡以Th2反应占优势为主.
