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人类基因百科全书——ENCODE
DNA元件百科全书计划是美国人类基因组研究院在2003年9月启动的研究项目,旨在解析人类基因组中的所有功能性元件.该项目包含试点和技术推广运用两个阶段,试点阶段选取约1％的人类基因组进行研究,以此来比较所使用研究方法的准确性和可靠性,然后推广运用到全基因组研究.第二阶段从2007年9月开始迅速开展起来,在147种不同细胞类型中开展实验,产生了1640个数据集,这一阶段的研究成果于2012年9月以30篇学术论文的形式发表于国际主流SCI期刊杂志上.ENCODE项目是继人类基因组工程之后的又一重大项目;研究结果表明80.4％的人类基因组都具有生物学活性;其关注的不仅仅是功能性的基因,而是包含了人类基因组序列中的所有功能元件,包括基因、转录本和转录调控区,连同DNA甲基化模式、组蛋白修饰和染色质状态等.这项计划的主要目标是为科学界和医学界提供关于人类基因组重要功能元件的高质量和全方位的注解,从而全面理解人类基因组的功能.本文对ENCODE项目的相关信息进行综述,旨在使人们能认识和应用ENCODE项目的研究成果更好的为疾病预防和人类健康服务.
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医学遗传学课程中讲授二代测序的实践与思考
随着二代测序技术的逐渐成熟,新技术已广泛应用于临床,为遗传咨询和遗传相关疾病诊断带来革命性变化.为满足精准医疗时代对医学生能力提升和未来职业发展的要求,弥补传统教学在大数据分析和应用方面的不足,我们采用前沿进展的形式,把学习该新技术的重要性、原理和应用三部分教学内容,分别嵌入原有课程的不同章节.教学中,学生认为学习该部分知识很有必要亦有难度,客观考试中能够保持"新鲜记忆".在取得一定成效的同时,对该新技术的教学也暴露出内容散乱和学生不易区分研究、诊断和筛查的问题.下一步拟通过"化零为整"和强调新技术用途的区分加以改进,力争将二代测序的教学内容打磨为医学遗传学课程的新"亮点".
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二代测序应用于检测GT1-7细胞中KISS1和GnRH启动子的DNA甲基化状态的研究
目的:利用二代测序技术检测GT1-7细胞中KISS1和GnRH基因启动子范围内的甲基化状态,并用金标准的亚硫酸氢盐修饰后的克隆测序作为对照,比较二代测序与金标准克隆测序在研究DNA甲基化检测中的差别.方法:提取GT1-7细胞基因组DNA并进行亚硫酸氢盐处理.进行巢式PCR,将PCR产物进行二代测序.同时采用金标准的亚硫酸氢盐修饰后克隆测序的方法作为对照,对相同批次的PCR产物进行克隆测序.结果:PCR产物二代测序结果表明KISS1和GnRH两个基因的27个CpG甲基化位点信息完整,结果准确.挑取10个克隆进行一代测序结果表明序列无丢失,KISS1和GnRH两个基因的27个CpG甲基化位点信息完整.结论:利用高通量的二代测序技术能够有效的对DNA甲基化的PCR产物进行检测,二代测序和克隆测序都是研究DNA甲基化的有效方法,但前者与克隆测序相比每一个读取序列(reads)都相当于一个单克隆,且二代测序每个区段得到成百上千个reads,因此二代测序结果更加精确.
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基于高通量测序数据构建斑马鱼隐性遗传突变筛选系统
目的:针对斑马鱼高通量测序数据,通过一系列质量控制和突变过滤,构建一套有效隐性遗传突变筛选系统.方法:A)经过与斑马鱼参考基因组比对,利用GATK获得初始的VCF格式突变信息.B)使用perl语言编写本地脚本,对突变信息进行过滤,注释等.C)通过绘制纯合突变点分布图,找出突变富集区域.整合以上步骤,构建出一套针对斑马鱼高通量测序数据的遗传性突变筛选系统.结果:对获得的突变位点进行了一系列的质量控制,定位到具体染色体上的特定区域,并且对获得的突变进行了功能上的注释.结论:本过滤筛选系统能有效控制检测的假阳性率,对斑马鱼致病性的隐性突变位点筛查提供有力拳者.
关键词： 二代测序 Illumina测序平台 突变点富集 隐性遗传 -
一种新的线粒体基因组DNA捕获探针的制备及初步应用
目的:建立新的线粒体基因组DNA杂交捕获探针制备方法并用进行初步应用.方法:通过PCR技术扩增特异线粒体DNA片段,并与生物素偶联,后与标记磁珠的亲和素混合获得捕获探针.并自行制备的线粒体基因组DNA文库捕获探针与肝癌全基因组测序文库进行液相杂交.分离捕获产物后PCR扩增并进行测序分析.结果:成功建立了线粒体基因组杂交捕获探针制备方法并成功分离线粒体基因组DNA;对测序数据的分析显示:90％以上测序数据来自线粒体基因组DNA,且覆盖率达到100％,且均一性良好.检测到的同质性变异位点数量和异质性变异位点数量与全基因组测序数据产生的结果接近(P=0.9152,P=0.8409).结论:新方法制备的线粒体基因组DNA杂交捕获探针可以从全基因组文库中高效捕获线粒体基因组DNA测序文库.
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分子标志物在FNAC不确定的甲状腺结节中研究进展
甲状腺细针穿刺细胞学(Fine needle aspiration cytology,FNAC)用于评估甲状腺结节性质具有很好的灵敏度和特异度,被认为是诊断甲状腺结节的"金标准".然而,仍有10％～30％的FNAC诊断结果不确定.为避免这些不确定的甲状腺病变经历不必要的手术,近年来不少学者致力于分子标志物的研究,辅助细FNAC进行诊断,如miRNAs和外周循环的肿瘤细胞等.本文主要总结近几年FNAC对不确定的甲状腺病变诊断的分子标志物研究进展.
关键词： 甲状腺细针穿刺细胞学 不确定病变 miRNAs 基因 二代测序 -
二代测序法深度分析水痘疫苗Oka株病毒基因特征
采用二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术,对上海生物制品研究所有限责任公司(简称SIBP)2015—2017这3个年度生产的Oka株水痘疫苗进行深度测序,从分子水平分析疫苗质量的一致性,并与不同厂家疫苗/毒种进行比较,分析它们之间的遗传特征相关性.结果显示,3个年度生产的水痘疫苗中平均有77个位点的疫苗型位点检出频率(proportion of vaccine-type allele,Pv)≥10％,至少在两批疫苗中出现Pv≥10％ 的位点数共76个,两两之间Pv大差值<10％,与平均值的大差值为<5％.共有40个位点的Pv均值≥30％,其中19个位点导致氨基酸残基变异;15个位于ORF62区域.筛选出35个位点,比较5个公司水痘疫苗/毒种的Oka株病毒基因序列,结果显示它们之间存在相关性,同时存在一定的差异.研究表明,SIBP不同年度生产的水痘疫苗Oka株病毒具有良好的分子水平上的一致性,为疫苗质量管理与市场监督提供了方法和基础数据.
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肠道细菌与癌症关系的研究进展
人类与大量细菌、真菌和病毒共同生存、进化了数百万年,已初步从分子水平了解了极少数特定细菌与癌症之间的病原学关系.二代测序技术的逐步成熟,将进一步推动对微生物尤其是肠道细菌的深入研究,从而解析细菌与癌症之间的分类学和代谢组学关系.本文主要综述了肿瘤组织及其周边微环境中的细菌以直接和(或)免疫调节方式介导肿瘤发生发展的机制.
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二代测序在脓毒血症患者病原学诊断中的应用
脓毒血症是一种严重威胁生命的感染,精准、快速的病原学诊断可帮助临床医师优化抗菌药物的使用.目前,基于病原菌培养的方法仍是脓毒血症病原学诊断的主要手段,但具有耗时长、灵敏度低等不可忽视的缺点.近年来出现了一些不依赖培养的病原学诊断方法,其中基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法已发展较为成熟.但PCR只能检测已知的特定病原体,临床定量PCR仅用于检测病毒及少数细菌,脓毒血症中的病原体PCR多仅为定性检测.目前,二代测序技术不断成熟并用于临床,成为病原学诊断的有力手段.与血培养等传统病原学检测方法相比,其具有快速、非选择性、可定量或半定量分析的优点.现阶段二代测序仍存在公认判读标准缺乏、测序结果与治疗关系不明确、耐药基因检测困难等不足,亦缺乏较大规模的二代测序与传统诊断方法比较验证的研究结果,尚有待更高级的循证医学证据支持.
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二代测序技术在结核分枝杆菌研究中的应用进展
结核病是由结核分枝杆菌引起的全球第二大传染病。二代测序技术为从基因组水平研究结核分枝杆菌提供了重要的研究方法。本文从结核病流行病学、结核分枝杆菌耐药和进化及相关生物信息学等方面，介绍二代测序技术在结核分枝杆菌研究中的应用进展。
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急性髓系白血病微小残留病监测方式的展望
在我国人群的肿瘤疾病发生谱中,白血病的发病率为 (4~5)/10 万, 死亡率在恶性肿瘤占第六位(男)和第八位(女),在儿童及35岁以下成人中居第一位,是威胁我国人群健康的一类重大疾病.其中,急性髓系白血病 (acute myeloid leukemia, AML)是一种以异常髓系原始幼稚细胞大量增殖、使骨髓正常造血受抑为主要特征的血液系统恶性克隆性疾病. 随着检测手段的进步和化疗方案的不断完善,成人AML患者的完全缓解率达到了50%~80%不等[1],但有40%~65%的患者仍然会复发[2-4],5年生存率也只能达到30%~40%[5].白血病缓解后复发这一难题依然困扰着患者和医务人员.
关键词： 急性髓系白血病 微小残留病灶 多参数流式细胞术 实时定量聚合酶链反应 二代测序 -
二代测序技术在骨髓增生异常综合征诊治中的临床应用
骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syn-dromes, MDS）是常见的髓系恶性肿瘤，由于其临床预后异质性很大，因此逐渐形成了基于不同预后风险组的分层治疗，而对于MDS预后风险的评估，目前很大部分是基于细胞遗传学特征进行的。临床发现，大部分MDS患者核型由于缺乏特征性结构改变和易位而显示正常，但实际上通过分子遗传学研究可以进一步检测到其存在如 SF3B1、DNMT3A、U2AF1/2、ASXL1、TP53等基因突变，这部分患者在进一步识别后可归类到不同的预后风险组，并指导相应的临床治疗。新的2016版WHO淋巴和造血组织恶性肿瘤分类[1]及2015版美国国立综合癌症网络治疗指南中，均更加注重基因检测特征而非仅依据染色体水平。如新版WHO分类中，分子遗传学水平检测得的重现性SF3B1突变，其与MDS伴有环形铁粒幼细胞增多亚型密切相关，改变了该亚型传统的诊断标准，将骨髓涂片环形铁粒幼细胞≥15％的传统诊断阈值标准降至5％，并确立了其良好预后的提示价值[2]。近年来，高通量二代测序技术已被逐渐运用于临床 MDS 基因的检测中。本文将就该技术在MDS诊断中的应用进行介绍。
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骨髓间充质干细胞:一种新的诊断标志物
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一群具有自我更新能力的祖细胞,在特定的标准化培养条件下,其体外扩增时表型变化很微小.MSCs参与了许多组织的发育过程中,在分化过程中可产生特定表型,如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌细胞.近年来,在许多临床应用中,MSCs被认为是细胞治疗和组织再生的一种重要资源.炎症反应可引起组织损伤,而促炎因子则可复苏MSCs并启动修复过程,这种再生过程相当复杂,MSCs与基质、炎症细胞间的互动及其衍生因子在此过程中发挥了重要作用[1].MSCs可通过抑制T细胞、B细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞来参与免疫抑制[2-5],而这些细胞在移植过程中可能发挥了免疫调节活性[1].由于MSCs参与了多种生理或病理过程,故而靶向MSCs及其相关分子产物有可能成为一种非侵入性的早期诊断方法.
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精准医疗下的恶性淋巴瘤治疗
当2015年美国前总统奥巴马提出“精准医疗”的概念时,许多人认为精准医疗只是一个美好的愿景.但是当2017年5月美国食品药品监督管理局(FDA)加速批准了第一个不依照肿瘤来源,而依照生物学标志进行区分的抗肿瘤药物程序性死亡受体1 (PD-1)单抗派姆单抗(pembrolizumab)用来治疗有高度微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复基因缺陷(dMMR)的既往治疗后出现进展的实体肿瘤患者后,人们惊喜地发现,精准医疗的时代已经悄然来到.
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二代测序法对中央轴空病的诊断价值:附1例报告
目的 探讨二代测序法在中央轴空病诊断中的价值.方法 回顾分析1例中央轴空病患儿的临床资料,以及二代测序和多重连接探针扩增技术对致病基因检测的结果.结果 患儿,女,3岁,临床表现为行走困难缓慢加重、发育迟缓、面部肌无力、先天性髋关节脱位.体格检查显示脊柱侧弯,不同程度近端肌张力及肌力减低、肌容积缩小,腱反射减弱,病理征阴性.肌酸激酶轻度升高,肌电图未见异常.应用二代测序法检测发现患儿RYR1基因存在新生的错义变异c.14582G>A,p.Arg4861His(杂合),经Alamut功能软件预测此位点变异可能会影响蛋白结构与功能,与中央轴空病高度相关.结论 国内首次报道RYR1基因变异位点c.14582G>A,p.Arg4861His.临床高度怀疑中央轴空病时可选择二代测序法确诊.
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基于目的基因捕获的二代测序技术对质谱检测阳性患儿的分子诊断
目的 运用基于目的基因捕获的二代测序技术,对质谱检测阳性的遗传代谢病疑似患儿进行基因检测,探讨二代测序技术在遗传代谢性疾病诊断的应用价值.方法 回顾性收集复旦大学附属儿科医院遗传代谢专科门诊收治的、质谱检测阳性遗传代谢病疑似患儿的剩余干血滴滤纸片,行目的基因捕获的二代测序,行Sanger进行验证.结果 2013年6月至2014年5月共有48例质谱检测阳性的遗传代谢病疑似患儿纳入本文分析,40例完成二代测序,男性22例.40例测序标本中,29例(72.5％)检测到与临床症状相符的基因变异,包括甲基丙二酸血症6例,citrin缺陷病6例,高苯丙氨酸血症5例,戊二酸血症3例,其他遗传代谢病9例.2例疑似citrin缺陷病的标本在SLC25A13基因上仅检测到单个致病性突变,进一步行长片段PCR,检测到2例标本均存在3 kb的杂合插入突变.结论 基于目的基因捕获的二代测序技术在对临床疑似遗传代谢病的检测中,有着较高的阳性诊断率,不仅能为临床医生提供可靠的分子诊断依据,而且可以根据致病基因对疾病分型,有效地为后续的临床治疗和遗传咨询提供依据.
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Ion Torrent PGMTM平台在儿童遗传性疾病诊断中应用初探
目的 在PCR产物定量混合构建文库方法的基础上,探讨Ion Torrent PGMTM平台二代测序应用于儿科常见遗传性疾病诊断的价值.方法 采集临床诊断的2例肌营养不良、1例胆汁酸合成障碍和1例甲基丙二酸血症患儿的外周血,提取基因组DNA,分别针对DMD基因、HSD3B7 基因、AMACR基因及MUT基因采用PCR反应进行编码区扩增,扩增产物定量混合制备成文库,在PGM上完成测序.使用NextGENe软件进行数据分析.同时采用Sanger测序方法,对上述基因进行全基因测序;肌营养不良病例采用多重连接探针扩增(MLPA )进行基因外显子拷贝数变异的检测.结果 例1 肌营养不良患儿DMD基因检测到6个变异,其中c.998C>A,p.333S>X为已知致病突变位点,4个为SNP(rs228406、rs1801187、rs1801188、rs1800280).PGM检测到1个假阳性,为6个连续的T后面插入了1个T.例2 肌营养不良患儿检测到DMD基因 g.2788933943-2790543577共5个外显子的缺失,MLPA检测结果与二代测序结果相符合.例3 胆汁酸合成障碍患儿HSD3B7 基因和AMACR基因共检测到7个变异,其中HSD3B7 基因复合杂合突变c.45-46delAG,FS;c.262G>G/C,p.88G>RG,5个为SNP(rs9938550、rs3195676、rs10941112、rs2278008、rs2287939).例4 甲基丙二酸血症患儿MUT基因检测到3个变异,1个为已知致病突变位点杂合突变c.728-729het-insTT,FS;2个为SNP( rs2229384、rs8589).PGM检测到2个假阳性.结论 基于PGMTM平台、采用PCR产物定量混合构建文库测序的方法,具有低成本、高通量、高灵敏度以及可灵活设计的特点,适合用于儿科临床常见遗传性疾病的检测.但由于二代测序技术可能带来的假阳性,对于检测到的变异需要Sanger直接测序法进一步验证.
关键词： 二代测序 Ion Torrent PGMTM平台 遗传性疾病 儿童 -
甲状腺乳头状癌基因组学改变及其临床应用的研究进展
甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer,PTC)是甲状腺癌中为常见的亚型,尽管大多数PTC预后较好,但仍有少部分预后较差.随着近年来基因组学研究和精准医疗的迅速发展,越来越多与PTC相关的基因组学改变被发现,包括单核苷酸的突变、基因异位与融合、基因拷贝数变化等.这些变化一方面能加深对PTC发生、发展和转归机制的理解,另一方面从临床诊治角度解读这些信息具有重大临床价值:促成对PTC的分子分型,弥补目前常规检查项目的不足,从而提高PTC的诊断效能和预后判断,为新的靶向药物的研发及应用提供理论依据.本文就近年来PTC基因组学研究领域的主要进展及其临床意义进行综述.
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晚期胆管细胞癌患者相关信号通路及其变异与预后的关系
目的:以二代测序技术检测胆管细胞癌患者基因变异状态,并分析与患者预后的相关性;方法:收集了自2016年6月至2018年6月3年收治的40例确诊胆管细胞癌的患者,进行全外显子二代基因测序(NGS),从中筛选出可能的突变(单碱基突变、结构变异、拷贝数变化、基因融合等),回顾性分析患者一线治疗的疾病控制率(DCR),无进展生存期(PFS)及总生存期(OS),分析患者信号通路及其基因变异与预后的关系.结果:40例晚期单管细胞癌患者中TP53基因突变的患者和未发生突变患者的中位PFS和OS分别为11.0 vs 8.3个月(P=0.332)和14.3 vs 32.9个月(P=0.041);而PI3K基因突变的患者和未发生突变患者的中位PFS和OS分别为8.3 vs 11.0个月(P=0.285)和14.3 vs 37.0个月(P=0.020);mTOR通路突变的患者和未发生突变患者的中位PFS和OS分别为6.3 vs 10.3个月(P=0.020)和15.6 vs 19.6个月(P=0.892),通路相关基因发生突变,对生存均没有显著影响.结论:TP53及PI3K通路激活的胆管细胞癌患者整体预后显著差于未激活的患者,mTOR通路激活及IDH突变对预后及疗效没有显著影响的靶点.
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循环肿瘤DNA的研究进展
循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是由肿瘤细胞释放到循环系统中的基因组小片段,其来源于机体所有荷瘤部位,具有含量极低、个体间差异大、半衰期短、匀质性、携带有肿瘤特异性遗传学/表观遗传学变异等特点,与肿瘤的发展进化、休眠耐药、转移复发等密切相关,正逐渐成为肿瘤学分子研究领域的热点.目前针对ctDNA的检测方法和平台种类繁多,主要分为基于PCR和二代测序(next-generation sequence,NGS)的方法,二者各有利弊,需要根据研究目的灵活选择并建立统一标准.随着相关技术的发展和法规的不断完善,ctDNA可作为癌症筛查、早期诊断、个体化治疗及预后评估理想的血源性生物标志物,在肿瘤的精准医疗中必将大放异彩.
