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遗传性骨病及二代测序技术应用进展
遗传性骨病虽然罕见,但致畸率、致残率高,严重影响青少年身心健康,需高度关注并尽可能开展恰当的诊疗.遗传性骨病确诊依赖于致病基因突变检测,及早确诊有助于治疗方案的选择和开展遗传咨询、干预等.本文对遗传性骨病背景和分类、致病基因鉴定方法,以及近年推出的二代测序技术在遗传性骨病中应用进展做一阐述,希望对临床医师开展骨病研究有所裨益.
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应用二代基因测序检测成年起病特发性甲状旁腺功能减退症的致病基因
目的 初步探索单基因突变在成年起病甲状旁腺功能减退症发病机制中的作用,并探索二代基因测序在其中的应用价值.方法 共纳入17例成年起病的特发性甲状旁腺功能减退症(IHP)患者,其中9例患者血钙低于正常时即出现24h尿钙升高,8例为初诊的未治疗患者.收集其临床资料,采用二代基因测序分析其是否存在基因突变.结果 1例患者检出一种新的GCMB基因纯合突变[c.130G ＞A (p.G44S)],突变率为5.9％,Polyphen 2软件预测该突变引起所编码的蛋白质结构和功能的损害预测值为0.999.该患者为36岁女性,以“发作性四肢搐搦10年”就诊,初诊时血钙1.48mmol/L,血磷2.29mmol/L,甲状旁腺素(PTH) ＜3.0ng/L,合并白内障和颅内钙化,治疗后出现高钙尿症,无泌尿系结石,无甲状旁腺功能减退症家族史或其他发育异常表现.结论 对于成年起病的非手术性孤立性甲状旁腺功能减退症患者,基因突变检出率较低.单基因突变尽管不常见,但临床医师应关注可能的由基因突变所致的甲状旁腺功能减退症.
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非小细胞肺癌甲状腺转移一例并文献复习
肺癌是目前严重威胁世界人民健康的恶性肿瘤之一,其新发病例数以每年约3％的速度增长,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占原发性肺癌的70％ ～ 80％,易发生远处转移,常见的转移部位为肝脏(43.5％)、骨(30％～55％)及脑转移等,甲状腺转移的病例报道较少[1-3].
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二代测序技术在骨与软组织肿瘤研究中的应用
近年来,测序技术在肿瘤研究及治疗中应用越来越多,采用该方法可以对肿瘤进行分子特征分析,并试图通过这一过程寻找针对性更强,存在潜在治疗收益的药物,以提高肿瘤治疗效果,特别是对于常规治疗失败的肿瘤.这种方法在一些肿瘤如肺癌、乳腺癌、结直肠癌等领域取得了一些突破性进展,但在异质性很强的肉瘤治疗中,目前尚未得到令人满意的结果,然而对于骨与软组织肿瘤,分子水平检测能否反映出肿瘤生物行为特性,判断预后,指导治疗有待进一步研究.本文旨在通过回顾文献明确二代测序技术在骨与软组织肿瘤基础研究及临床治疗方面的应用现状.
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基于目标序列捕获二代测序技术对结节性硬化症相关肾脏病变患者的基因诊断
目的 评估目标序列捕获二代测序技术在结节性硬化症相关肾脏病变患者基因诊断中的应用价值.方法 分析2014年1月至2015年12月北京协和医院泌尿外科收治的43例临床诊断(33例确定诊断和10例可能诊断)为结节性硬化症相关肾脏病变患者的临床资料.男17例,女26例.年龄10 ～48岁,平均28岁.43例中39例肾脏病变表现为多发性肾脏血管平滑肌脂肪瘤,3例表现为多发性肾囊肿,1例表现为肾透明细胞癌.签署知情同意书后,采集外周血5 ml提取基因组DNA,进行目标序列捕获二代测序靶基因TSC1和TSC2,应用Sanger测序技术完成验证.结果 39例(90.7％)检测到与临床表型相符的基因突变,2例检测到临床意义未明的突变,另2例未能检测到任何突变.我们发现了14种新的致病性突变,包括8种框移突变,3种大片段缺失突变,2种无义突变和1种剪接突变.结论 目标序列捕获二代测序技术可快速、准确检测出TSC1和TSC2基因突变,对于结节性硬化症相关肾脏病变患者的基因诊断具有重要价值.
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基于宏基因二代测序技术检测呼吸道病毒的临床应用
目的 探讨基于宏基因二代测序技术检测呼吸道病毒的临床应用价值.方法 采用随机扩增法、脱氧核糖核酸纳米球、华大基因公司BGI-500测序平台及BWA算法为基础的比对法等技术进行呼吸道痰液标本病毒核酸提取物的二代测序分析,以痰标本中病毒序列数＞100为入选标准,分析检出病毒的类型、序列数及丰度值等参数.结果 根据入选标准,共收集到9例患者,其中77.78％(7/9)的患者合并存在免疫受损因素,如心外科术后、激素治疗、恶性肿瘤、HIV感染等,分别检测出不同病毒的核酸阳性结果如下:4例爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、2例单纯疱疹病毒1型(HSV1)、1例巨细胞病毒(CMV)、1例人博卡病毒、1例腺病毒D型,另外,部分标本中合并检出细环病毒、猪内源性病毒E.Pearson相关性分析表明,在各项测序参数中,RPKM参数(每100万个序列每100 bp碱基对,匹配上的序列数)与患者氧分压指标存在线性相关.结论 呼吸道病毒感染多发生在合并免疫抑制因素的宿主,检出病毒类型包括EBV病毒、HSV1病毒、CMV病毒等,且部分患者可同时检出细环病毒、猪内源性病毒E.另外,RPKM可能与肺部病变严重程度有关,提示RPKM可能对于预测肺内病灶严重程度有一定意义.
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无创产前诊断单基因病的研究策略及进展
发现母体外周血游离胎儿DNA已20年,无创产前诊断领域取得了重大突破,改变了现有的产前筛查模式.无创产前诊断单基因病已得到越来越多的关注及研究.一些单基因遗传病的无创产前诊断已经应用于临床实践,其他常见单基因遗传病无创产前诊断也得到了发展.本文针对目前无创性产前诊断常见单基因病的思路、研究现状及进展进行综述.
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葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变分析
目的 探讨红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺乏症患儿及其父母的G-6-PD基因突变类型,分析G-6-PD缺乏症的遗传特点.方法 选择2013年7月1日至2015年7月1日,于成都市妇女儿童中心医院临床诊断为G-6-PD缺乏症的12例患儿为研究对象.分析其病例资料,并通过二代基因测序(NGS)技术,检测12例患儿及其父母的G-6-PD基因突变发生情况,分析G-6-PD缺乏症的遗传规律.本研究符合2013年修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》,并与患儿监护人签署知情同意书.结果 ①本研究12例临床诊断为G-6-PD缺乏症的患儿,全部检出G-6-PD基因突变,突变类型共计7种,包括6种单个基因位点突变及1种复合基因位点突变.11例单个基因位点突变中,c.1388G>A及c.487G>A基因突变各为3例,c.1376G>T基因突变为2例,c.95A>G、c.871G>A及c.1024C>T基因突变各为1例;复合基因突变c.[-8-631G>A;1388G>A]为1例.②本研究12例G-6-PD缺乏症患儿中,10例患儿为母亲遗传,包括9例半合子男性患儿及1例杂合子女性患儿(c.1388G>A);1例半合子男性患儿为自身突变(c.1024C>T);1例纯合子女性患儿为双亲遗传,为少见c.[-8-631G>A;1388G>A]复合基因突变.结论 G-6-PD缺乏症男性半合子、女性纯合子及女性杂合子,均可表现为G-6-PD严重缺乏而发病.外周血基因检测可为G-6-PD缺乏症产前咨询及确诊提供依据,从而预防G-6-PD缺乏引发的急性溶血性贫血.
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主流生物芯片GWAS catalog癌症相关基因突变检出分析
目的 比较二代测序方法和主流芯片检测已知疾病相关SNP特别是癌症相关SNP检出率的差异.方法 下载GWAS catalog和23andMe、HumanOmni5、GenomeWideSNP6、HumanExome12等主流生物芯片的检测突变数据集和进行基因型填充之后的突变数据集,在Linux系统下用命令和脚本提取rsid列表,对格式进行统一处理,并去除错误、冗余的数据,再各自提取生物芯片和GWAS catalog中与癌症发病、发展、耐药相关的SNP的risd,后将各生物芯片检出的SNP rsid集和GWAS catalog rsid数据集进行比较并计算检出率.结果 各生物芯片检测所有疾病相关或仅癌症相关SNP的检出率偏低.进行基因型填充后,检出率有明显提升.结论 虽然以生物芯片进行基因型填充可以提高已知SNP的检出率,但二代测序是进行较高质量个人疾病分析、健康风险管理和医疗服务的更好手段,生物芯片更适合针对部分相关度比较高的疾病SNP进行定制开发,进行定向疾病风险预测.
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二代测序技术检测肺癌相关基因突变状态临床病理意义
目的 肺癌的靶向治疗前需检测相应驱动基因和耐药基因的突变情况.二代测序技术可以单次高通量检测多个基因状态,辅助临床诊疗.本研究探讨二代测序技术检测肺癌相关基因突变状况,并初步分析其突变的临床病理意义.方法 回顾性分析解放军总医院2017-06-01-2017-10-30行手术切除及活检的肿瘤组织＞20％的肺癌标本123例.采用Ion Torrent二代测序平台分别检测34个基因共586个突变位点,检测结果对照相应的基因数据库分析.结果 123例肺癌样本TP53的突变率是93.50％ (115/123),EGFR的突变率是43.09％ (53/123),KRAS是13.01％(16/123),STK11是8.13％ (10/123),ERBB2、BRAF均为6.50％(8/123),CTNNB1是5.69％(7/123),MET是3.25％(4/123),PTEN、MAP2K1均为2.44％ (3/123),SMAD4、PIK3CA和IDH1均为1.63％ (2/123).ALK是4.07％(5/123),RET是3.25％(4/123),ROS1是0.81％(1/123).≥61岁患者的TP53突变率明显高于＜61岁,x2=3.992,P=0.046.EGFR基因在年龄＜61岁(x2=6.534,P=0.011)、不吸烟(x2=10.559,P=0.001)的患者中突变率明显升高.女性患者的ERBB2突变率高于男性,x2=5.081,P=0.024.BRAF基因突变率在分化程度较低的患者中较高,x2 =8.261,P=0.016.STK11基因突变在年龄≥61岁(x2=4.516,P=0.034)、分化程度较低(x2=7.465,P=0.006)的患者中突变率较高.检测到的基因突变主要发生在腺泡为主的组织类型,同时查见多个基因突变共存的病例.52.94％ (18/34)的被检测基因有特定的靶向药物,47.06％ (16/34)的检测基因有尚处于临床实验阶段的靶向药物.结论 采用Ion Torrent二代测序平台可以用于临床观察肺癌基因突变谱的改变,对后期选择针对这些基因的靶向治疗具有广阔的应用前景.
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100例遗传性乳腺癌胚系基因BRCA1/2突变研究
目的 探讨遗传性乳腺癌患者胚系基因BRCA1/2的外显子区域突变情况及其与临床病理特征的关系.方法 本研究为回顾性研究.根据纳入和排除标准,选择2014年2月至2016年2月山西省人民医院乳腺外科确诊的100例遗传性乳腺癌患者作为研究对象,采用二代测序技术检测患者胚系基因BRCA1/2突变的情况,并收集其年龄、组织学分级、淋巴结状态以及ER、PR、HER-2状态等临床病理资料.然后,采用Fisher确切概率检验比较BRCA1与BRCA2基因突变类型的差异,并用x2检验分析BRCA1/2基因突变与乳腺癌患者临床病理特征的关系.结果 在100 例遗传性乳腺癌患者中,有6例患者携带BRCA1基因突变,11例患者携带BRCA2基因突变.而在6例BRCA1基因突变者中,发生移码突变和无义突变者分别占4/6、2/6;在11例BRCA2基因突变者中,发生移码突变和无义突变者分别占4/11、7/11;2组间比较,基因突变类型的差异无统计学意义(P=0. 335).在组织学分级1、2级的患者中,携带BRCA1、 BRCA2 基因突变者以及不携带 BRCA1/2 基因突变者分别占4. 4% (4/91)、8. 8% (8/91)和86. 8% (79/91),而在组织学分级为3级的患者中,携带BRCA1、 BRCA2基因突变者及不携带BRCA1/2基因突变者分别占2/9、3/9 和4/9,组间比较,差异有统计学意义(x2=9. 398,P=0. 007).在HER-2阴性乳腺癌患者中,携带BRCA1、 BRCA2基因突变者及不携带BRCA1/2基因突变者分别占 10. 7% (6/56)、16. 1% (9/56)和 73. 2% (41/56),而在 HER-2 阳性乳腺癌患者中,携带BRCA1、 BRCA2基因突变者及不携带BRCA1/2 基因突变者分别占0(0/44)、4. 5% (2/44)和95. 5% (42/44),组间比较,差异有统计学意义(x2=9. 072,P=0. 007).结论 遗传性乳腺癌患者胚系基因BRCA1/2突变在不同组织学分级、不同HER-2状态的患者间存在差异.本研究在丰富遗传性乳腺癌临床遗传学资料的同时,可能为后期的个体化精准治疗奠定一定的理论依据.
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中枢神经系统李斯特菌感染患者的临床和脑脊液二代测序结果分析
目的 评价脑脊液二代测序在中枢神经系统(CNS)李斯特菌感染诊断中的潜在应用价值.方法 为明确2017年6—11月在河南省人民医院神经内科住院的5例CNS感染患者的致病微生物,采用血液与脑脊液常规、生化、细胞学、培养、革兰染色等实验室检测方法,应用BGISEQ-100测序平台进行脑脊液病原测序,同时收集患者的相关临床资料,对患者的临床、实验室与辅助检查结果进行综合分析.结果 在5例患者中,男性1例,女性4例,年龄26～61岁,发病前3例有免疫抑制剂治疗史,3例前驱期有消化道症状,CNS受累后均有发热、头痛,脑膜刺激征,影像学表现为脑膜、脑干或脑室周围受累,脑脊液细胞数>500×106/L,脑脊液二代测序检测到单核增生性李斯特菌的核酸序列数57～2611条,基因覆盖度为0.23％～14.00％,PCR验证结果支持5例患者的CNS李斯特菌感染临床诊断成立.结论 脑脊液二代测序技术可准确判断CNS李斯特菌感染,有利于及时治疗.
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远端肌无力中性脂质沉积症一家系报告
目的 通过报道远端肌无力中性脂质沉积症一家系临床、病理特点并结合文献复习,探讨该病诊断、鉴别诊断要点.方法 收集2008年1月就诊于我科的远端肌无力中性脂质沉积症一家系中2例患者的临床资料以及电生理检查和骨骼肌活体组织病理检查结果,提取DNA行基因检测,同时复习相关文献.结果 本家系中2例患者为同胞姐妹,临床表现相似,均于30岁后发病,临床以四肢远端无力、肌肉萎缩为主要表现;血肌酸激酶均升高(分别为1067、740 U/L).肌电图检查均呈肌源性损害.骨骼肌活体组织病理检查,多数肌纤维内可见大量脂滴沉积.二代测序发现PNPLA2基因c.187+1 G>A纯合剪切突变.结论 本组2例中性脂质沉积症伴肌病患者以肢体远端无力发病,应与远端肌病相鉴别.肌肉活体组织检查发现肌纤维胞质中存在大量脂滴可确诊该病.二代测序有助于脂质沉积性肌病的分型诊断.
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胶原Ⅵ蛋白相关肌病六例临床、病理、分子生物学研究
目的 回顾性分析经分子生物学诊断的6例胶原Ⅵ蛋白相关肌病患者的临床、病理、基因变异特点,提高对胶原Ⅵ蛋白相关肌病的认识.方法 对2010—2017年间于我科住院的患者,经外周血或冰冻骨骼肌组织行二代测序后筛选胶原Ⅵ蛋白相关肌病6例,收集患者临床资料、骨骼肌活体组织检查结果等.结果 6例患者均为幼儿期起病,起病年龄(2.00±0.75)岁,出生后存在运动发育迟缓;6例均表现为四肢近端肌无力,1例伴远端肌无力;3例伴骨关节病变;1例重度皮肤瘢痕.血清肌酸激酶187～380 U/L,呈轻度升高.肌电图3例均呈肌源性改变,2例轻度神经源性改变,1例为肌源性合并神经源性改变.二代测序基因检测结果发现4例COL6A1基因杂合突变(3例为已报,1例新发)、1例COL6A2基因新发杂合突变、1例COL6A1和COL6A2新发复合杂合突变.骨骼肌活体组织检查病理分析示:肌纤维大小不一、结缔组织增生明显,散在不透光肌纤维;6例均经抗胶原Ⅵ、Ⅳ蛋白单克隆抗体免疫荧光双染,肌纤维膜胶原Ⅵ蛋白表达均呈不同程度缺失.结论 胶原Ⅵ蛋白相关肌病具有高度临床异质性,骨骼肌活体组织检查病理分析缺少特异性,抗胶原Ⅵ、Ⅳ单克隆抗体免疫荧光双染可见胶原Ⅵ蛋白部分或完全缺失.二代测序基因分析对于诊断临床中间型胶原Ⅵ蛋白相关肌病具有重要价值.
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一噪声相关常染色体显性遗传耳聋家系遗传性分析
目的：分析一个与噪声接触相关的常染色体显性遗传性耳聋家系的听力学及遗传学特征，制定致聋基因鉴定策略。方法对该常染色体显性遗传性耳聋家系进行问卷调查，听力学检测及全身体查，绘制该耳聋家系的遗传图谱，分析其听力学及遗传学特点。应用Sanger测序技术进行候选基因鉴定。结果该家系共5代，进行听力学检测者为13人，听力下降者6人，其中3人有明显的噪声接触史。听力学表现为双侧迟发性感音神经性耳聋，先以高频听力损失为主，随后逐渐加重累及全频听力下降，听力开始下降年龄在16-37岁之间。起病后3年症状明显加重。应用Sanger测序技术进行候选基因鉴定，未发现致聋突变位点。结论这个家系成员为高频听力下降为主的迟发性感音神经性耳聋，符合常染色体显性遗传非综合征型耳聋特点，且怀疑有噪声易感因素。计划下一步通过对家系的表型分析运用新一代测序技术希望鉴定出该家系的致聋基因。
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检测4种血流感染病原体的靶向序列富集与测序相结合技术方法评价
目的 应用Ampliseq技术,建立可同时检测金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)4种常见血流感染病原体的目标片段特异性富集结合二代测序的方法,为准确、快速检测血流感染提供有效的依据.方法 构建模拟临床样本评价该法的低检出限(LOD),与实际掺入菌量比较,评价其灵敏度和特异性.结果与结论 Ampliseq 法的灵敏度为95.38%,特异性为95.45%,Kappa值为0.839~1.000,LOD均可达到101数量级CFU/ml.该法可在15 h内在同一反应体系内快速检测4种常见血流感染病原体,灵敏度和特异性均较好.
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肺癌相关基因突变二代测序检测试剂参考品的建立
目的:建立肺癌相关基因突变二代测序(next-generation sequencing,NGS)检测试剂参考品并制定其质量标准,用于NGS技术以细胞游离脱氧核糖核酸(cell free DNA,cfDNA)为待测样本的肺癌相关基因突变检测试剂的质量控制和评价.方法:选择携带EGFR基因G719S,E746_A750del,S768I,T790M,L858R,EML4-ALK以及ROS1-SLC34A2基因融合突变的细胞系进行培养,并对各细胞系携带的基因突变进行鉴定和突变频率测定.将细胞系DNA按适当比例混合后超声打断,模拟自然状态cfDNA,作为阳性、重复性和低检出限参考品候选样本;不携带上述基因突变的阴性细胞系DNA打断后作为阴性参考品候选样本.参考品候选样本的基因突变的频率经过定量后应用8家公司的试剂进行协作标定.根据作标定结果确定参考品的质量标准,并考察其稳定性.结果:本参考品为包含8种肺癌相关基因突变的混合参考品,由1份阳性参考品、4份阴性参考品、2份重复性参考品以及4份低检出限参考品(L1 ～L4)组成,质量标准规定对低检出限参考品L1 ～ L3检测各基因突变的低突变频率在0.7％ ～1.2％时必须检出.稳定性考核结果表明反复冻融3次不影响参考品的稳定性.结论:本研究建立了肺癌相关基因突变二代测序检测试剂参考品并制定了质量标准,能够为相关试剂的质量控制和评价提供依据.
关键词： 肺癌 细胞游离脱氧核糖核酸 参考品 二代测序 -
老年原发性直肠癌组织中miRNA-143和miRNA-221的靶基因预测及相关生物信息学分析
目的 探讨miRNA-143和miRNA-221在老年直肠癌中的诊断价值及临床意义.方法 收集2015年9月-2016年12月蚌埠医学院第一附属医院老年直肠癌患者标本50例和健康人群标本30例,使用高通量测序技术、荧光定量PCR检测验证直肠癌及正常组织中miRNA差异表达;Pearson检验对miRNA-143和miRNA-221进行相关性分析;miRBase数据库预测两者miRNA的靶基因;R 3.4.0软件绘制差异miRNA热图聚类图,miRNet数据库和cytoscape 3.5.1绘制miRNA与mRNA表达调控网络.结果 对比正常组织,miRNA-143和miRNA-221在老年原发性直肠癌组织中均下调(P ＜0.001,P=0.009),两者表达水平呈正相关(r=0.517,P=0.003).GO功能注释主要富集于MAPKK活性、干细胞发育、STAT蛋白酪氨酸磷酸化调控、蛋白质磷酸化氨基酸结合、酪氨酸磷酸化肽、调节脂质激酶活性、磷蛋白聚合、核转录mRNA聚A尾缩短等生物学过程和分子功能(P＜0.01);KEGG信号通路富集主要涉及TP53基因调节细胞死亡基因转录、VEGF信号通路、IL-4信号通路、抑瘤素M信号通路(P＜0.01).调控网络表明miRNA-143和miRNA221之间有少许靶基因重合,两者之间具有协同作用.结论 miRNA-143和miRNA-221作为直肠癌抑癌因子,为临床老年直肠癌的诊断提供一定的临床意义.
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社区获得性肺炎病原学检测新进展
成人社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)是全球高发病率、高死亡率的疾病之一.明确CAP的致病微生物能够指导佳的抗感染治疗策略,改善患者预后,且具有重要的流行病学及公共卫生学价值.传统微生物学检测方法如微生物培养、尿病原体抗原检测等简便、普及性高,但受时效性、敏感性、标本运输处理、分离培养条件等多方面的限制.近年来微生物核酸分子检测技术快速发展,基于聚合酶链式反应(poly-merasechain reaction,PCR)的核酸分子扩增检测能够快速定量检测目标病原体基因片段,敏感性、特异性高.二代测序技术为呼吸道微生物检测带来了重大变革,能同时测定许多病原体的保守基因序列,使对呼吸道微生物群落的研究达到前所未有的广度和深度.传统检测方法的继续改良与核酸分子检测手段的不断创新,多种检测手段的优化组合,将为临床CAP的诊断提供更全面准确的病原学信息.同时,下呼吸道微生物组学的研究有望揭示CAP发生发展与呼吸道微生物组变化的关系,使CAP的临床诊疗进入新的时代.
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液体活检在结直肠癌中的应用进展
近年来二代测序发展迅速.目前,市场上已有多套临床自动化测序系统,突破了循环肿瘤DNA( ctDNA)在检测技术上的限制. ctDNA和循环肿瘤细胞(CTC)检测对优化结直肠癌临床治疗有重要意义.尤其是在术后复发监测及靶向药物用药后的耐药分析方面,ctDNA与CTC的应用已十分接近临床且被证明效果优于现有检验手段.此外,在结直肠癌的早期筛查领域,ctDNA也表现出巨大的应用潜力,已有实验策略可准确识别肿瘤原发灶.未来,在标准化实验流程并完善大样本临床对照研究后,液体活检将成为结直肠癌的主要检测方法.
