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应用目标基因捕获结合二代测序技术检测无遗传性眼病家族史的遗传性视网膜疾病患者的致病基因
背景 遗传性视网膜疾病(HRDs)是以原发性视网膜病变为主要病理改变、视力和色觉等视敏度严重损害为主要临床表现的致盲眼病,其与遗传因素密切相关,是临床上难治性盲的首要原因. 目的 应用目标基因捕获结合二代测序技术检测HRDs的致病基因. 方法 选择2014年1月至2015年1月在宁夏眼科医院就诊的无遗传性眼病家族史的20例HRDs患者作为研究对象.收集所有患者及其家庭成员临床资料,完善眼科检查,抽取患者和家庭正常成员外周静脉血,提取DNA.针对232个HRDs已知致病基因的目标序列设计并定制目标序列捕获芯片,借助高通量二代测序技术检测患者的遗传变异,数据经分析滤过,候选突变进行Sanger测序验证和致病性评估,明确致病基因和突变,并对表型和基因型间的关系进行分析.结果 20例HRDs患者中有11例患者检测到致病性突变位点,共涉及9个基因,阳性率为55％.其中有8例患者检测到复合杂合突变,3例患者为纯合子突变,均为新发现的突变位点.通过对家系成员的基因筛查分析,6例HRDs患者为常染色体隐性遗传,5例遗传类型不确定.结合临床表型以及基因检测结果分析,11例HRDs患者的诊断分别为锥杆细胞营养不良5例,致病基因分别为ABCA4、RPE65、USH2A、RIMS1和RHO;Leber先天性黑曚3例,致病基因分别为CRB1(2例)和LCA5;先天性静止性夜盲l例,致病基因为PRPF3;Best卵黄样黄斑营养不良1例,致病基因为BEST1基因;Stargardt病1例,致病基因为ABCA4基因. 结论 目标基因捕获结合二代测序技术可以对视网膜疾病患者进行快速、有效的基因诊断,结合临床特征分析有助于提高隐性遗传及遗传方式不明的HRDs的临床诊断水平.
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遗传诊断和胚胎植入前遗传诊断在防治儿童遗传眼病中的重要作用
儿童遗传眼病是指在儿童阶段由遗传因素引起的眼病,是导致儿童不可避免盲的主要原因之一.常见的儿童遗传眼病包括遗传性视网膜变性疾病、先天性白内障及视网膜母细胞瘤等.儿童遗传眼病存在显著的遗传和临床异质性,遗传背景复杂,致病基因众多,给遗传诊断带来了极大困难.儿童眼病表型隐匿,临床表现复杂,患儿对检查的配合多欠佳,这也给临床诊断带来了难度.因此,探索儿童遗传眼病的分子遗传学病因有助于儿童遗传性疾病的病理机制研究,并可为患者提供专业的遗传学咨询,指导优生优育,是辅助临床诊断、疾病预防和开展基因治疗的重要前提,具有十分重要的现实意义,也是目前国际眼科研究的主要热点之一.
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一种基于二代测序技术的无创产前诊断方法
染色体非整倍体疾病是一种偶发性疾病,包括常见的唐氏综合征、18-三体综合征、13-三体综合征等,需要通过产前筛查和诊断控制其发病率.传统的产前筛查和诊断方法在敏感性和特异性方面存在缺陷,或因其有创的取样方式带来的高流产率广受诟病.基于第二代测序技术的无创产前检测通过不加区分的对孕妇外周血中的总游离DNA片段进行测序,运用生物信息学技术将序列与人类23对染色体进行比对,计数片段数量并计算其所占比例,当所关注染色体发生非整倍体现象时,该比例将发生具有统计学意义的变化,从而检测疾病,其敏感性和特异性远高于传统方法.笔者将通过介绍该技术在原理、有效性和是否有创取样方面与传统产前诊断技术的区别,该技术的发展现状,为广大医务工作者和患者提供一个新的思路和选择.
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LAMB2基因新突变所致先天性肾病综合征一例及文献复习
目的通过对1例Pierson综合征的女性患儿临床型和基因型分析并进行相关文献复习，以提高对 Pierson综合征的认识。方法检测先证者各项血生化指标以及详细体格检查；二代测序分析先天性肾病综合征相关的21种基因；用 Sanger 方法验证先证者及其父母外显子突变状态。结果先证者血生化检测显示大量蛋白尿(尿蛋白肌酐比53497.1μg/mg)，尿液检测显示隐血+++，蛋白+++，低白蛋白血症(16.1 g/L)；基因分析显示先证者LAMB2基因编码区存在复合杂合突变， Exon9c.1176_1178del TCT导致392位苯丙氨酸缺失，来自先证者母亲；Intron29c.4923+2T>G导致剪切突变，来自先证者父亲。先证者给予间断输注白蛋白，维持电解质酸碱平衡治疗，因感染于117日龄死亡。根据以上临床资料，总结复习相关文献。结论该患儿的LAMB2的复合杂合突变是导致Pierson综合征的新突变；Pierson综合征肾外症状表型和肾脏表型并不平衡，肾脏表型可能与基因突变所致蛋白功能缺陷程度相关，同时也受到表观遗传学影响；而眼部表型可能与LAMB2的基因型相关；因此对于婴儿期出现的肾病综合征或肾病范围蛋白尿的患儿，无论是否存在肾外的症状均应进行相关基因分析除外Pierson综合征。随着二代测序在临床的应用，必须仔细分析以确定二代测序所发现的新突变与疾病的关系。
关键词： 先天性肾病综合征 Pierson综合征 LAMB2 基因突变 二代测序 -
老年急性髓系白血病基因突变及临床意义
目的:探讨老年急性髓系白血病(AML)患者基因突变情况及其临床意义.方法:采用二代测序方法检测69例初诊老年AML患者基因突变情况,包括TET2,DNMT3A,NPM1,CEBPα,EZH2,JAK2,U2AF1,RUNX1,NRAS,TP53,IDH2,C-KIT,SRSF2,SF3B1,ASXL1,FLT3,ETV6,PHF6,CBL,SETBP1,ZRSR2,收集患者临床资料,分析突变发生率及临床意义,针对49例接受DCAG治疗患者分析疗效及预后.结果:老年AML患者基因突变频率高,突变率为94.2％(65/69),NPM1,SRSF2,SF3B1在4种白血病分型间分布存在差异(均P＜0.05).C-KIT突变易出现在染色体核型低中危组(P＜0.001),TP53突变与高危核型有关(P=0.003).TP53突变,ETV6突变,合并症数目,染色体核型及DCAG首次诱导完全缓解均为影响预后的因素,其中TP53突变,首次诱导完全缓解及合并症数目为独立危险因素(P＜0.05).结论:老年AML患者基因突变及细胞遗传学异常对临床诊疗工作具有重要意义.
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二代测序在弥漫大B细胞淋巴瘤中的应用
1 弥漫大B细胞淋巴瘤分类诊断弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)虽是一类独立疾病,但存在明显的异质性,具有不同的临床表现、形态特点、免疫表型、分子亚群和临床预后.根据基因表达谱可将DLBCL分为至少3种亚型,分别为生发中心B细胞样(GCB)亚型、活化B细胞样(ABC)亚型及原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL),后两者统称为非GCB亚型.GCB-DLBCL预后较好,常伴t(14;18) (q32;q21)、PTEN缺失、miR-17-92扩增或TP53突变;ABc-DLBCL预后较差,常伴t(3;14) (q27;q32)、INK4A-ARF缺失或BCL2扩增;PMBL的分子异常类似于霍奇金淋巴瘤,包括JAK2扩增、SOCS1缺失[1].
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肺癌分子生物学研究进展
肺癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率都非常高.高通量二代测序技术的发展推动了肺癌分子生物学的研究.近年来针对肺癌的基因组及转录组变异特征的研究取得了很大的进步,然而尚缺乏对肺癌发生发展过程的多组学分子机制的研究.本文通过对近年来肺癌分子生物学研究成果进行综述,希望为今后的研究提供方向和依据.
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多种方法结合对一个肾单位肾痨患者家系的基因筛查验证
目的:探讨少年型肾单位肾痨1型(NPHP1)的临床特点基因诊断方法,采用多种方法对其家系进行筛查验证.方法:2018年7月我院基因诊断中心收入1例男性肾衰患儿(14岁),收集分析其临床资料,利用二代测序技术对其进行基因检测.确诊后扩增患儿及其父母弟弟的NPHP1基因内多个微卫星标记以及内参标记位点,同时采用琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳技术,对患儿弟弟进行筛查验证.结果:二代测序结果显示该患儿样本NPHP1基因整体纯合缺失,该变异为致病性变异,结合临床表现确诊为NPHP1.琼脂糖凝胶电泳结果显示该患儿NPHP1基因前后内参标记D2S1896,RanBP11/12阳性,微卫星标记del-2,del-5-(5)2,del-9,del-10,del-16均为阴性;该患儿父母和弟弟NPHP1基因内参和微卫星标记均为阳性.内参及微卫星序列的毛细管电泳结果显示该患儿弟弟NPHP1基因同时存在来自于父亲和母亲的序列片段,排除该致病基因的纯合或杂合缺失.结论:利用毛细管电泳技术检测NPHP1基因微卫星标记,判断该位点纯合或杂合性缺失,简单易行,可作为常规筛查手段辅助肾单位肾痨的诊断.
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良性特发性眼睑痉挛患者的可能致病基因
目的:探讨遗传因素对良性特发性眼睑痉挛(BEB)的可能影响.方法:选择2015年4月至2015年10月在武汉大学人民医院神经内科运动障碍专病门诊就诊的BEB患者20例.采取问卷调查的方式详细调查患者的情况,调查内容包括一般情况、病史摘要、治疗情况、既往病史(高血压病、糖尿病、脑外伤等)、家族史、危险/保护因素调查(吸烟、饮酒、饮茶、咖啡等).在患者知情同意的情况下,抽取患者静脉血3-5 ml.采用二代测序方法,检测可能导致运动障碍临床表现各类疾病相关的基因共151种,包括肌张力障碍27种、发作性共济失调4种、发作性运动诱发性运动障碍2种、发作性非运动诱发性运动障碍1种、特发性震颤3种、帕金森病78种以及ADCK3、AFG3L2、AN010等.结果:20例患者中,男3例、女17例,平均年龄55.25(31-72)岁,病程平均6.15(1-24)年;有家族史者2例.未发现任何一种基因突变者2例;检测出两种基因突变者7例;SYNE1基因突变7例,CIZ1基因突变2例,CACNA1A基因突变2例,LRRK2基因突变2例,FUS基因突变2例;C10orf2、TPP1、SLC1A3、PNKD、EIF4G1、SETX、PRRT2、SPTBN2和TTBK2基因突变者各1例.结论:眼睑痉挛和其它肌张力障碍性疾病一样,存在遗传学基础.CIZ1和SYNE1基因突变极有可能与眼睑痉挛有关.我们需要扩大样本量来进一步筛选基因,或通过家系研究来寻找易感基因.并进一步在动物实验中验证.
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晚期肺腺癌患者一线使用EGFR-TKI获得性耐药后T790M与预后的相关性
目的:探讨循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)鉴定的EGFR基因20位外显子T790M突变状态与晚期肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)患者一线使用EGFR-TKI获得性耐药和预后的相关性.方法:回顾性分析2012年1月至2016年1月南京总医院一线使用EGFR-TKI获得性耐药的晚期LUAD患者93例,按照QIAamp循环核酸试剂盒说明提取外周血ctDNA,采用二代测序(nextgeneration sequencing,NGS)的方法对ctDNA中T790M突变进行鉴定,分析其与临床特征和预后的相关性.结果:在93例一线使用EGFR-TKI获得性耐药的晚期LUAD患者,T790M阳性突变率为52.7％(49/93),T790M突变与晚期LUAD患者的年龄、临床分期、组织学亚型、ECOG评分、初始EGFR突变类型、EGFR-TKI种类差异均无统计学意义(P＞0.05);但与性别、吸烟史、EGFR-TKI耐药后进展类型、EGFR-TKI耐药后血CEA水平、EGFR-TKI耐药后治疗方案比较差异有统计学意义(P＜0.05),EGFR-TKI耐药后血CEA预测T790M阳性的cut-off值为90.1 μg/L,其中敏感度44.9％、特异度90.9％,曲线下面积0.639(95％CI 0.526～0.752);T790M阳性突变患者的中位无进展生存期(progression-free survival,PFS)和总生存期(overall survival,OS)分别为12.4,29.5个月,均较T790M突变阴性的6.2,18.1个月显著延长(P＜0.001);Cox单因素和多因素回归分析均提示T790M突变阳性是PFS(RR=0.302,95％CI 0.162～0.560;P＜0.001)和OS (RR=0.422,95％CI 0.250～0.715;P=0.001)的独立影响因素.结论:T790M突变与晚期LUAD患者的性别、吸烟史、EGFR-TKI耐药后进展类型、EGFR-TKI耐药后血CEA水平、EGFR-TKI耐药后治疗方案有关,同时是PFS和OS的独立影响因素.
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二代测序在检测感染性心内膜炎患者心脏瓣膜组织病原体中的应用
目的 评估二代测序(NGS)技术在检测感染性心内膜炎(IE)患者瓣膜中潜在病原菌的应用价值,为IE的诊断和术后治疗提供帮助.方法 根据改良Duke标准,对IE患者和排除IE患者的瓣膜组织进行传统培养,同时应用NGS技术直接检测瓣膜组织上的病原菌,并将其检测结果与血培养 、病理涂片染色结果进行比对.结果 NGS的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为95.0％、85.7％、95.0％ 和85.7％,血培养分别为30.0％、100.0％、100.0％、30.0％,瓣膜培养为10.0％、100.0％、100.0％、28.0％.结论 与传统培养方法相比,NGS检测IE瓣膜赘生物的灵敏度更高,时间短.NGS对IE的诊断,尤其是培养结果为阴性疑似IE的诊断和治疗有较大的应用价值.
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47例不明原因婴儿期癫癎性脑病的基因突变分析
目的 探讨不明原因婴儿期癫癎性脑病(EE)的基因突变特点.方法 以47例不明原因婴儿期EE患儿为研究对象,利用二代测序技术对所有患儿及其父母进行基因突变分析.结果 47例患儿中23例检出基因突变,其中13例为新发突变、10例为父亲或母亲存在杂合突变.23例基因突变阳性患儿中,17例检出EE相关基因突变(14例为离子通道类基因突变),2例检出先天性遗传代谢病相关基因突变,2例检出脑结构异常相关基因突变,2例检出精神智力发育迟滞相关基因突变.结论 婴儿期EE可能存在基因突变,以离子通道类基因突变为主.
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首例非白人婴儿肝衰竭综合征1型患儿临床特点和分子诊断研究
婴儿肝衰竭综合征1型(ILFS1)是一种由胞质亮氨酰-tRNA合成酶基因(LARS)突变所导致的常染色体隐性遗传病.本研究报道首例非白人ILFS1患者的临床特点和分子诊断经过,为ILFS1的诊治提供参考.患者为2岁9个月男孩,因发现肝脾肿大1年余就诊.1岁5个月时发现肝脾大,实验室检查发现丙氨酸氨基转移酶和门冬氨酸氨基转移酶偏高、低蛋白血症、凝血功能异常和贫血,肝脏病理提示肝硬化和脂肪肝;SLC25A13基因高频突变筛查和一代测序分析仅检测到一个父源性突变c.1658G>A,cDNA克隆分析也未发现母源性SLC25A13等位基因异常转录子;代谢性肝病相关基因外显子组捕获二代测序在患儿LARS基因检出父源性突变c.2133_2135del(p.L712del)和母源性突变c.1183G>A(p.D395N),经一代测序验证,终确诊为ILFS1.目前随访至4岁,肝功能正常,无贫血,仍有低蛋白血症.
关键词： 婴儿肝衰综合征1型 LARS基因 SLC25A13基因 二代测序 -
Alagille综合征患儿1例临床和遗传学分析:一个包含JAG1基因的染色体新中间缺失的识别
Alagille综合征(ALGS)是一种常染色体显性遗传病,可累及肝脏、心脏、骨骼、眼睛、肾脏、颜面等多个系统.本文报道1例ALGS患儿的临床和遗传学特征.患儿为3个月10 d男婴,因发现皮肤、巩膜黄染3个月就诊.体格检查示:宽额头,小下颌;胸骨左缘第2、3肋间可闻及3~4/6级收缩期杂音;腹部膨隆,肝右肋下3 cm可触及,质地中等.生化结果示肝功能明显异常,胆红素升高,且以结合胆红素升高为主,伴总胆汁酸和 γ-谷氨酰转肽酶显著升高.心脏彩超示房间隔缺损、肺动脉狭窄.二代测序发现该患儿JAG1基因整体杂合缺失,而染色体微阵列分析在患儿20号染色体p12.3p12.2处检出约3.0 Mb缺失,该范围包含ALGS致病基因JAG1.该患儿具备特殊面容、心脏畸形和胆汁淤积等临床表现,结合遗传学分析结果,诊断ALGS明确.确诊后给予对症支持治疗,现已随访至生后11个月,胆红素较治疗前明显下降,但总胆汁酸和 γ-谷氨酰转肽酶等指标仍明显升高,其远期预后仍有待随访观察.本研究扩展了JAG1基因突变谱,同时为患儿诊断、治疗及家系遗传咨询和产前诊断提供了实验室依据.
关键词： Alagille综合征 JAG1基因 二代测序 染色体微阵列 儿童 -
微小残留病变检测在儿童急性白血病中的应用
近年来,儿童急性白血病(AL)治疗效果随化疗方案的改进和危险分层治疗的引入取得很大进展.但微小残留病变(MRD)仍然是影响AL预后的一大难题.MRD水平影响化疗方案的选择、复发风险的分级,同时还可用于判断预后.目前检测MRD的方法主要有流式细胞术(FCM)和PCR.随着二代测序技术(NGS)的不断成熟与发展,其在MRD检测尤其在干细胞移植(SCT)后MRD检测方面扮演着重要角色.本文对微小残留病变检测在儿童急性白血病中的应用进行综述.
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头孢曲松对乳鼠肠道上皮组织及肠道菌群的影响
目的 探究头孢曲松对生命早期小鼠肠道上皮组织及肠道菌群的影响,以及对成年期小鼠肠上皮组织恢复及菌群再建的影响.方法 36只BALB/C新生小鼠随机分为对照组和实验组(n=18).实验组小鼠在出生后21d内,每日用头孢曲松(100 mg/kg)灌胃,对照组用等量生理盐水灌胃.采用免疫组化法检测小鼠肠道各部位上皮细胞相关蛋白(Ki67、Muc2、ZO-1)表达;qPCR和二代测序法分析小鼠粪便细菌总浓度及粪便细菌组成.结果 头孢曲松干预21d时,与对照组比较,实验组小鼠体重、肠上皮细胞相关蛋白Ki67、ZO-1表达降低,Muc2表达升高(P＜0.05);总细菌浓度下降但丰富度及多样性增高(P＜0.05);粪便细菌以厚壁菌门为主,含较多葡萄球菌和肠球菌.生后56d时,实验组小鼠肠道上皮组织有所恢复,但体重、菌群群落结构等仍和对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 早期头孢曲松干预能显著损伤机体早期肠道上皮组织的发育和肠道菌群的构建,肠道菌群在生命早期的损伤会部分地延续到成年期,有可能继续影响机体在成年期各种生长发育及生理代谢.
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基于二代测序平台的法医STR分型
目的 探究二代测序(NGS)技术平台在法医短串联重复(STR)分型中的应用.方法 采集402个广东汉族无关个体样本,基于Ion PGM测序平台,对15个STR基因座(D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、vWA、D2S1338和D19S433)进行序列测定和基因分型.分析基于STR重复序列多态性检出的STR等位基因,计算其等位基因频率,评估法医学应用效能.结果 在15个STR基因座中共检测到202种不同重复序列的等位基因.在D3S1358、D5S818、D13S317、D21S11、FGA、vWA、TH01等7个基因座中检测到54种长度相同而重复序列不同的等位基因亚型,基于重复序列多态性分析的STR分型技术的杂合度、个体识别力、多态信息含量、非父排除率等法医学参数均大于基于片段长度检测的STR分型技术,随机匹配概率小于基于片段长度检测的STR分型技术.结论 基于NGS技术平台的STR分型技术提高了STR基因座的多态性和检测效能,具有很好的法医学应用价值.
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肺癌患者EGFR及KRAS基因突变检测方法的建立和临床应用
目的 本研究拟在评估二代测序(next generation sequencing,NGS)技术在肺癌临床分子诊断中应用的可行性. 方法 本研究选取108例肺癌石蜡包埋样本(formalin fixed paraffin embedded,FFPE),同时进行一代测序(sanger sequencing)和NGS检测样本中EGFR和KRAS基因的突变情况. 结果 在108例肺癌样本中,一代测序检出突变在二代测序中均检出,另外NGS还检测出目标区域外其他突变. 结论 NGS的检测准确性可达到100％.NGS可以应用于肺癌临床分子诊断,同时NGS能给临床提供更详细的基因突变信息,为分子靶向治疗提供依据,更具有市场潜力及应用前景.
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下一代测序技术在遗传相关性智力障碍诊断中的应用
智力障碍(intellectual disability,ID),是一种严重危害儿童身心健康的综合症,不但影响患者自身的生活质量,也给其家庭和社会带来沉重负担.ID病因十分复杂,既有外在的环境因素又有内在的遗传因素.近年来,下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)从一种新兴技术变成了主流检测技术被逐渐应用于临床诊断,其通量高、快速、高效等优势为遗传性疾病的诊断研究带来重大变革.本文将从智力障碍概述、病因分析、遗传性检测技术以及NGS在遗传性智力障碍诊断中的应用4个方面进行综述,以期为相关性智力障碍病人的临床诊断方法的选择提供帮助.
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二代测序探究晚期肺癌患者RICTOR扩增和PI3K基因改变
1 文献来源研究一:Cheng H,Zou Y,Ross JS, et al.RICTOR amplification defines a novel subset ofpatients with lung cancer who may benefit from treatment with mTORCl/2 inhibitors [J].Cancer Discov, 2015, 5(12) : 1262-1270.研究二 : Paik PK, Shen R, Won H, et al.Nextgeneration sequencing of stage Ⅳ squamous cell lung cancers reveals an association of PI3K aberrations and evidence of clonal heterogeneity in patients with brain metastases [J].Cancer Discov, 2015, 5 (6) : 610-621.
