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HBV核酸与HBV血清标志物的关系研究
[目的]探讨乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)与HBV血清标志物的关系.[方法]将血清样本用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测HBV-DNA和乙型肝炎病毒标志物.[结果]A组(HBsAg和HBeAg两项阳性)、B组(大三阳)、C组(HBsAg、HBcAb两项阳性)和D组(小三阳)的HBV-DNA阳性率分别为97.06%、88.24%、57.14%和43.33%,HBV-DNA量的对数均值分别为6.0267、5.5667、4.9639、5.1520、5.4574,各组间HBV-DNA阳性率和HBV-DNA量均存在显著性差异(P＜0.05);178份HBV-DNA阳性标本中HBsAg 100.00%阳性;HBsAg阳性、HBeAg阳性和HBsAg阳性,HBeAg阴性组中HBV-DNA阳性率分别为89.34%和44.52%,存在显著性差异(P＜0.05).[结论]HBsAg和HBeAg两个阳性组病毒复制活跃,HBV-DNA阳性率和HBV-DNA量显著高于其它组别;HBeAg与HBV-DNA密切相关,但不能完全反映HBV在体内的复制情况,将FQ-PCR定量检测作为血清学方法的补充具有重要的临床意义.
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霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR检测方法的建立
目的 建立霍乱弧菌和拟态弧菌的实时荧光PCR快速检测方法.方法 根据霍乱弧菌外膜蛋白W基因(out membrane protein W,omp W)和拟态弧菌溶血素基因(Vibrio mimicus hemolysin gene,vmh的保守序列设计引物和TaqMan探针,建立快速检测并区分霍乱弧菌和拟态弧菌的双重荧光PCR方法,并对所建立的方法进行灵敏度和特异度评价.结果 建立了霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR快速检测方法.优化的反应体系中,ompW引物和探针的浓度分别为100 nmol/L和200 nmolL;vmh引物和探针的浓度均为100 nmol/L.对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为100.9％和99.7％.灵敏度和特异度均为100.0％.结论 基于TaqMan探针的ompW和vmh双重荧光PCR检测方法,具有好的灵敏度和特异度.并且能够在一个反应体系中同时检测两种毒力基因,为繁琐费时的传统检测方法提供了一种快速可靠的替代选择.
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梅毒螺旋体荧光定量PCR检测方法的建立
目的 建立梅毒螺旋体的荧光定量PCR检测方法.方法 依据梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)DNA多聚酶Ⅰ(polA)基因序列,设计MGB-Taqman探针和PCR引物,对TPPA法检测到的不同国家和人种梅毒螺旋体抗体阳性患者和阴性人员血液样本进行检测,验证该PCR方法的灵敏度和特异性,以及2种检测方法的一致性.结果 PCR产物测序证实新建的荧光PCR方法可以扩增到梅毒螺旋体polA基因区200 bp长DNA片段.该方法特异性强、灵敏度高,可检出每微升血液中10拷贝梅毒DNA.在31例TPPA法检测结果为阳性的样本中,有21例为PCR阳性.证明其中10例TPPA法阳性为非现行感染,可能不具有传染性.统计分析表明该荧光PCR方法与TPPA方法对不同国家和种族人群检测结果未出现显著差异.结论 新建的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可排除TPPA法阳性梅毒患者中非现行感染的旅行者,是适用于不同地区和种族的旅行者进行梅毒检测的新方法.
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广东国境口岸五种蚊种核糖体基因第2内转录间隔区分子鉴定方法研究
[目的]建立国境口岸不同蚊种的核糖体基因第2内转录间隔区(rDNA-ITS2)分子鉴定方法及其系统进化关系.[方法]针对蚊虫的rDNA核酸序列保守性,设计扩增rDNA-ITS2编码区的PCR引物,对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定,并与CenBank中已知蚊虫的rDNA-ITS2进行同源性比较和系统进化分析.[结果]不同蚊虫的rDNA-ITS2扩增片断长度不同,M2引物对致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊的扩增片断分别为447bp～520bp、432bp～438bp、527bp～586bp、439bp～448bp和644bp.序列分析和系统进化关系显示,尖音库蚊组和三带喙库蚊聚类为库蚊属,再与白纹伊蚊和骚扰阿蚊聚类为库蚊亚科,库蚊亚科再与中华按蚊进行聚类,分子进化与蚊虫形态学鉴定的亲缘关系保持一致.[结论]建立的rDNA-ITS2分子鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的亚科、属和种的区分和确定系统发育关系.这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点,对国境口岸范围外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据.
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黑瞎子岛地区蜱及其携带病原体调查研究
目的 调查中俄边境黑瞎子岛地区蜱种构成及其携带病原体状况.方法 于2013年5月间在黑瞎子岛地区采用人工小时布旗法拖蜱,种类鉴定后进行11种病原体检测.森林脑炎、新布尼亚病毒和克里米亚-刚果出血热采用RT-PCR方法检测;立克次体、贝氏柯克斯体、伯氏疏螺旋体、土拉杆菌、巴尔通体、埃立克体、无形体和巴贝西原虫均采用PCR方法检测.对阳性扩增产物测序,并利用MEGA 5.0软件与GenBank中国内外已知菌株基因序列进行比对和系统发育分析.结果 共拖蜱165只,经鉴定隶属于1科3属4种,即硬蜱科(Ixodidae),硬蜱属(Ixodes),全沟硬蜱(I.persulcatus),革蜱属(De rmace ntor),森林革蜱(D.silvarum),血蜱属(Haema physalis),嗜群血蜱(H.concinna)和日本血蜱(H.japonica),分别占总体构成24.85％、12.12％、23.03％和40.00％.伯氏疏螺旋体、土拉杆菌、巴尔通体、无形体、埃立克体、森林脑炎黄病毒属、克里米亚-刚果出血热和新布尼亚病毒阳性检出率均为0;立克次体阳性检出率为15.76％(26/165),贝氏柯克斯体阳性检出率为0.6％(1/165),巴贝西原虫阳性检出率为0.6％(1/165).其中有1例全沟硬蜱检测出巴贝西原虫和立克次体复合感染.经统计学分析得出蜱种与立克次体的感染有统计学意义(x2=84.1391,P＜ 0.05),以森林革蜱的感染率高.经MEGA 5.0软件进行系统发育分析,得知立克次体以斑点热群劳式立克次体为主.结论 此次调查证明黑瞎子岛地区蜱种以日本血蜱为主,森林革蜱感染立克次体概率高,全沟硬蜱存在复合感染现象,因此应着重加强黑瞎子岛地区蜱种监测与防控.
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PCR技术在致病菌检测中的应用
[目的]聚合酶链反应(PCR)技术以其具有的特异性强,灵敏度高,快速准确,自动化高的特点,被广泛的应用于医学、生命科学、农业科学、环境科学、考古学等领域.PCR技术的发展为食品病原微生物的鉴定提供了新的途径;对传染性病原菌的诊断提供了快速、灵敏的检测手段.为此,对国内应用PCR技术检测致病菌的研究成果作一综述,供同行借鉴.
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竞争性核酸定量检测技术研究进展
在医学基础研究和临床应用的诸多领域中,由单纯PCR技术提供的定性结果存在着较多的局限性,对核酸进行基因及其表达等的定量检测是分子生物学发展的一大方向.因此,在对目前常用的定量方法进行简述的基础上,对其中应用为广泛的竞争性核酸定量检测技术的原理、方法、优缺点等的研究进展进行了综述.
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基因扩增产物微孔杂交法检测新城疫致病毒株
[目的]建立一种快速、简便、敏感、实用的方法以鉴别新城疫病毒(NDV)强弱毒株.[方法]依据NDV强弱毒株F0蛋白在裂解位点处的核酸序列有差异,设计一种针对强毒株的探针,利用基因扩增物微孔杂交法,检测标本中NDV致病毒株.[结果]缩短杂交时间,加快反应速度,能从强、中、弱毒株中扩增出371bp的核酸产物.利用酶显色法杂交结果,比电泳法观察PCR结果高4倍.[结论]本方法经优化PCR参数后,可作为新城疫的诊断方法,又可作为出入境检疫的常规方法.
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多重聚合酶链反应方法在结核杆菌检测中的应用
[目的]建立结核病诊断及快速检测方法.[方法]将结核杆菌标准菌株、临床病例标本、对照标本采用多重PCR体系进行检测,以研究多重PCR方法对上述菌株检测的敏感性和特异性.[结果]多重PCR体系检测结核杆菌DNA的灵敏性低为30-210个结核杆菌,对结核病病例和对照标本检测的灵敏度为94.6%,特异度为100%.[结论]多重PCR技术用于结核分支杆菌的鉴定简便、快速、特异,适于在卫生检疫系统和临床实验室应用.
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天津市汉族胎儿D21S1411和D21S1413STR基因座遗传多态性的研究
目的:调查天津市汉族胎儿21号染色体上D21S1411和D21S1413短串联重复序列(STR)的遗传多态性,获取群体遗传学数据,为其应用于产前诊断提供依据.方法:选取211例产前诊断样本,提取DNA,复合扩增D21S1411和D21S1413 STR基因座,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,分析扩增产物.用PowerState V12软件分析群体遗传学指标.结果:D21S1411 STR基因座共发现9种等位基因,45种基因型.D21S1413 STR基因座共发现7种等位基因,28种基因型.D21S1411基因座的观察杂合度(Ho)、多态信息含量(PIC)、个体识别率(DP)和非父排除率(PE)分别为75.4%、0.85%、0.967%、0.516%.D21S1413基因座的Ho、PIC、DP、PE分别为87.2%、0.82%、0.947%、0.739%.D21S1411和D21S1413 2个STR基因座累计PIC为0.973,累计DP为0.998,累计PE为0.874.结论:D21S1411和D21S1413 STR基因座均符合Hardy-Weinberg平衡定律,在天津市汉族胎儿群体中具有较高的杂合度和多态信息含量,可用于唐氏综合征的基因诊断和产前基因诊断.
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女性生殖道沙眼衣原体感染与输卵管性不孕的临床分析
目的:探讨女性生殖道沙眼衣原体感染与输卵管性不孕的关系.方法:从86例输卵管性不孕妇女(观察组)的宫颈及输卵管内取样,用聚合酶链反应(PCR)检测沙眼衣原体,并从50例正常妊娠妇女(对照组)的宫颈及输卵管提取样本作为对照.结果:宫颈沙眼衣原体感染率在两组间无明显差异,但观察组输卵管沙眼衣原体感染率为20.93%,明显高于对照组(4.00%),两组比较有显著性差异(P＜0.05),输卵管不同病变间的沙眼衣原体阳性率无明显差异.结论:输卵管性不孕妇女的输卵管沙眼衣原体感染率高,生殖道沙眼衣原体感染是输卵管性不孕的重要因素.
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七厂家抗-HCV试剂盒的比较研究
目的观察国产丙型肝炎(HC)酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断试剂假阳性产生的原因.方法:用ELISA方法把七家国产第三代抗-HCV试剂已经判为阳性的标本,分别留取60份,并以进口试剂复检,再进一步用聚合酶链反应方法(PCR)确证.结果:国产抗-HCV试剂的假阳性率个别厂家达46.7%.结论:国产抗-HCV试剂假阳性率高,特异性有待于提高.
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胸水征患者感染人类微小病毒B19的检测分析
目的:了解胸水征患者感染人类微小病素B19(B19V)的情况.方法:由恶性胸水组、结核性胸水组、漏出液胸水组患者和相应的无胸水征患者为研究对象,以胸水和血液为检测标本,应用聚合酶链反应(PCR)技术检测B19V.结果:胸水标本B19V的阳性结果呈恶性组(5)＞漏出组(4)＞结核组(3)的分布情况,血液标本B19V的阳性结果呈漏出组(4)＞恶性组(5)和结核组(3)的分布情况.而相应的无胸水征患者的血液标本无B19V阳性发现.结论:胸水征患者均有一定的B19V感染情况,B19V感染可能是加重胸水征的重要因素.
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PCR和ELISA技术早期诊断急性呼吸道感染病原体的评估
目的:通过分析聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测急性呼吸道感染(ARI)病原体的结果,评价PCR和ELISA方法在ARI病原学早期诊断方面的实用价值.方法:ARI病人122例为实验组、健康人48例为对照组,共同组成研究对象.采集鼻咽部分泌物和静脉血液为实验标本.用PCR技术对鼻咽分泌物检测腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎衣原体(CP)和肺炎支原体(MP),用ELISA方法对静脉血液检测ADV-IgM、CP- IgM、MP- IgM.结果:ARI组的阳性结果分别为ADV-DNA 9.8% (12/122)和ADV-IgM 4.9%(6/122)、RSV-RNA 26.2%(32/122)、CP-DNA 33.6%(41/122)和CP-IgM 13.9%(17/122)、MP-DNA10.6%(13/122)和MP-IgM 6.6%(8/122).对照组也有一定的阳性检测结果.ARI组与对照组检测结果的差别具有显著性(X2 test, p<0.05-0.001).结论:PCR技术是一种实用的ARI临床病原学早期诊断方法,而ELISA方法对ARI病原学早期诊断不敏感,CP、RSV、ADV、MP等是导致ARI重要的病原体.
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不同人群解脲支原体和人型支原体感染状况的分子流行病学研究
目的:了解人型支原体(MH)、解脲支原体(UU)在5种性病患者、健康人群、性伴中的感染情况和分布特点,以及与其他微生物感染的相互关系.方法:用聚合酶链反应(PCR)检测STD门诊的1143例、健康人群465例、性伴134例的尿道(宫颈)分泌物的UU、MH感染.结果:STD患者中UU感染大大高于MH感染,除梅毒患者外的STD患者、性伴人群无论男女UU、MH感染率与健康人群比较有显著差异.NGU组、总STD患者、健康人群的UU、MH阳性率女性高于男性.健康人群女性与性伴人群女性UU、MH阳性率相比均无显著差异.结论:性病患者中支原体感染率增高,不同病种的STD感染支原体的频率相同,临床更应加强女性UU、MH的检测.
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不同人群解脲支原体和人型支原体感染状况的分子流行病学研究
目的:了解人型支原体(MH)、解脲支原体(UU)在5种性病患者、健康人群、性伴中的感染情况和分布特点,以及与其他微生物感染的相互关系.方法:用聚合酶链反应(PCR)检测STD门诊的1143例、健康人群465例、性伴134例的尿道(宫颈)分泌物的UU、MH感染.结果:STD患者中UU感染大大高于MH感染,除梅毒患者外的STD患者、性伴人群无论男女UU、MH感染率与健康人群比较有显著差异.NGU组、总STD患者、健康人群的UU、MH阳性率女性高于男性.健康人群女性与性伴人群女性UU、MH阳性率相比均无显著差异.结论:性病患者中支原体感染率增高,不同病种的STD感染支原体的频率相同,临床更应加强女性UU、MH的检测.
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聚合酶链反应检测A组链球菌的实验研究
目的:探讨并建立聚合酶链反应(PCR)用于检测A组链球菌(GAS)的方法.方法:用PCR方法扩增GAS特异的致热性外毒素B(speB)基因片段,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;分析其特异性和敏感性.结果:在GAS参考菌株均扩增出345bp的特异性片段,而其它需鉴别诊断的常见病原菌均未扩增出此特异条带.检测灵敏度为6.5pg GAS基因组DNA.结论:依据speB基因建立的GAS PCR检测方法具有高度的敏感性和特异性,是诊断与鉴别诊断GAS感染的一种有效手段.
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PCR扩增检测增生、癌变细胞中金葡菌L型DNA的意义
目的:探讨金黄色葡萄球菌(金葡菌)L型感染对C57小鼠肿瘤组织和体外培养的猴肾细胞的增生作用.方法:用金葡菌L型感染C57小鼠及猴肾细胞,再用革兰氏染色、免疫组化染色和聚合酶链反应(PCR)检测C57小鼠肝细胞及诱发的小鼠肿瘤细胞中金葡菌L型阳性率,并观察感染后猴肾细胞的病理形态学变化.结果:C57小鼠肝组织及肿瘤组织中金葡菌L型感染率分别为0%(0/10)和70%(7/10),L型抗原表达率分别为0%(0/10)和70%(7/10);金葡菌L型DNA阳性表达率分别为30%(3/10例)和70%(7/10例).感染L型原生小体后体外培养细胞部份出现空泡样变性(类似病毒感染后的形态学变化),局部区域细胞密集(轻度增生).结论:金葡菌L型DNA己在感染的体内、外细胞内出现,且在诱发的肿瘤细胞内表达显著增高,推测其在诱发体细胞增生和癌变中起重要作用,很可能和病毒的致瘤机理相似.
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快速尿素酶法与PCR对幽门螺杆菌检测的评价
目的:探讨幽门螺杆菌(Hp)菌株中cagA和vacA基因对慢性萎缩性胃炎的致病作用及其检测的意义.方法:胃镜下诊断慢性胃炎的病例,钳取活组织标本,组织学检查;快速尿素酶法和PCR检测.结果:30例标本经组织学检查慢性萎缩性胃炎19例,慢性浅表性胃炎11例.经快速尿素酶法检测,慢性萎缩性胃炎中,8例Hp(+),11例Hp(-);慢性浅表性胃炎中,1例Hp(+),10例Hp(-).经PCR检测,慢性萎缩性胃炎中,15例cagA(+),4例cagA(-),9例vacA(+),10例vacA(-);慢性浅表性胃炎中,2例cagA(+),9例cagA(-),1例vacA(+),10例vacA(-).结论:Hp是慢性萎缩性胃炎的重要致病因素,Ⅰ型菌株致病力更强.PCR检测较快速尿素酶法准确.检测cagA和vacA基因对了解Hp菌株的致病性、估计疾病程度、了解病变预后及临床治疗都具有重要意义.
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荧光定量PCR、ELISA和快速培养法在小儿MP感染动态诊断中的应用价值研究
目的:评估荧光定量PCR (FQ-PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和肺原支原体(MP)快速培养法在小儿MP感染动态诊断中的临床应用价值.方法:纳入2016年3月-2017年3月宁海县第一医院儿科门诊就诊后住院,经临床及实验室诊断MP感染的患儿90例,同时应用FQ-PCR、ELISA、和快速培养法对患儿入院首诊、出院、随访第1、3个月时MP进行检测.结果:患儿就诊时FQ-PCR检测MP DNA阳性率95.56％(86例);ELISA检测MP-IgM抗体阳性率68.89％(62例),MP快速培养法阳性率24.44％(22例).首诊时三种检测法MP阳性率在各年龄段比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);ELISA在首诊病程＞1周者MP阳性检出率高于≤1周者(P＜0.05).1个月随访时,MP DNA阳性率62.22％(56例),MP-IgM抗体阳性率95.56％(86例),快速培养法阳性率21.11％(19例);有27例患儿仍存在咳嗽,其中22例MP-DNA阳性,24例MP-IgM抗体阳性.3个月随访时,MP DNA阳性率13.33％(12例),MP-IgM抗体阳性率80.00％(72例),快速培养法阳性率3.33％(3例);上述27例患儿中,仍有7例存在咳嗽,其中4例MP-DNA阳性,5例MP-IgM抗体阳性.结论:在三种诊断MP感染的方法中,FQ-PCR敏感,其次为ELISA,MP快速培养法低.随访1月时,仍有近1/2以上患儿MP DNA阳性,与咳嗽症状密切相关;MP-IgM抗体阳性率自出院至随访3月时多保持高水平.
