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多种一步法快速提取DNA对肺炎支原体PCR检测的影响
目的 对比不同一步法提取DNA在肺炎支原体PCR检测中的效果及应用范围,为临床标本中肺炎支原体的检测提供依据.方法 以两种经典的DNA提取一步法(ROSE和Chelex-100法)及其优化方案和商品化DNA提取试剂盒,提取肺炎支原体纯培养菌株及30份肺炎支原体阳性临床咽拭子标本DNA,分别进行普通PCR和荧光PCR检测,对比不同方法提取的DNA对PCR检测结果的影响.结果 ROSE法和Chelex-100一步法中的SDS严重影响Taq酶活性,提取物稀释100倍方可进行荧光PCR扩增,稀释10倍可用于普通PCR扩增.改良的Chelex-100一步法提取肺炎支原体纯菌DNA产量高,且PCR扩增效果好.对于30份临床标本来说,试剂盒法、改良Chelex-100法和水煮法的阳性率分别为100.00％(30/30)、80.00％ (24/30)和43.33％(13/30),且对相同肺炎支原体阳性标本提取的DNA,试剂盒法检测的循环阈值(Ct值)比上述两种方法分别小1.95和2.38.结论 经典一步法提取的DNA必须经稀释后方可作为扩增模板.改良的C helex-100法操作简便,可用于纯菌培养的DNA提取.临床标本中肺炎支原体DNA提取以试剂盒法优,改良的Chelex-100法提取的DNA也可用于临床标本中肺炎支原体的检测,但不可用于定量分析.
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福氏志贺菌Xv血清型聚合酶链反应鉴定方法的建立及应用
目的 建立福氏志贺菌Xv血清型聚合酶链反应(PCR)鉴定方法.方法 根据福氏志贺菌Xv血清型O抗结构,针对O抗合成基因wzx、7;8群抗原决定基因gtrX和MASF Ⅳ-1抗原决定基因opt,建立PCR扩增鉴定方法.并应用该方法对139株福氏志贺菌临床分离株进行血清型检测.结果 建立一种福氏志贺菌Xv血清型PCR鉴定方法,该体系在一个反应中包括3对引物,Xv血清型PCR扩增全部为阳性,可将Xv血清型与目前已知的其他18种福氏志贺菌血清型完全区分.非福氏志贺菌菌属及腹泻相关菌属菌株检测结果发现无任何PCR扩增产物.对139株不同血清型福氏志贺菌临床分离株的鉴定结果显示,该方法可将Xv血清型鉴定,与血清凝集结果一致.结论 本研究建立的福氏志贺菌Xv血清型PCR鉴定方法具有快速、特异的优点,可以用于检测和监测.
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金黄色葡萄球菌毒力基因检测及Spa分型研究
目的 研究深圳市南山区2009-2015年医院内患者临床检测标本、医院台面与医护人员双手涂抹样以及食物中毒样本中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)蛋白A基因多态性分型(single locus DNA-sequencing of the repeat region of the Staphylococcus protein A gene,Spa)的特征及毒力基因分布情况.方法 采用多重PCR方法检测SA的mecA与femA基因,PCR方法检测24个毒力基因以及SA蛋白A基因,PCR产物测序后序列上传数据库进行比对.结果 87株SA共检出48株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus,MRSA),检出率为55.2％.共检出21种毒力基因,检出率＞60％的毒力基因有LUKDE(65.5％)、SHE(67.8％)、mpHLG2 (85.1％)、HLD(93.1％)和HLA(100.0％).94.3％菌株携带5个以上毒力基因.三类样本中有11种毒力基因检出率差异有统计学意义,分别是SEB、rnpSEC、mpSEJ、mpSEO、TST、HLB、HLD、mpHLG1、mpHLG2,mpETB和PVL.其中mpETB与PVL仅在患者中检出,肠毒素基因在食物中毒株中携带率较高.MRSA与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitiveS.aureus,MSSA)的3种毒力基因检出率差异有统计学意义,分别是mpETA、PVL及mpHLG2;MRSA的毒力基因mpETA与PVL检出率明显高于MSSA(P=0.033,P=0.030),而mpHLG2检出率明显低于MSSA(P =0.021).87株SA分为24种Spa型,患者优势型别为t030(30.0％)与t437 (36.7％),医院其他样本优势型别为t091 (50.0％),食物中毒优势型别为t127 (36.8％)与t091 (21.1％).结论 三类样本部分毒力基因检出差异有统计学意义.MRSA与MSSA携带毒力基因差异无统计学意义.三类样本中均存在优势的Spa型别.
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2913例妇女生殖道人乳头瘤病毒感染筛查分析
目的 了解浙江省台州地区妇女感染人乳头瘤病毒(HPV)和年龄分布,以及各亚型与官颈病变的关系.方法 采用聚合酶链反应扩增结合DNA芯片反向点杂交技术,对来浙江省台州市中心医院妇科就诊的2913例患者进行生殖道HPV亚型检测.结果 HPV总感染率35.08%,检出前5位依次为HPV16(占7.76%)、HPV11(占7.38%)、HPV52(占6.25%)、HPV33(占4.81%)、HPV58(占4.50%).结论 台州地区妇女生殖道HPV人群感染年龄主要分布在40岁以下,以高危型为主,与官颈病变的发生密切相关.
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中国部分食品来源单增李斯特菌中致病相关基因的分布研究
目的 了解中国食品来源部分单增李斯特菌(Listeria monocytogences,LM)中致病相关基因的分布情况.方法 383株LM分离自2002-2011年中国14省(市)的生肉、熟食、蔬菜、冷饮、水产等食品.采用PCR(polymerase chain reaction)和DNA打点杂交方法在单增李斯特菌中进行了55个致病相关基因的检测.结果 50个致病相关基因检出率均为100％,inlF、fbpA和mprF基因检出率为99.73％,aut基因检出率为99.22％(380/383),vip基因检出率为98.17％(376/383).结论 383株食品来源单增李斯特菌中,大部分致病相关基因均存在,部分毒力基因的缺失存在多样性.
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广东省1例流行性脑脊髓膜炎死亡病例流行病学调查
2017年11月广东省汕头市报告1例疑似流行性脑脊髓膜炎死亡病例.患者表现为发热、呕吐,经抢救无效死亡.从病例脑脊液标本中检出b型流感嗜血杆菌(Hib),未检出脑膜炎奈瑟菌.确认该病例因感染Hib而死亡.
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我国蒙古族与汉族维生素D受体基因多态性分布的研究
目的为研究我国汉族与蒙古族维生素D受体(VDR)基因多态性分布与骨质疏松的关系.方法采用聚合酶链反应(PCR)限制性片段长度多态性技术,对179例健康汉族人及105例蒙古族健康人进行VDR基因检测.结果中国蒙古族105例,bb型54例(51.42%),Bb型45例(42.85%),BB型6例(5.71%);汉族179例,bb型162例(90.50%),Bb型17例(9.50%),未见BB型.结论中国蒙古族VDR基因多态性分布与中国汉族相比差异有显著性意义(P＜0.005).
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人巨细胞病毒感染与急性脑卒中的相关性研究
近年来,人巨细胞病毒(human cytomegalovir-us,HCMV)感染与包括脑卒中等在内的多种动脉粥样硬化性疾病的关系引起了关注。Yi 等[1]用免疫组织化学、原位杂交、聚合酶链反应(PCR)等3种方法对35例缺血性脑卒中患者和20例对照组患者颈内动脉的 HCMV-DNA 和抗原进行检测,发现脑卒中组患者的 HCMV 即刻早期基因/蛋白明显高于对照组。尽管大部分研究认为 HCMV 感染与脑卒中危险性相关,但也有少数流行病学研究得出了相反的结果[2,3]。另外,以往更多研究检测HCMV 方式是 HCMV 抗体检测,不能反映潜在的HCMV 感染情况。本研究拟采用荧光定量 PCR法检测 HCMV,探讨 HCMV 与脑卒中的关系。
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阿奇霉素治疗小儿肺炎支原体肺炎疗效观察
随着肺炎病原学的变迁,肺炎支原体(MP)已成为小儿肺炎的重要病原.现将本院2001年5月至2002年12月应用阿奇霉素治疗小儿肺炎支原体肺炎74例,并与红霉素治疗的74例进行比较,现报道如下.1 资料与方法1.1 一般资料:148例均为住院患儿,并确诊为小儿重症支原体肺炎,符合<儿科学>制定小儿重症肺炎的诊断标准[1].所有病例查血肺炎支原体抗体(MP-IgM)≥1∶80和咽拭子分泌物聚合酶链反应(PCR)测MP-DNA阳性.148例患儿随机分为两组,治疗组74例,男46例,女28例,年龄6个月～14岁,平均3.2岁;对照组74例,男45例,女29例,年龄7个月～15岁,平均3.4岁.两组病例在年龄、性别、疾病诊断方法差异无显著性(P＞0.05).
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小儿支原体肺炎肺外表现131例临床分析
以肺外表现为首发症状,甚至引起多脏器损害的支原体肺炎,常常引起临床医生的误诊误治,延误病情造成不良后果.本文分析了2004年12月至2006年8月收治的131例支原体肺炎的肺外表现,现总结如下.1资料与方法1.1一般资料131例患儿中男性69例,女性62例;＜1岁6例,1～3岁10例,3～5岁35例,5～16岁80例.所有患儿均符合肺炎支原体(MP)肺炎诊断标准[1],病原检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,MP-IgM≥1∶80,所有患儿进行MP-聚合酶链反应(PCR)检测均为阳性,肺外表现的出现时间在1～15 d.
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喉癌中CD44V表达的研究
CD44是近年来研究较多的与肿瘤转移密切相关的黏着分子之一,许多研究发现CD44变异型(CD44V)在非霍奇金淋巴瘤、结肠癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤表达明显升高,且与肿瘤的转移与浸润密切相关.本研究采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)研究CD44V在喉癌组织及声带息肉的表达情况.
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SHP-1基因表达检测在慢性粒细胞白血病中的意义
目的:观察SHP-1在不同期慢性粒细胞白血病(CML)中表达水平,探讨其与白血病发生、发展之间的关系.方法:选取CML及非恶性血液病患者41例,检测SHP-1蛋白及mRNA表达情况,比较各组差异.结果:各组SHP-1蛋白和mRNA表达比较:对照组高于CML组,CML-CP组高于CML-AP组.结论:SHP-1可能与CML的发生和进展有关.
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定量聚合酶链反应法对不育患者精子中DAZ基因缺失的诊断
目的:建立测定人精子DAZ基因相对含量的定量聚合酶链反应(PCR)法并应用于检测不育男性精子中DAZ基因的相对含量,以分析其病因.方法:应用定量聚合酶链反应(PCR)法测定了90例精子发生正常男性和50例少、弱、畸精子患者精子中DAZ基因的相对含量.结果:以ZFX/ZFY基因为外部参照,精子发生正常男性精子中DAZ基因的相对含量正常值为1.47±0.293.重复性试验结果表明定量PCR法批内、批间变异系数分别为5.8 %～6.5%、9.5%～10.8%.对不育男性的检测结果发现其中1例少精子症患者DAZ基因相对含量为0.5,明显低于正常值下限,其他不育患者未见明显异常.结论:定量PCR法测定人精子中DAZ基因的相对含量是一种切实可行的检测方法,部分精子中DAZ基因的缺失可能为男性不育的病因.
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继发不育男性泌尿生殖道解脲支原体基因分型鉴定及其临床应用研究
目的 了解继发不育男性患者泌尿生殖系解脲支原体(UU)的感染状况,探讨UU各基因型与临床病原学之间的关系.方法 根据UU多带抗原基因(MBA)与16S-rRNA基因和尿素酶基因结构设计10对引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术,对继发不育男性患者572例泌尿生殖系感染的UU进行生物变种和基因型分型鉴定,并与培养结果比较.结果 UU培养阳性278例,阳性率48.6%;PCR基因扩增检测UU-DNA阳性311例,阳性率54.4%.其中生物变种1(biovar 1)212例,占37.1%;生物变种2(biovar 2)99例,占17.3%;基因分型结果:生物变种1血清变种1 71例,占12.4%;血清变种3/14 98例,占17.2%;血清变种6 43例,占7.5%.生物变种2亚型1(subtype 1)32例,占5.6%;生物变种2亚型2(subtype 2)51例,占8.9%;生物变种2亚型3(subtype 3)16例,占2.8%.结论 UU感染是男性继发不育的主要危险因素,多带抗原基因与16S-rRNA基因和尿素酶基因分型鉴定具有简便、快速、敏感、特异之优点.
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子宫内膜细胞色素P450芳香化酶的表达研究进展
细胞色素P450芳香化酶(aromatase cytochrome P450, P450 arom)能催化C19雄激素转化为雌激素，是雌激素合成的关键酶之一。P450 arom位于细胞内质网，在体内多种雌激素合成部位表达，如卵巢颗粒细胞、脂肪组织、胎盘合体滋养层细胞、脑细胞等。近年的研究发现P450 arom在子宫内膜上也有表达，能促进子宫内膜局部雌激素的转化，现对其在子宫内膜的研究进展综述如下。细胞色素P450芳香化酶的结构特征 P450 arom与其它细胞色素P450异构体的结构类似。C端为血红素结合区，该区含有保守的半胱氨酸残基，可作为含铁血红素的第5个配位配基。该区上游有2个保守区，一个由20个以上氨基酸构成，一个为高度保守的部分I螺旋。N端由疏水氨基酸组成，但在有些情况下，连接N端的是糖基序列［1］。 P450 arom是CYP 19基因的产物，是细胞色素P450产物中唯一由单基因编码的酶。CYP 19是细胞色素P450基因超家族成员之一。随着分子生物学技术的发展，对CYP 19基因的结构及调节有了较深入的了解。人CYP 19基因位于染色体15 q 21.1，该基因的开放阅读框包含9个外显子，II～X，其中翻译起始位点位于外显子II。基因至少长75 kb，在第一个编码外显子II上游有4个未翻译外显子，I.1～4，在后一个编码外显子X上有血红素结合区(heme-binding region,HBR),同时，该外显子还有两个选择性多聚腺苷酸位点，可产生两种长度不等的转录产物，分别为3.4和2.9 kb(图1)。 CYP 19基因的主要特点是其具有组织特异性表达。用聚合酶链反应(PCR)和快速扩增互补DNA末端(rapid amplification cDNA end,RACE)检测发现，CYP 19基因在不同组织的转录产物5’末端不相同［3-4］。在胎盘组织，转录产物5’末端主要为未翻译外显子I.1，I.2<1%；在卵巢，5’末端为外显子II；而在脂肪细胞，不同条件下，有3种不同的5’末端，I.4、I.3和II。这种组织特异性在于该基因的组织特异性启动子调节。在胎盘，转录运用远端启动子I.1；在卵巢为近端启动子II；脂肪组织为启动子I.4、I.3及II。CYP 19基因这种运用选择性启动子调节组织特异性表达的特点，对人体不同部位雌激素的合成调节具有重要意义。
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小鼠卵子发生过程中核糖体RNA基因扩增的测定
目的了解小鼠卵母细胞成熟过程中是否有核糖体RNA基因(rDNAs)的扩增. 方法选用4～5周龄小鼠,分离卵母细胞,提取基因组DNA,以小鼠rDNA启动子区及编码区的两个序列为研究指标,采用引物5'末端[32P]标记的聚合酶链反应(PCR)方法,比较小鼠卵母细胞和体细胞的rDNA拷贝数.采用转录连续测定法对rDNAs的转录进行动态观察.结果在小鼠生长卵母细胞中未检测到rDNA的扩增.结论在小鼠早期卵母细胞的大量蛋白质合成中,不是通过扩增rDNA,而是依赖于其他的调节因子来促进rRNA的合成以满足需求.
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雌激素对去势大鼠下丘脑5-羟色胺2C及5-羟色胺6受体亚型mRNAs的影响
目的观察雌激素对大鼠下丘脑5-羟色胺2C(5-HT2C)及5-羟色胺6(5-HT6)受体亚型mRNAs的影响. 方法实验动物分为对照组(C组)、去势后又分为注射雌二醇组(E+组)和不注射雌二醇组(E-组),后两组分别在处理后3、6、9、12 d时提取下丘脑标本.实验采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR). 结果 5-HT2C受体亚型在E+组下丘脑的表达分别为C组(100%)的(130.6±3.1)%、(131.0±3.1)%、(116.7±3.2)%、(114.7±2.6)%,前两者与C组比较有显著差异(P<0.05);5-HT2C受体亚型在E-组的表达分别为C组的(129.8±3.2)%、(174.0±6.1)%、(185.3±5.9)%、(137.9±4.0)%,均与C组存在显著差异(分别为P<0.05、P<0.01、P<0.01、P<0.05); E+组与E-组在去势后6、9和12 d时差异显著(P<0.01).5-HT6受体亚型在E+组下丘脑的表达分别为C组的(101.2±3.6)%、(112.6±4.2)%、(115.9±3.7)%、(117.4±4.1)%,与C组比较无显著差异(P>0.05);5-HT6受体亚型在E-组的表达分别为C组的(105.8±4.1)%、(115.2±4.4)%、(118.7±5.4)%、(114.7±3.2)%,与C组比较无显著差异(P>0.05);5-HT6受体亚型在E+组与E-组的表达也未发现显著差异. 结论雌激素可能参与了去势大鼠下丘脑5-HT2C受体亚型的调节.
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单个胚胎、精子或细胞的保存与寄送
鉴于当今仅一个细胞即可进行聚合酶链反应(PCR)分析研究[1-4];动物或少精症患者也可通过单个精子或生精细胞用于胞质内精子注射(ICSI)获得妊娠和胎儿出生[5.6];将小鼠的精子保存在70%的乙醇中1 d[7]或将小鼠的精子经冷冻处理后再进行ICSI也可完成受精并获得后代[8-9].因此,在某些情况下贮存或发送单个胚胎、精子或细胞供进一步的研究、分析及治疗是必要的.为此,我们采用拉长的细玻璃毛细管进行了胚胎、部分分割的半透明带、单个及数个精子和体细胞贮存在玻璃毛细管中邮寄到千里之外的实验.
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不同避孕措施使用者生殖道人乳头瘤病毒感染检测
目的 了解不同避孕措施长期使用者生殖道人乳头状瘤病毒(HPV)感染的情况.方法 采用聚合酶链反应(PER)检测服用口服避孕药或使用宫内节育器5年以上的妇女226人宫颈分泌物中HPV DNA,研究对象按避孕措施分成1号片组、复方18.甲组和宫内节育器组.结果 三组研究对象的HPV总检出率为14.2%,HPV的检出率复方18-甲组高,宫内节育器组低,分别为复方18-甲组20.45%、1号片组11.11%、宫内节育器组8.77%,三组间的差异无统计学意义(P>0.05).三组中HPV感染者的宫颈均有异常表现,但差异无统计学意义(P>0.05).结论 对有性生活,特别是长期使用避孕措施的妇女提供常规的宫颈涂片检查和HPV检测服务,有助于提高避孕措施使用者的身心健康.
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PCR方法快速检测食品中的金黄色葡萄球菌
目的 建立聚合酶链反应(PCR)方法快速检测牛奶、冰淇淋及内中的金黄色葡萄球菌(金葡菌). 方法 针对金葡菌耐热核酸酶基因(nuc)、纤维蛋白原结合蛋白基因(ClfA)设计并合成2对引物进行PCR扩增,特异的检测金萄菌,并对52株金葡菌和31株非金葡菌进行扩增,验证方法的特异性.在牛奶、冰淇淋及肉中人工污染不同菌量,增菌培养,在不同时间段提取DNA进行PCR扩增,确定该方法在食品中的检出限. 结果 nuc、ClfA两对引物对金葡菌的检出均有很好的特异性,在3种食品中的检出限均为10 cfu/g(ml),全部检测可在24h完成. 结论 建立了适用于牛奶、冰淇淋及内中的金葡菌检测的快速、灵敏、特异的PCR方法.
