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结核分支杆菌镜检、培养和PCR技术诊断结核病的临床评估
目的评估结核分支杆菌PCR、培养、镜检对结核病诊断的临床效果.方法对1?217例临床可疑结核病人用PCR、培养和镜检三种方法的阳性检出率进行比较.结果不同临床标本用PCR技术诊断结核病,其敏感性高于培养和涂片镜检,阳性检出率分别为:88.7%,43.4%,26.5%.结论通过三种方法比较分析,说明PCR技术是一种速度快、检出率高的检测结核分支杆菌的重要方法,对结核病的诊断有重要的参考价值.
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应用基因芯片分析结核分枝杆菌常见耐药基因型的研究
目的应用基因芯片快速检测结核分枝杆菌耐药基因型,建立一种新的分子药敏试验方法.方法以传统药敏试验和PCR-直接测序方法为对照,应用基因芯片快速检测157株结核分枝杆菌临床分离株异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)耐药基因(katG、rpoB、rp-sL、rrs和embB)的带荧光素标记的PCR产物.结果PCR-直接测序和基因芯片检测36株结核分枝杆菌药物敏感株的5种耐药基因均为野生型.121株结核分枝杆菌耐药分离株中,56株耐INH分离株,katG基因突变率为62.5%,其中katG缺失率为7.5%,315位密码子突变率为55.4%,279位密码子突变率为1.8%;104株耐RFP株,rpoB基因突变率为94.2%,常见的突变位点为531位和526位密码子(突变率分别为60.6%、15.4%),双位点突变率为5.8%,还发现511、513、515、516、517、518和533位密码子突变;62株耐SM分离株,rpsL和rrs总突变率为88.7%(两者分别为82.3%、6.5%),rpsL突变位于43位和88位密码子(突变率分别为77.4%、4.8%),rrs突变位于513位和516位碱基(突变分别为4.8%、1.6%);57株为耐EMB株,embB基因突变率为61.4%,均为306位密码子突变,常见的突变为ATG→GTG或ATA(突变率分别为35.1%、15.8%),还发现306位密码子ATG→ATC、ATT和CTG突变.通过基因芯片检出的突变与基因测序结果一致.结论应用基因芯片可分析大多数结核分枝杆菌耐药基因型,弥补传统药敏试验方法的不足,指导临床治疗.
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应用Xpert MTB/RIF技术快速诊断膝关节结核
目的 评价利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF,简称“Xpert”)在膝关节结核诊断中的临床应用价值.方法 连续收集2014年1月至2015年10月在首都医科大学附属北京胸科医院骨科接受手术治疗的49例膝关节病变患者的关节积液标本,每份标本同时分别行涂片抗酸杆菌检查、罗氏培养基培养、Xpert检测.以临床诊断为参考标准,评价Xpert检测关节积液标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度.结果 以临床诊断为参考标准,涂片、罗氏培养基培养、Xpert检测的敏感度分别为17.2％(5/29)、31.0％(9/29)、69.0％(20/29),差异有统计学意义(x2=8.34,P＜0.05);特异度分别为85.0％(17/20)、100.0％(20/20)、90.0％(18/20).结论 Xpert检测关节积液标本中结核分枝杆菌的敏感度高,并且可同时检测其耐药性,可用于快速诊断膝关节结核.
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结核分枝杆菌耐喹诺酮临床分离株gyrA基因突变的研究
目的了解结核分枝杆菌喹诺酮(quinolones)耐药株耐药基因突变情况,评价其应用价值.方法通过16S rRNA聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析77株分枝杆菌临床分离株; 通过PCR-SSCP和直接测序技术分析结核分枝杆菌的gyrA基因突变的情况.结果 75株为结核分枝杆菌复合群.30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱中,11株与H37Rv相同,19株与卡介苗相同;与卡介苗gyrA基因的SSCP图谱相同的敏感株95位密码子为ACC,与H37Rv该图谱相同的敏感株95位密码子为AGC.45株喹诺酮耐药株中,34株(75.6%)gyrA基因SSCP图谱泳动异常,对25株泳动异常、出现频率较高耐药株测序证实15株(44.1%)为94位密码子GAC→GGC突变;10株(29.4%)为90位密码子GCG→GTG的突变.结论结核分枝杆菌耐喹诺酮与gyrA基因突变有关,PCR-SSCP可能成为测定结核分枝杆菌耐喹诺酮类药基因型的快速、简便的方法.
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荧光定量PCR测定支气管肺泡灌洗液中TbDNA对涂阴肺结核的诊断价值
目的 探讨纤支镜肺泡灌洗液中结核分枝杆菌DNA在涂阴肺结核诊断中的价值.方法 应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术对300例涂阴肺结核,178例菌阳肺结核及119例肺炎或肺癌患者的纤支镜肺泡灌洗液标本进行结核分枝杆菌DNA检测.结果 3种病因肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA阳性检出率分别为:74.3%(223/300)、94.9%(169/178)、17.6%(21/119).结论 荧光定量聚合酶链反应检测肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA,用于肺结核诊断可提高肺结核诊断的敏感性和准确性,明显优于痰抗酸染色,亦较痰结核菌培养诊断灵敏、快速,可作为肺结核诊断较可靠指标.
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TaqMan-PCR技术诊断结核病的临床应用研究
目的探讨TaqMan-聚合酶链反应(TaqMan-PCR)技术在结核病快速诊断中的临床价值.方法对155例活动性肺结核患者的痰和外周血、130例结核性胸膜炎患者的胸腔积液和外周血以及61例结核性脑膜炎患者的脑脊液和外周血应用TaqMan-PCR检测结核分支杆菌DNA,痰、胸腔积液和脑脊液进行抗酸染色涂片检查,另外,痰标本还进行了BACTEC和改良罗氏培养;同期以52例肺癌患者的痰和外周血、50例恶性胸腔积液患者的胸腔积液以及33例健康人的外周血作为对照进行TaqMan-PCR检测.结果 155例活动性肺结核患者的痰和外周血、130例结核性胸膜炎患者的胸腔积液和外周血以及61例结核性脑膜炎患者的脑脊液和外周血TaqMan-PCR的阳性率分别为49.0%和51.6%、45.4%和38.5%以及50.8%和42.6%,痰、胸腔积液和脑脊液TaqMan-PCR的阳性率显著高于抗酸染色涂片以及BACTEC和罗氏培养(P<0.05).TaqMan-PCR检测痰、胸腔积液和外周血的特异性分别为96.2%、98%和96.5%.结论 TaqMan-PCR具有较高的敏感性和特异性,对结核病的快速诊断具有一定的价值.
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颈部淋巴结核96例诊断分析
目的 分析探讨颈部淋巴结核(CTL)的诊断方法.方法 回顾性分析青岛市胸科医院2012年4月至2013年12月收治的128例颈部肿块患者(其中96例确诊为颈部淋巴结核,作为观察组;32例为非颈部淋巴结核患者,作为对照组)的诊断过程,比较128例患者PPD试验、结核抗体检测、标本浓缩集菌抗酸杆菌检测、颈部CT增强扫描检查、结核感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT.TB)(其中观察组60例进行了检测)、结核分枝杆菌DNA-PCR共6种方法的诊断阳性率.采用SPSS 13.0统计软件进行处理,对组间和观察组样本率采用x2检验进行比较,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 对照组与观察组结核抗体检查阳性率分别为46.88％(15/32)、56.25％(54/96),两组比较差异无统计学意义(x2=0.849,P=0.357).对照组PPD试验、浓缩集菌抗酸杆菌检测、CT增强扫描、T-SPOT.TB、结核分枝杆菌DNA-PCR检查阳性率分别为25.00％(8/32)、0％(0/32)、15.63％(5/32)、9.38％(3/32)、0％(0/32),观察组各阳性率分别为84.38％(81/96)、13.54％(13/96)、92.71％(89/96)、98.33％(59/60)、97.92％(94/96),5项组间比较差异均有统计学意义(分别为x2=39.938,P＜0.01;x2=4.823,P=0.028;x2=73.105,P＜0.01;x2=75.154,P＜0.01;x2=117.961,P＜0.01).结论 CT增强扫描、血清T-SPOT.TB和结核分枝杆菌DNA-PCR在临床上对于颈部淋巴结核的检查阳性率较高;结合多种检查方法有助于辅助诊断颈部淋巴结核,同时有助于颈部肿块的鉴别诊断.
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结核分枝杆菌耐利福平药物机理的初步研究
目的 通过诱导试验观察结核菌产生耐利福平药物的全过程,初步分析结核菌耐该药的机理.方法 采用诱导试验、聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和序列分析,对经不同药物浓度传代培养后的结核菌强毒株(H37Rv)和36株临床耐药分离株进行分析.结果 在诱导到第7代时,H37Rv的PCR-SSCP电泳出现异常,经测序证实在513位点发生基因突变.36株临床耐药分离株中有23株发生突变,为63.9%(23/36);其中有5株与诱导株基因突变位点相同.结论 用药物不间断的刺激结核菌,是产生结核菌耐利福平药物的重要原因.
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传统培养法与PCR-荧光探针法鉴定分枝杆菌的对比研究
目的 比较传统培养法和PCR-荧光探针法在分枝杆菌的鉴定中有无差异.方法 对1552株分枝杆菌临床分离株同时用传统培养法对硝基苯甲酸(PNB)、噻吩二羧酸肼(TCH)培养基生长试验及PCR-荧光探针法进行鉴定,结果有差别的菌株用16SrRNA基因测序的方法进行确认.结果 两种方法非结核分枝杆菌的符合率为75.4％(46/61),结核分枝杆菌复合群的符合率为99.0％(1491/1506),总体符合率为99.0％(1537/1552).两种方法检测结果不同的15株样本经16SrRNA基因测序进行鉴定,PCR-探针法与16SrRNA结果一致的有14株,另外1株经传代分离纯化后测序结果为结核分枝杆菌和戈登分枝杆菌的混合菌.非结核分枝杆菌对PNB培养基的敏感度为21.7％(13/60),有0.1％(1/1492)的结核分枝杆菌复合群对PNB表现耐受性.对PNB敏感的13株非结核分枝杆菌中,有76.9％(10/13)为堪萨斯分枝杆菌.结论 部分非结核分枝杆菌使用PNB-TCH生长试验进行鉴定时会出现误判,而PCR-荧光探针法鉴定结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的准确性较高.
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应用DNA微阵列技术快速鉴定分枝杆菌菌种
目的 利用DNA微阵列的高通量、高效性,建立一种快速、简便的分枝杆菌分子菌种鉴定方法,为临床医师正确诊断提供依据.方法 以DNA直接测序法为对照,通过PCR-SSCP和DNA微阵列技术分析28种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和465株分枝杆菌临床分离株的菌种.结果 应用DNA微阵列技术分析28种分枝杆菌标准菌株和9种非分枝杆菌菌株,特异性100%.465株分枝杆菌临床分离株中,经16S rRNA PCR-SSCP初步菌种鉴定,256株为结核分枝杆菌复合群,应用DNA微阵列分析,显示与分枝杆菌属探针M和结核分枝杆菌复合群探针a杂交阳性,两种鉴定方法结果一致;209株PCR-SSCP初步鉴定为非结核分枝杆菌的分离株,经芯片分析,68株为龟分枝杆菌龟亚种和脓肿亚种,46株为胞内分枝杆菌,34株为堪萨斯、瘰疬、胃和猿猴分枝杆菌复合群,31株为偶然分枝杆菌,16株为戈登分枝杆菌,3株为鸟分枝杆菌,2株为海和溃疡分枝杆菌复合群,1株为土分枝杆菌,1株为迪氏分枝杆菌,1株为草分枝杆菌;另6株只与探针M杂交,经测序显示5株为胞内分枝杆菌,但其基因序列与标准菌株不完全相同,1株为新金色分枝杆菌,芯片上无鉴定该菌种的探针.结论 用DNA微阵列可简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种,提高分枝杆菌病的正确诊断率,指导临床合理治疗.
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16S-23S rDNA间隔区序列PCR扩增及探针杂交用于偶然分支杆菌暴发感染的研究
目的从基因水平上确认福建省南平市注射后偶然分支杆菌暴发感染的致病菌,并建立PCR结合DNA探针杂交快速鉴定偶然分支杆菌的方案.方法根据偶然分支杆菌16S-23S rDNA间隔区序列,设计合成一段寡核苷酸探针,采用PCR扩增、RFLP和DNA斑点杂交技术,对29株偶然分支杆菌临床分离株进行鉴定.结果 29株偶然分支杆菌临床分离株均被PCR扩增出一条约470bp的DNA条带,DNA探针杂交也出现特异的杂交斑点.结论 16S-23S rDNA间隔区序列PCR扩增及DNA探针杂交在基因水平上确认引起此次注射后暴发感染的致病菌为偶然分支杆菌,该方法具有灵敏、特异的特点.
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结核分枝杆菌耐药相关基因扩增多重PCR体系的建立与评估
目的 建立结核分枝杆菌耐药相关基因多重PCR反应体系,评估该体系以临床分离株DNA和痰菌DNA为模板扩增耐药相关基因的成功率.方法 常规提取结核分枝杆菌临床分离株(47株)及涂阳肺结核患者(21例)痰菌DNA.根据目前研究已发现的结核分枝杆菌耐药相关基因合成引物,建立2个多重PCR体系以扩增目的基因.扩增片段经测序证实后,计算该体系用于两种样本的扩增成功率.结果 针对临床常用8种抗结核药物,选取结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、embB、gyrA、rpsL、rrs、eis共8个耐药相关基因设计合成引物.建立2个多重PCR体系扩增8个耐药基因,该体系扩增47株结核分枝杆菌临床分离株DNA和21例菌阳肺结核患者痰菌DNA的成功率分别为100.0%(47/47)和76.2%(16/21).结论 本研究建立了高效扩增8个结核分枝杆菌耐药基因的多重PCR体系,结果对进一步研发结核病耐药分子诊断产品具有重要意义.
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三种检测方法联合使用对结核性胸膜炎的诊断价值
目的 探讨结核性胸膜炎患者外周血结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)、胸腔积液腺苷脱氨酶(ADA)及胸腔积液结核分枝杆菌DNA荧光定量聚合酶链反应(TB-DNA-PCR)联合检测对结核性胸膜炎的诊断价值.方法 收集2012年1月至2014年5月在上海市肺科医院住院的胸腔积液患者399例,其中确诊为结核性胸膜炎296例,非结核性胸膜炎103例.分别采集患者外周血和胸腔积液,进行外周血T-SPOT.TB、胸腔积液ADA和胸腔积液TB-DNA PCR的检测,分别计算3项检测的敏感度和特异度,以及串联联合检测(ADA、TB-DNA-PCR和T-SPOT.TB检测结果均为阳性视为阳性结果)和并联联合检测(ADA、TB-DNA-PCR和T-SPOT.TB任意一项检测结果为阳性视为阳性结果)的敏感度和特异度.样本“率”的比较采用x2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 分别采用ADA检测、TB-DNA-PCR和T-SPOT.TB的方法对296例结核性胸膜炎和103例非结核性胸膜炎患者进行检测,敏感度分别为90.88％(269/296)、31.42％(93/296)和81.76％(242/296);胸腔积液ADA检测的敏感度高于外周血T-SPOT.TB,差异有统计学意义(x2=11.23,P=0.000);外周血T-SPOT.TB的敏感度高于胸腔积液TB-DNA-PCR,差异有统计学意义(x2=152.66,P=0.000).ADA检测、TB-DNA-PCR和T-SPOT.TB方法的特异度分别为78.64％(81/103)、97.09％ (100/103)和73.79％(76/103);胸腔积液TRDNA-PCR的特异度高于外周血T-SPOT.TB,差异有统计学意义(x2=22.47,P=0.000);胸腔积液TB-DNA-PCR的特异度高于胸腔积液ADA检测,差异有统计学意义(x2=16.43,P=0.000);而胸腔积液ADA检测与外周血T-SPOT.TB的特异度差异无统计学意义(x2=0.67,P=0.513).对3项诊断方法进行联合检测,行串联试验时,特异度高达99.03％(102/103),敏感度为28.38％(84/296);行并联试验时,敏感度高达99.32％(294/296),特异度为69.90％(72/103).结论 胸腔积液ADA检测、胸腔积液TB-DNA-PCR及外周血T-SPOT.TB进行串联联合检测特异度较高,能够更好地降低误诊率;并联联合检测敏感度较高,能够更好地降低漏诊率.
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三种结核分支杆菌耐药基因的检测方法
目的建立3种结核分支杆菌耐药基因的检测方法,了解耐药基因突变和耐药水平的关系.方法 108例临床痰标本分离株均做聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和传统梯度药敏试验.结果耐SM(rpsL)、RFP(rpoB)、INH(KatG)基因突变率分别为78.5%,68.2%,70.5%,其中,高耐SM,RFP,INH分离株分别为86.5%,89.3%,84.3%;低耐分离株分别为28.5%,16.5%,7.1%.结论结核分支杆菌耐药基因突变与耐药水平有密切联系,绝大多数结核分支杆菌耐药基因突变发生在高耐药株,少部分在低耐药株发生基因突变.
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四种结核分枝杆菌检测方法的临床应用评价
目的评估涂片、培养、PCR和增菌PCR检测结核分枝杆菌临床应用价值.方法对124例临床确诊的肺结核、可疑结核患者和非结核病人痰标本的涂片、培养、PCR和增菌PCR四种方法的检测结果进行比较.结果涂片、培养、PCR和4及7 d的增菌PCR检测31例临床确诊的肺结核病人痰标本阳性率分别为22.5%、32.2%、54.8%、64.5%和87.1%;检测59例临床可疑肺结核病人痰标本阳性率分别为13.6%、18.6%、28.8%、37.3%和52.5%.比较四种方法的阳性检测率有显著性差异(P＜0.05).检测34例非结核病人痰标本,涂片、培养均为阴性,而PCR和增菌PCR均有1例假阳性,假阳性率2.9%.比较PCR与增菌PCR对菌阳和菌阴病人的痰标本阳性检测率,有显著性差异(P＜0.05),而两种方法的假阳性率相同.结论增菌PCR检测结核分枝杆菌具有很高的敏感性和特异性,可作为结核病的有效辅助诊断方法之一.
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血液TB-DNA-PCR检测标本处理的探讨
聚合酶链反应(PCR)技术的出现,有可能为结核病的诊断提供灵敏、特异、快速的方法,但有关血液标本的前处理尚无统一的标准,为此我们做了初步探索,报告如下.
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基因释放剂对痰中耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变检出率的影响
结核分支杆菌DNA依赖性RNA聚合酶β亚单位编码基因(rpoB)是单拷贝基因,提高其检测灵敏度对直接检出痰中耐利福平结核分支杆菌具有重要意义.我们在聚合酶链反应-单链构象多态性分析中(PCR-SSCP)采用基因释放剂和套式PCR,提高痰标本中结核杆菌rpoB基因突变检出率,以快速确定是否为耐药菌感染.
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PCR-SSCP 技术快速检测结核分枝杆菌三种基因突变
聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)是快速检测基因突变的重要方式之一[1].应用此法对辽宁省90例涂阳患者痰标本分离结核分枝杆菌进行rpoB、rpsL、56例katG基因突变检测,与传统耐药结果比较分析,寻找结核分枝杆菌耐药性与基因突变的关系.
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对几种结核分支杆菌检测方法的初步探讨
结核病是一种较严重的传染病,目前的疫情呈上升趋势,但在结核病早期实验诊断上,传统方法存在一定局限性.近年来,一些针对分支杆菌检测的新方法陆续报道.本文对聚合酶链反应(PCR)法、噬菌体裂解法、斑点杂交一发光自显影法,三种结核分支杆菌检测方法的应用进行评价.
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聚合酶链反应(PCR)反相斑点杂交方法快速检测耐利福平结核分支杆菌的rpoB基因突变
目的:研究聚合酶链反应(PCR)-反相斑点杂交方法在快速检测耐利福平结核分支杆菌的rpoB基因突变的应用.
