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克洛诺菌属分离株16S rDNA序列分析
目的 对2株克洛诺茵属(原阪崎肠杆茵)模式株和29株食品分离株的16S rDNA进行序列分析.方法 对茵株的16S rDNA进行PCR扩增、测序,获得目的 茵的16S rDNA序列并通过BioNumenics软件对其进行多重对比分析和系统发育学分析.结果 除ATCC51329和ES 014外,其他克洛诺茵属与ATCC29544的16S rDNA序列均属于同一基因群,而ATCC51329和ES 014分别属于另外一个分支.从16S rDNA序列分析可知,除ES014不能确定外,其它克洛诺菌属分离株均可从基因水平上得到准确鉴定.结论 从基因水平上对国内克洛诺茵属食品分离株进行鉴定,并研究了相关茵株之间的系统发育学关系.
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串珠镰刀菌伏马菌素产毒株聚合酶链反应检测方法的研究
以伏马菌素生物合成所必需的多酮肽合成酶基因fum5为基础,设计了3对特异性引物P1/P2 、P3/P4和Fum5F21/ Fum51,建立了串珠镰刀菌伏马菌素产毒株PCR检测方法.以5株ATCC典型串珠镰刀菌及其他菌株为参考,其中ATCC 52539为伏马菌素B1(FB1)产毒株,测定了PCR方法的特异性.ATCC 52539扩增结果阳性,该3对引物分别扩增出880bp、702bp和1040bp DNA片段,非伏马菌素产毒株ATCC 38946、ATCC 26263、ATCC 12763、 ATCC 38016及其他阴性对照菌株(禾谷镰刀菌、梨孢镰刀菌、木贼镰刀菌、三线镰刀菌、黄曲霉、拟青霉和大肠杆菌O157)结果阴性,证明引物具有很好的特异性.同时以不同稀释度的ATCC 52539 DNA为模板,测定了3对引物PCR的敏感性,P1/P2每PCR反应的检出限为100pg,P3/P4和Fum5F21/ Fum5R1每PCR反应的检出限均为10pg,分别相当于每PCR反应检出104和103个孢子.3对引物PCR检测国内不同地区分离的32株串珠镰刀菌及交孢变种,26株为伏马菌素产毒株,6株为非伏马菌素产毒株.并对部分产毒株PCR(P3/P4)产物,应用内切酶EcoR V和BamHI,进行限制片段长度多态性(RFLP)分析,分别产生181bp、521bp 2个和116bp、258bp、328 bp 3个DNA片段,与文献报道值一致,确证了结果的可靠性.其中1株 ZJ-fm052 FB1产毒基因阳性,但产毒培养检测结果阴性,有待进一步研究.结果表明,PCR为串珠镰刀菌伏马菌素产毒株快速而可靠的检测方法.
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创造酶切位点PCR-RFLP检测MTHFR(rs2274976)基因多态性
目的 建立简便易用的 MTHFR 基因单核苷酸多态(rs2274976)的检测方法.方法 应用创造酶切位点原理设计引物,通过 PCR-RFLP 技术判断MTHFR基因SNP位点多态性.结果设计一对特异引物,其中正向引物3'末端与多态相邻,倒数第二位碱基为错配碱基C可在PCR扩增后与多态G等位基因及相邻片段形成CCGG结构,使用限制性内切酶MspI进行RFLP检测可判断MTHFR多态性.结论 应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的MTHFR多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点.
关键词： 创造酶切位点 聚合酶链反应 限制性酶切片段多态性 单核苷酸多态性 MTHFR -
ENAH单核苷酸多态性检测及其与胃癌发生发展的关系
为了研究胃癌发生发展与ENAH 基因SNP之间的关系,采用PCR方法分别特异扩增ENAH 基因2号外显子rs113271908(T>C)和rs75986582(G>T)在内片段,PCR产物用直接测序法来分析结果.用PCR-直接测序法检测了50例正常血样和50例胃癌癌旁正常粘膜组织样本,结果rs113271908和rsrs75986582分别只存在TT和GG一种基因型,在对照组和病例组中没有差异,因此认为它们与胃癌的易感性没有相关性.
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44 株食物中毒来源副溶血性弧菌的毒力基因检测与分析
目的:了解江阴市食物中毒来源副溶血性弧菌毒力基因携带情况并分析其致病性.方法:以2013 ~2014年在江阴发生的副溶血性弧菌食物中毒中分离获得的44 株菌株 (包括剩菜分离株21 株,肛拭子分离株22株,环境样本分离株1 株)为研究对象,应用实时荧光PCR法检测tdh、trh和tlh三种毒力基因.结果:全部44株样本中tdh基因阳性率为38. 6% (17/44),trh基因未检出 (0/44),tlh基因阳性率为 100. 0% (44/44).tdh基因样本检出情况为剩菜分离株 tdh基因阳性率4. 8% (1/21 );肛拭分离株 tdh 基因阳性率72. 7%(16/22);环境标本的1 株未检出.结论:食物中毒分离株中,临床样本分离株tdh基因携带率较高,tdh基因与副溶血性弧菌的致病性有高度的关联性.所有样本都检出tlh基因,为提示其可作为副溶血性弧菌分子检测的特异性标志物提供了重要参考.
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聚合酶链反应-增强化学发光法快速检测结核杆菌的研究
目的建立聚合酶链反应-增强化学发光法(polymerase chain reaction-enhanced chemiluminecence,PCR-ECL)快速高灵敏度和高特异性检测结核杆菌的方法.方法以结核分支杆菌、牛分支杆菌特异性抗原Pab基因的419bp片段为靶序列,PCR体系经优化,直接酶标法标记探针,增强化学发光检测(ECL)进行分子杂交.结果 PCR体系对结核分支杆菌、牛分支杆菌、卡介苗的扩增为阳性,PCR体系灵敏度为5fg DNA分子.ECL体系灵敏度为0.5pg DNA分子.采用模拟痰样,可检至10个以下结核杆菌.结论建立了结核杆菌的PCR-ECL快速检测方法,整个过程可在一天半内完成.
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利用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌北京基因型菌株
目的 建立结核分枝杆菌北京基因型菌株快速鉴定方法,研究该家族在人群中的流行传播的规律和特点.方法 采用间隔区寡核苷酸(spoligotyping)分型与多重PCR方法分别对临床分离的112株结核分枝杆菌进行北京基因型菌株鉴定.结果 在分析的112株结核分枝杆菌中,107株为北京基因型,多重PCR鉴定结果与Spoligotyping分型符合率为100%.结论 与spoligotyping分型相比,多重PCR技术可以快速地区分北京基因型与非北京基因型株,且方法简单,更适于基层试验室中对北京基因型结核分枝杆菌在人群中的流行进行大规模监测.
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荧光探针杂交技术检测临床标本内结核分支杆菌的价值
目的评价聚合酶链反应(PCR)荧光探针杂交技术(TaqMan技术)检测临床标本中结核分支杆菌的应用价值.方法应用细菌学方法(涂片镜检和培养)及TaqMan法检测133份结核病患者痰标本,53份非结核呼吸系疾病患者痰标本.结果细菌学方法检测结核病患者临床标本中结核分支杆菌阳性率为36.1%,TaqMan法阳性率为61.7%,高于细菌学检测法,经统计学处理,两者有显著性差异(P＜0.05),用TaqMan法检测临床标本特异性为96.2%.结论 TaqMan技术将PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化,在单一管内完成,具有简便、快速、防污染、敏感性及特异性较高等优点,是结核病辅助诊断的有效方法之一.
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结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化
目的 构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白.方法 制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增目的 基因片段;通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c,经序列测定证实正确,双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT,转化入大肠杆菌DH5α中,再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式.结果 成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c,转化入大肠杆菌DH5α中,经诱导产生高水平的表达产物.经SDS分析,在80kD处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23.7%.该融合蛋白以包涵体的形式存在,用Ni2+-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化.结论 成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础.
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应用PCR-RFLP分析结核分枝杆菌rpsL基因突变
目的了解结核分枝杆菌链霉素(SM)耐药基因突变情况,建立快速检测耐药突变株的方法.方法通过PCR-RFLP分析62株结核分枝杆菌临床分离株的rpsL基因突变的部位和性质.结果以H37RV标准株为对照,13株敏感株的rpsL基因有MboⅡ酶切位点;37株耐SM分离株中,31株(83.8%)无MboⅡ酶切位点;12株耐其它抗结核药物株中,也有2株无MboⅡ酶切位点.结论大多数结核分枝杆菌SM耐药分离株的核糖体S12蛋白编码基因(rpsL)第43位密码子有点突变.PCR-RFLP可能成为快速检测结核分枝杆菌耐药突变株的一种新方法.
关键词： 分枝杆菌 结核 药物耐受性 聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 -
微孔杂交技术诊断肺外结核
目的将聚合酶链反应(PCR)、核酸杂交、酶联免疫吸附三种技术有机结合,从分子水平检测结核杆菌,为临床诊断肺外结核提供病原学依据.方法使用生物素标记的特异性引物扩增结核杆菌(TB)DNA,带有生物素的产物与包被在微孔板内的靶基因杂交,加入酶标链毒亲和素与生物素结合,后加辣根过氧化物酶显色,2M H2SO4终止反应.根据酶标仪检测各孔吸光度判断结果.结果通过对临床高度怀疑为肺外结核的408份标本的检测,PCR-微孔板杂交法的检出率为43.6%,培养法的检出率为25.9%直接涂片抗酸染色为6.4%.结论 PCR杂交法灵敏度高,特异性强,有助于临床准确、快速诊断肺外结核.
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骨关节结核各类标本进行结核分枝杆菌培养与PCR检测的阳性率结果分析
目的 比较骨关节结核病灶中脓液、干酪、肉芽及死骨组织的结核分枝杆菌培养阳性率,及结核分枝杆菌BACTEC MGIT 960(简称“MGIT 960”)培养、改良罗氏培养基培养、PCR检测的联合阳性率.方法 2011年6月至2012年5月首都医科大学附属北京胸科医院收治的经病理明确诊断为骨关节结核的患者50例,通过手术获取病灶中的脓液(50份)、干酪(42份)、肉芽(48份)及死骨组织标本(43份),分别进行结核分枝杆菌MGIT 960培养及改良罗氏培养基培养,比较4种组织标本的培养阳性率,计算2种培养方法的联合阳性率;对脓液标本单独通过PCR方法进行了阳性率检测;计算脓液标本3种方法的联合阳性率.结果 4种标本MGIT 960培养的阳性率依次为:死骨组织(41.9％,18/43)＞脓液(40.0％,20/50)＞肉芽(33.3％,16/48)=干酪(33.3 ％,14/42);4种标本改良罗氏培养阳性率依次为:肉芽(20.8％,10/48)＞脓液(20.0％,10/50)＞死骨组织(16.3 ％,7/43)＞干酪(14.3％,6/42);脓液的PCR检测阳性率为48.0％(24/50).MGIT 960和改良罗氏培养2种结核分枝杆菌培养方法的联合阳性率为50.0％(25/50),而PCR检测、MGIT960和改良罗氏培养3种方法的联合阳性率为68.0(34/50).结论 骨关节结核患者,应尽可能选择多种标本以提高培养阳性率.MGIT 960培养可以作为首选的细菌学诊断方法,但如果再联合使用改良罗氏培养和PCR扩增技术,能够进一步提高检出阳性率.
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痰标本PCR-反向斑点杂交法对疑似非结核分枝杆菌肺病的诊断价值
目的 探讨痰PCR-反向斑点杂交法对疑似非结核分枝杆菌(NTM)肺病的诊断价值.方法 搜集2014年1月至2017年10月同济大学附属上海市肺科医院收治的、通过临床症状和影像学检查疑诊为NTM肺病的患者334例,分别取痰液行PCR-反向斑点杂交法分枝杆菌菌种鉴定基因检测及分枝杆菌传统培养法[对硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基生长试验]检测,终确诊为NTM肺病患者218例(NTM肺病组)、结核病患者42例(结核病组)、其他肺部疾病患者74例(研究中予以排除).以终确诊结果为金标准,对痰PCR-反向斑点杂交法诊断临床疑诊NTM肺病患者的敏感度、特异度、阳性预测值和符合率进行分析.结果 疑诊NTM肺病的334例患者中,培养法分枝杆菌检出率为67.66％ (226/334),PCR-反向斑点杂交法分枝杆菌检出率为64.67％(216/334),两种方法分枝杆菌检出率的比较,差异无统计学意义(x2=0.67,P=0.231).确诊的218例NTM肺病患者中,PCR-反向斑点杂交法检出NTM的敏感度为82.57％ (180/218),阳性预测值为98.36％(180/183);培养法检出NTM的敏感度为87.61％(191/218),阳性预测值为100.00％ (191/191);两种方法检出NTM的敏感度比较,差异无统计学意义(x2=1.20,P=0.169).以42例结核病组患者作为对照,PCR-反向斑点杂交法检测的特异度为78.57％ (33/42),诊断结核病的阳性预测值为100.00％ (33/33);培养法的特异度为83.33％(35/42),诊断结核病的阳性预测值为100.00％(35/35);两种检测方法特异度的比较,差异无统计学意义(x2 =0.31,P=0.391).PCR-反向斑点杂交法在两组患者中的诊断符合率为83.08％(216/260),培养法在两组患者中的诊断符合率为86.92％(226/260),差异无统计学意义(x2=1.51,P=0.134).结论 以胸部CT检查为诊断基础的疑似NTM肺病患者中,应用PCR-反向斑点杂交法行痰液NTM检测具有较高的敏感度和特异度,对临床的快速准确诊断和及时治疗有一定的参考意义.
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PCR-荧光探针法检测临床痰标本结核分枝杆菌的可靠性研究
目的 评价PCR-荧光探针法快速检测Mtb和非结核分枝杆菌(NTM)的临床应用价值.方法 应用分枝杆菌核酸检测试剂对1015例痰标本和56株临床分离株进行检测,与Mtb核酸扩增(PCR)荧光(目前临床上认可惟一同类产品)检测结果进行比较.采用 SPSS 11.5统计软件进行数据统计处理,采用x2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 PCR-荧光探针法检测痰标本分枝杆菌灵敏度50.3％ (373/741),特异度98.9％(271/274)；菌阳肺结核标本检测灵敏度97.0％(257/265),菌阴肺结核标本检测灵敏度24.4％ (116/476)；1015份痰标本中检测出11例非结核分枝杆菌(NTM)核酸阳性标本(占1.1％),经16S rDNA测序确认,准确率100.0％.随机数字量表法抽取138例标本重复进行第2次检测,符合率100.0％.对56株临床分离株(1株Mtb临床分离株,55株NTM临床分离株)检测,准确率100.0％.对临床需要的226份标本同时与达安公司试剂盒检测结果比较,总体符合率95.1％ (215/226),经统计学分析,两者之间差异无统计学意义(x2=2.98,P=0.226).结论 PCR-荧光探针法可快速检测和区分痰标本Mtb与NTM,具有临床推广应用价值.
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深圳市汉族人群转化生长因子β1基因位点多态性与结核病的相关性研究
目的 检测深圳市汉族人群TGF β1基因rs4803455位点单核苷酸多态性(SNP)的基因类型,探讨其基因多态性与不同临床表现的结核病之间的关系.方法 采用基于TaqMan探针技术的实时荧光PCR法,检测373例结核病患者(结核组)和350名健康人(对照组)TGF β1基因rs4803455位点的等位基因型并分层分析,然后观察结核组中有病理学或者细菌学证据的肺结核患者(肺结核组)和结核性胸膜炎患者(结核性胸膜炎组)等位基因频率差异.结果 rs4803455位点等位基因C/A频率在结核组373例A为31.8％(237/746),C为68.2％(509/746)；对照组350名A为40.6％(284/700),C为59.4％(416/700)；两组间差异有统计学意义(x2=12.139,OR=1.466,95％CI=1.182～1.819,P=0.000).年龄≤25岁的结核组121例A为33.5％(81/242),C为66.5％(161/242);对照组111名A为41.0％(91/222),C为59.0％(131/222);两组间差异无统计学意义(x2=2.807,OR=1.381,95％CI=0.946～2.015,P=0.094).年龄＞25岁的结核组252例,A为31.0％(156/504),C为69.0％(348/504)；对照组239名,A为40.4％(193/478),C为59.6％(285/478)；两组间差异有统计学意义(x2=9.511,OR=1.511,95％CI=1.162～1.965,P=0.002).有病理学或者细菌学证据的肺结核组111例,A为32.4％(72/222),C为67.6％(150/222)；结核性胸膜炎组57例,A为21.1％(24/114),C为78.9％(90/114)；对照组350名A为40.6％(284/700),C为59.4％(416/700);前两组分别与对照组比较,差异均有统计学意义(x2值分别为4.710、15.879,OR值分别为1.422、2.560,95％CI分别为1.034～1.957、1.592～4.116,P值均＜0.05).等位基因C在肺结核组中的频率[78.9％(90/114)]比在结核性胸膜炎组中的频率[67.6％(150/222)]高.结论 TGFβ1基因rs4803455位点的基因多态性和结核病特别是结核性胸膜炎有关,等位基因C可作为预测结核病特别是结核性胸膜炎的危险因素,其中在年龄＞25岁的患者中预测作用更大.
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几种检测方法对胸腔积液性质鉴别的意义
目的探讨几种检测方法对胸腔积液性质鉴别的意义.方法几种检测方法分别用于89例胸腔积液患者.结果胸膜活检术的综合鉴别意义明显高于其它几种检测方法.结核杆菌-脱氧核糖核酸聚合酶链反应(TB-DNA-PCR)对于肺结核的诊断意义较大,而检测外周血的意义较检测胸液大,二者存在显著性差异(P＜0.01).结论胸膜活检术与PCR的联合应用可更有效、更准确地鉴别胸腔积液的性质.
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应用PCR-反向点杂交技术快速检测结核分枝杆菌耐药突变基因
目的 评价PCR-反向点杂交技术在检测结核分枝杆菌耐药突变基因中的应用价值.方法 选取2014年8月至2015年12月江西省胸科医院住院的部分肺结核患者作为研究对象,共1071例.研究对象均送检了痰液标本,共1071份.所有患者均经病原学或病理学证实,或符合菌阴肺结核诊断标准.采用PCR-反向点杂交技术对研究对象痰标本进行异烟肼(H)、利福平(R)、链霉素(S)、乙胺丁醇(E)耐药基因检测,并以痰培养阳性标本的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)检测结果作为金标准,来验证检测结果的可靠性及评价其检测效能.结果 PCR-反向点杂交检测的1071例患者中,596例结核分枝杆菌阳性,阳性率为55.65％.其中,218例(36.58％)检出H、R、S、E耐药基因突变,分布于所测13个位点.H、R、S、E常见突变位点分别位于KatG的315M(82.53％,137/166)、rpoB的S531L (69.50％,98/141)、rpsl 的43M(78.65％,70/89)、embB的306M2(55.13％,43/78)和306M1(39.74％,31/78).433例患者标本同时行结核分枝杆菌培养,培养阳性且同时PCR-反向点杂交检测阳性157例.以培养及药敏试验结果为金标准,PCR-反向点杂交法对H、R、S、E的耐药检测经Kappa检验具有较好的一致性(Kappa值分别为0.77、0.73、0.66、0.49);敏感度分别为88.89％(40/45)、79.66％(47/59)、67.57％(25/37)、63.16％ (12/19);特异度分别为91.07％ (102/112)、91.84％ (90/98)、95.00％(114/120)、91.30％(126/138).结论 PCR-反向点杂交技术用于结核分枝杆菌耐药基因检测较为可靠,对早期临床用药具有较好的指导作用.
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分子信标荧光定量PCR在肺结核早期诊断及疗效评价中的初步应用
目的 探讨分子信标荧光定量PCR在肺结核早期诊断及疗效评价中的应用价值.方法 采集2010年3-7月间在彭州市CDC结核病防治所门诊就诊患者的痰标本382份,其中初诊疑似肺结核患者的痰标本305份,肺结核患者随访痰标本77份,用分子信标荧光定量PCR法和抗酸染色法检测Mtb.结果 382份痰标本抗酸染色法、分子信标荧光定量PCR法检测总阳性率分别为12.6％ (48/382)、42.4％(162/382),分子信标荧光定量PCR法阳性率显著高于抗酸染色法,差异有统计学意义(x2=74.5,P＜0.001).结论 分子信标荧光定量PCR较抗酸染色法具有更高的灵敏度,不仅提高了肺结核早期诊断的检出率,还能间接反映药物疗效,在肺结核防治工作中具有重要意义.
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传统方法和PCR法在结核分枝杆菌复合群菌种鉴定中的对比研究
目的 对结核分枝杆菌复合群菌种鉴定的传统方法与PCR法进行对比研究,为临床应用提供科学依据.方法 分别采用传统结核分枝杆菌菌种鉴定方法(对硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼)和PCR法,对2010年4月至2011年5月新疆喀什胸科医院住院、临床确诊肺结核患者的313份(例)晨痰标本临床分离株进行菌种鉴定.立意抽样法抽出100份结核分枝杆菌、牛分枝杆菌及非洲分枝杆菌Ⅰ型菌株,用Spoligotyping法检测前两种方法结果的可靠性.结果 传统方法检测出结核分枝杆菌253株,牛分枝杆菌60株；而PCR法检测出结核分枝杆菌306株,牛分枝杆菌1株,非洲分枝杆菌Ⅰ型6株,两者间差异无统计学意义(x2 =5.05,P=0.08),两者检测的一致率为79.87％(250/313).传统方法和PCR法鉴定结果差异虽无统计学意义,但传统方法检测出牛分枝杆菌60株,而PCR法仅检测出牛分枝杆菌1株,差异有统计学意义(x2=4.16,P=0.04),故用立意抽检100份菌株,用Spoligotyping检测出牛分枝杆菌2株,结核分枝杆菌90株、非洲分枝杆菌Ⅰ型6株,2株未能检出菌型；其和传统方法与PCR法的一致率分别为38.78％[(2+36)/98]、98.98％[(1+90+6)/98].结论 经过Spoligotyping法检测可知,在结核分枝杆菌复合群菌种鉴定中传统方法较PCR法耗时、繁琐,且不能较准确地鉴定出菌种,而PCR法可准确、快速的将其鉴定到亚种.
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建立增菌PCR方法对痰涂片阴性肺结核的早期诊断
目的建立增菌PCR方法,以达到对涂片阴性痰标本中结核菌早期检定和确认活菌的目的.方法采用7H12半流休培养和PCR扩增相结合的增菌PCR方法,对46份初治肺结核患者痰标本进行检测,并对杂交结果进行凝胶呈像灰度分析.结果应用增菌PCR检测涂片阴性痰标本,其中86.2%的标本在增菌7*#d内得到阳性结果,于4周时得到大阳性率,较培养法的阳性检出时间明显缩短(P＜0.01),较普通标本PCR阳性率明显提高(P＜0.05);有63.0%的标本增菌7d时的杂交结果凝胶灰度值与0d时相比＞1;并有62.1%的增菌PCR7d内得到阳性的标本得到同一样本7H12半流培养阳性结果的支持和活菌判定.结论增菌PCR不是单纯的PCR,增菌7d后PCR阳性率明显增加,且有杂交结果凝胶灰度比值的增加和随后的培养结果对其进行支持和活菌判断,有助于临床诊断的确切性.
