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日本血吸虫脂肪酸结合蛋白DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫力的研究
目的构建日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)重组质粒,并观察其在小鼠体内诱导的抗日本血吸虫感染保护作用.方法RT-PCR特异性扩增Sj14FABP基因,将其克隆入真核表达载体pVIVO2,通过PCR、双酶切及测序鉴定.获得的重组质粒pVIVO2-Sj14FABP转染HepG2细胞,间接免疫荧光(IFA)检测蛋白表达;并免疫BALB/c小鼠,30 d后攻击感染,感染后45天剖杀,计数检获成虫数和肝脏虫卵数.结果RT-PCR扩增出大小为440 bp的Sj14FABP片段,重组质粒经PCR和双酶切后均获得目的片段,转染细胞IFA结果显示有较强荧光.重组质粒免疫小鼠后分别获得24.1%减虫率和27.2%减卵率.结论成功构建和表达重组质粒pVIVO2-Sj14FABP,该核酸疫苗能够诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力.
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日本血吸虫肌球蛋白部分重链基因核酸疫苗的构建与小鼠保护性研究
目的研究日本血吸虫肌球蛋白部分重链基因核酸疫苗对小鼠的保护效果.方法用致弱童虫免疫血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,获得的阳性克隆之一与曼氏血吸虫肌球蛋白重链基因同源.PCR法扩增该片断基因,产物克隆入真核表达载体pcDNA3中,构建成肌球蛋白部分重链基因核酸疫苗.将50μg肌球蛋白(myosin)核酸疫苗注射C57BL/6小鼠的两侧股四头肌,免疫3次,间隔2周,末次免疫后2周经腹部皮肤攻击感染尾蚴30条/鼠,感染6周后用门静脉灌注法收集成虫,计算核酸疫苗免疫组减虫率与空质粒对照组减虫率.结果核酸疫苗免疫组获得了33.02%的减虫率,空质粒对照组获得了24.50%的减虫率,经t检验,两组差异无显著性.结论肌球蛋白部分重链基因核酸疫苗在小鼠中未能诱导出保护力.
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日本血吸虫pcDNA3.1(+)/MLP核酸疫苗对家兔的保护性免疫作用
目的观察日本血吸虫pcDNA3.1(+)/MLP(SJP)核酸疫苗对家兔的保护性免疫作用.方法将24只新西兰家兔随机分为2组,每组12只;实验组每只家兔SJP的免疫剂量为500 μg/次,后腿肌肉注射,对照组注射空质粒pcDNA3.1(+);隔周免疫1次,共4次,后1次免疫后2周进行日本血吸虫尾蚴攻击感染.尾蚴攻击感染60 d后处死,观察肝脏病变,计算减虫率及减卵率,并做血清抗体及细胞因子分析.结果 SJP免疫家兔可明显抑制肝脏虫卵肉芽肿的大小,肉芽肿数量减少,肝组织减卵率为28.10%,并可诱导IgA、IgG1变化,诱生INF-γ应答.结论 SJP免疫家兔对日本血吸虫尾蚴攻击感染可产生一定的保护作用.
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核酸疫苗PcDNA3.1/SjTs-1粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染保护力的研究
目的探讨日本血吸虫核酸疫苗pcDNA3.1/SjTs-1粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染的保护力.方法小鼠随机分为5组,每组12只,包括单磷脂A(MPL)、pcDNA3.1、pcDNA3.1+MPL、pcDNA3.1/SjTs-1和pcDNA3.1/SjTs-1+MPL组.滴鼻免疫.第3次免疫后2周,每只经腹部感染(40±1)条尾蚴.45 d宰杀动物,以观察减虫率和减卵率.在初次免疫前和攻击感染前尾静脉采血和收集粪便,ELISA检测血清内特异性IgA和IgG及粪内sIgA水平.结果pcDNA3.1/Sjs-1滴鼻免疫可诱导小鼠产生全身和粘膜免疫应答,且疫苗加佐剂组诱导小鼠产生的抗体水平高于不加佐剂组.pcDNA3.1/SjTs-1和pcDNA3.1/SjTs-1加MPL滴鼻免疫诱导小鼠产生的减虫率分别为24.98%和25.57%,减卵率分别为61.44%和64.59%.两者的减虫率和减卵率差异无显著性(P＞0.05).结论pcDNA3.1/SjTs-1滴鼻免疫可诱导小鼠产生全身和粘膜免疫应答及部分抗攻击感染的保护力.
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日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(SjC FABP)核酸疫苗诱导小鼠免疫保护作用研究
目的研究日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白分子(SjC FABP)核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护性作用.方法根据SjC21.7分子基因序列合成1对特异性引物P1和P2,并使其5′端分别带有BamH1、Xho1的酶切位点序列,采用PCR方法从重组质粒SjC FABP-pUC19中扩增出特异性目的基因的开放阅读框序列,并在其翻译起始密码子处引入Kozark序列.限制性酶切后的基因片段被亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中,构建成重组真核表达质粒SjC FABP- pcDNA3.1,大量制备纯化的重组真核表达质粒.48只BALB/c小鼠分为对照组、实验组、加强组.对照组每只小鼠的股四头肌注射接种100 μg质粒pcDNA3.1 DNA,实验组以同样的方式注射100 μg重组质粒SjC FABP-pcDNA3.1 DNA,加强组除注射100 μg重组质粒SjC FABP-pcDNA3.1 DNA外,同时注射P35-pcDNA3.1,P40-pcDNA重组质粒各100 μg.每隔2周免疫1次,共免疫3次.第3次免疫后的第30天每只小鼠经腹部皮肤感染(45±1)条尾蚴,45 d后剖杀,计数各组小鼠肝虫卵数及成虫数.于免疫前及末次免疫后2周分别经尾静脉采血,测定抗体水平.在第2次免疫后第10天各组取2只小鼠处死,取股四头肌进行免疫组化分析.结果免疫组化分析显示实验组及加强组小鼠局部组织有特异性抗原蛋白表达.ELISA分析,免疫后实验组13只小鼠有8只出现特异性IgG抗体,而加强组14只小鼠有6只出现特异性抗体.与对照组相比,实验组获得33.80%的减虫率,10.87%减卵率;加强组获得了31.76%的减虫率,29.97%的减卵率.加强组的减卵率明显高于实验组,差异有显著性(P<0.05).结论 SjC FABP核酸疫苗能诱导BLAB/c小鼠产生一定水平抗血吸虫感染保护性作用.
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日本血吸虫中国大陆株23 kDa膜蛋白核酸疫苗对猪免疫保护作用的研究
目的研究日本血吸虫中国大陆株23 kDa膜蛋白(SjC23)DNA疫苗诱导猪的保护性免疫作用.方法构建并大量制备pcDNA3.1-SjC23质粒DNA和pcDNA3.1-p35, pcDNA3.1-p40(小鼠IL-12的2个亚单位)的DNA疫苗.30头2.5月龄的上海松江本地猪(阉猪)分为A、B、C3组,每组10头.A组(SjC23组)于每头猪两侧臀部肌肉注射500 μg pcDNA3.1-SjC23质粒DNA,B组(SjC23+IL-12组),于每头猪肌肉注射500 μg pcDNA3.1-SjC23 DNA及500 μg pcDNA3.1-p35和500 μg pcDNA3.1-p40的混和质粒DNA;C组(对照组)每头猪肌肉注射500 μg pcDNA3.1质粒DNA.共免疫3次,每次间隔3周.末次免疫后30 d,每猪经背部皮肤攻击感染日本血吸虫尾蚴600条.攻击后45 d剖杀,经胸主动脉灌冲,并从门静脉收集计算成虫.从肝脏的同一部位切下小块肝组织,置5% KOH内消化后,计算每克肝组织虫卵数(EPG).比较各组间减虫率、减雌率和减卵率.在免疫前,末次免疫后和攻击后从猪耳静脉采血,分离血清,用ELISA检测抗SjC23抗体.结果 SjC23组与SjC23+IL-12组与质粒对照组相比,分别获得29.2%和58.6%的减虫率、50.8%和58.8%的减雌率以及48.2%和56.4%的减卵率.抗体检测SjC23组和SjC23+IL-12组均有约50%的实验猪可检测到明显的抗SjC23抗体.结论 SjC23 DNA疫苗可诱导猪产生较好的免疫保护作用,具有较大的发展潜力.
关键词： 日本血吸虫中国大陆株 23 kDa膜蛋白 核酸疫苗 猪 保护性免疫 -
弓形虫棒状体蛋白及其核酸疫苗研究现状
弓形虫病目前尚无理想的特效治疗药物和防治措施,研制安全便捷、保护力强的核酸疫苗是弓形虫病防治的有效策略.棒状体蛋白(Rhoptry protein,ROPs)是弓形虫在入侵宿主细胞过程中所分泌的一类蛋白,其在弓形虫入侵宿主细胞、纳虫空泡(Parsitophorous vacuole,PV)形成及胞内弓形虫的增殖调控等方面发挥着重要作用,是具潜力的疫苗候选抗原分子之一.本文就ROPs家族重要成员特性、表达载体选择及其核酸疫苗在动物实验中的免疫原性,以及免疫保护作用等方面进行了概述.
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体内电穿孔技术及其在DNA疫苗中的应用
DNA疫苗(又称"裸"DNA或核酸疫苗)是一种新型的、具有巨大发展潜力的亚单位疫苗,即为携带保护性抗原基因的质粒载体或重组病毒载体,接种后可在哺乳动物细胞内表达保护性抗原,以刺激机体产生保护性的体液免疫和细胞免疫.
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日本血吸虫病核酸疫苗研究进展
血吸虫病是严重危害人类健康的寄生虫病,寻找新的杀虫药物和开发研制有效抗血吸虫疫苗已成为刻不容缓的工作.随着现代分子生物学及免疫学的发展,血吸虫病疫苗已由减毒活疫苗、基因重组抗原疫苗发展到核酸疫苗等阶段[1-2].疫苗是20世纪重要的公共卫生成就之一[3].
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免疫佐剂的研究进展
目前正在开发的新型疫苗有合成肽疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、转基因植物口服疫苗等,这些新型疫苗具有良好的抗原特异性和低毒性.但由于其抗原分子小、纯化程度高,疫苗的免疫原性较差.因此需要安全有效的佐剂来增强疫苗的效力.近年来佐剂的发展迅猛,多种新型佐剂层出不穷,人们对佐剂的作用机理亦有更深入的认识.本文对近年来佐剂的研究进展作一综述.
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恶性黑素瘤核酸疫苗免疫影响因素及对策
核酸疫苗是近年发展起来的一项新的免疫治疗技术,它是将抗原基因克隆到特定的载体,使其进入体内后表达并诱导机体产生相应的细胞和体液免疫反应.构建核酸疫苗的关键是选择合适的目的基因并使用高效的载体.核酸疫苗免疫治疗的效果受多种因素的影响,很多研究通过探讨不同的优化策略显著提高了其免疫作用,在恶性黑素瘤的实验治疗中已经取得了良好的效果,并且具有较好的应用前景.
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抗动脉粥样硬化核酸疫苗纳米冻干剂的研究
目的:碱裂解法提取编码胆固醇酯转运蛋白的质粒(简称pCETP)作为核酸疫苗,并制成适合鼻腔递送的载核酸疫苗壳聚糖纳米冻干剂.方法:碱裂解法大量提取抗动脉粥样硬化核酸疫苗,以壳聚糖(简称CS)为非病毒载体,复凝聚法制备pCETP/CS纳米粒,正交设计筛选佳pCETP/CS纳米冻干剂处方.结果:提取了纯度可靠的pCETP,制得的pCETP/CS冻干剂具有较高的包封率(94.6%)和载药量(27.3%),重分散后纳米粒粒径为(375±18)nm,pCETP浓度可达4000μg·mL-1,较冻干前提高40倍.结论:pCETP/CS冻干剂具有良好的稳定性和重分散性,为适合鼻内递送的载基因微粒制剂,具有较好的研究前景.
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一种针对血管紧张素Ⅱ的新型抗肾性高血压核酸疫苗的构建及药效
从免疫学的角度出发,设计一种以血管紧张素Ⅱ为功能表位的DNA疫苗,考察其药效及安全性,-并试图阐释其作用机制.抗高血压核酸疫苗以6段血管紧张素Ⅱ为核心,乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)为免疫载体,为克服白体的免疫耐受,又以白介素Ⅳ作为佐剂.肌肉注射肾性高血压模型大鼠,考察该疫苗的免疫原性及药效.结果:试验表明肌肉注射该疫苗能诱导机体产生持续8周的高滴度特异性抗体,有效降低血液中的血管紧张素Ⅱ含量,同时降低模型大鼠的收缩压20 mmHg,降低舒张压9 mmHg.此外,组织病理学检查表明,该核酸疫苗能明显抑制心肌纤维化的发展,有效逆转心肌肥厚.结论:血管紧张素Ⅱ作为高血压的有效靶标,可通过疫苗免疫途径进行阻断.该研究为高血压疫苗的研究提供了一种新的思路,具有较好的应用前景.
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一种高免疫原性抗胃泌素释放肽核酸疫苗的构建及其在体内对前列腺癌移植瘤的抑制作用
对多株肿瘤细胞的研究表明胃泌素释放肽((GRP)可作为生长因子刺激多种肿瘤的生长,并提示GRP可作为肿瘤免疫治疗的靶点.该研究构建了一系列抗GRP的核酸疫苗以激活针对GRP特异性的体液免疫应答,达到阻断GRP的目的.为打破机体已建立的GRP免疫耐受,将6个串联重复的B细胞表位GRP18～27作为抗原插入到真核表达质粒载体pCR3.1中,并辅之以多种免疫分子佐剂以达到增强核酸疫苗免疫原性的目的.构建的抗GRP核酸疫苗免疫小鼠后,pCR3.1-VS-HSP65-TP-GRP6-M2免疫组诱导出的特异性针对GRP的抗体滴度显著高于其它疫苗免疫组,并在随后的体内抗肿瘤实验中显著的抑制了GRP依赖性的RM-1移植瘤的生长.构建的这种高免疫源性和高效抑制肿瘤生长的抗GRP核酸疫苗为针对GRP依赖性的肿瘤及其并发症的免疫疗法提够了一种新的策略.
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国际治疗性肿瘤疫苗的开发与研究进展
肿瘤是全球人类第二大死因.一些肿瘤通常难以用像手术、放疗和化疗等常规治疗方法治疗,但可用肿瘤疫苗帮助刺激人体的免疫应答使其得到控制.将疫苗用于由诸如乙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒(HPV)等致瘤病毒引起的感染现已非常成功地降低了这些感染导致的肿瘤发病率.治疗性肿瘤疫苗从免疫疗法兴起之初就给人们带来了很大的希望.尽管治疗性肿瘤疫苗在临床试验取得一些成功并有一种治疗前列腺肿瘤的疫苗获得批准,但大多数治疗性疫苗仍在临床试验之中.为了了解国际治疗性肿瘤疫苗的开发与研究现状,依据美国药物研究与生产商协会(PhRMA)近发布的报告及临床试验数据库(Clinicaltrials.gov)与相关新药数据库中的数据,重点对进入Ⅲ期临床试验的3种抗原疫苗、3种肿瘤细胞疫苗、6种树突状细胞疫苗、5种核酸疫苗和2种其他治疗性肿瘤疫苗进行了分析和综述.分析结果表明,这19种肿瘤疫苗中许多在中期分析报告中,无论是在延长无复发生存率(RFS)和总生存率(OS)方面,还是在耐受性、安全性等方面,都显示出良好的开发前景.
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不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因真核质粒的构建及表达
目的:构建不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable Haemophilus influenzae,NTHi)外膜蛋白P6(outer membrane protein P6,P6)真核表达的重组质粒,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础.方法:以NTHi基因组为模板,扩增编码P6蛋白的基因片段,酶切、纯化P6基因与真核载体pcDNA3.1/HisA后进行连接,之后转化并筛选含有目的基因的重组质粒pcDNA3.1/HisA-P6;将重组子转染至HeLa细胞,荧光蛋白法检测其表达产物.结果:经质粒PCR、酶切、测序证实插入的基因片段为NTHi-P6蛋白编码基因;荧光显微镜下显示,该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白.结论:成功地构建了真核重组质粒pcDNA3.1/HisA-P6,并在HeLa细胞中表达.
关键词： 不可分型流感嗜血杆菌 外膜蛋白P6 核酸疫苗 真核表达质粒 -
HBsAg核酸疫苗诱导H-2b小鼠体液免疫应答的初步研究
目的：观察adw和adr亚型HBV PreS2+S核酸疫苗单一或联合HBcAg核酸疫苗诱导的小鼠体液免疫反应。方法：C57BL/6小鼠23只随机分为4组：pJW4303组(P组)、pJW4303/S2+S(adw亚型)组(W组)、pJW4303/S2+S(adr亚型)组(R组)、pJW4303/S2+S(adr)+pJW4303/HBc组(R+C组)。免疫方法为每只小鼠每次肌注相应质粒DNA 100 μg(100 μl)。免疫程序为0、2、4周。于第0、2、4、6、8周采集小鼠血清，用ELISA法检测血清抗-HBs和抗-HBc。结果：于第3次免疫后4周W组、R组、R+C组小鼠血清全部检出抗-HBs，抗体含量随免疫次数增多而增加，抗-HBs浓度高达22 329 IU/L，与P组(对照质粒组)相比差异有显著性(P<0.01)，但各核酸疫苗组之间差异无显著性(P>0.5)。抗-HBc在第1次免疫后2周即在R+C组全部出现，抗-HBs和抗-HBc在P组始终未检出。结论：adw和adr亚型HBV PreS2+S核酸疫苗和HBc核酸疫苗能诱导H-2b小鼠产生较强的体液免疫反应，联合HBc核酸疫苗有助于抗-HBs的早期产生。
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猕猴对乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗的特异性细胞免疫应答
目的观察乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗即HBcAg核酸疫苗(pJW4303/HBc)免疫猕猴的特异性细胞免疫应答.方法猕猴分别在第0、2、4、6个月肌肉注射法接种核酸疫苗(pJW4303/HBc)或对照质粒(pJW4303);ELISA法检测猕猴外周血单个核细胞(PBMC),经特异性抗原(HBcAg)刺激后,培养上清中人白细咆介素-4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)以及猕猴血清中抗-HBcIgG亚类水平;3H-TDR掺入法测定猕猴PBMC特异性增殖反应.结果接种核酸疫苗后猕猴PBMC培养上清中以IFN-γ升高为主.血清中特异性抗体(抗-HBc)IgG亚类以IgG2占优势.免疫组猕猴PBMC抗原特异性增殖反应明显增强,增殖指数达3.83,与对照猕猴相比有显著差异.结论pJW4303/HBc核酸疫苗能有效诱导猕猴的特异性细胞免疫应答.
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HBV中片段表面抗原及E抗原真核表达质粒的构建与体外表达
目的构建乙型肝炎病毒(HBV)中片段表面抗原真核表达质粒和E抗原真核表达质粒.方法将编码HBV中片段表面抗原(preS2+S)的基因片段和E抗原(HBeAg)的基因片段分别插入真核细胞表达载体(pJW4303)中.构建成的重组体经筛选鉴定后,再转染哺乳动物细胞,检测表达产物.结果电泳鉴定显示目的基因片段正确插入了表达载体.经筛选、纯化的阳性克隆转染哺乳动物细胞后可表达preS2+S和HBeAg.结论 HBV中片段表面抗原真核表达质粒(pJW4303/HBV-S2.S)和E抗原真核表达质粒(pJW4303/HBe)构建成功.
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密码子优化对乙肝病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫原性的影响
目的:观察密码子优化能否增强乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的免疫原性.方法:根据乙型肝炎病毒(adr亚型)表面抗原中蛋白(MHBs)的氨基酸序列,在不改变其氨基酸序列的基础上,设计并人工合成了密码子优化的基因,并将该基因克隆到核酸疫苗载体pSW3891中,构建了密码子优化的表达MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr/opt,简称opt).用上述核酸疫苗与表达野生型MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr,简称adr)及空载体质粒pSW3891一起瞬时转染293T细胞,应用蛋白质印迹法检测转染细胞中MHBs的表达.采用肌肉注射法,以opt、adr及pSW3891,分别对BALB/c小鼠进行免疫.用EIJSA方法检测免疫后小鼠血清中HBs抗体的滴度,ELISPOT法检测免疫小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞.结果:opl和adr均可在体外293T细胞中高效表达,且opt的蛋白表达量要高于野生型.opt免疫组小鼠特异性抗体滴度和免疫小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ脾细胞数量都要显著的高于adr免疫组小鼠.结论:密码子优化可以增强乙型肝炎病毒DNA疫苗在体外的蛋白表达量及免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫原性.
