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新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗在中国猕猴体内免疫原性初步研究
目的:观察乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗在中国猕猴体内的体液和细胞免疫应答.方法:实验用中国猕猴实验组、对照组各2只,分别在第0、8、16、24、48周肌肉注射法接种核酸疫苗(pSW3891/MHBs)或对照载体(pSW3891).ELISA法检测中国猕猴血清抗-HBs,CFSE-PI染色FCM(流式细胞术)法测定中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应.结果:实验组中国猕猴血清抗-HBs滴度在72周达到高峰,高滴度分别为1:6 400和1:12 800,对照组抗-HBs滴度始终保持在1:50.实验组中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应明显增强,细胞分裂指数分别为18.64和14.70,而对照组细胞分裂指数分别为1.62和2.61.结论:建立了CFSE-PI染色流式细胞仪检测法来检测中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg抗原特异性增殖反应,方法创新,实用可靠.新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗pSW3891/MHBs在中国猕猴体内能产生良好的特异性体液和细胞免疫应答.
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乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达
目的:构建可同时表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段的双表达核酸疫苗.方法:将HBcAg和FL胞外段的基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入真核双表达载体pIRES,获得含双基因片段的表达质粒;再取该表达质粒中的内部核糖体切入位点(IRES)序列和基因片段克隆入pJW4303载体中,获得相应的双表达核酸疫苗,经筛选鉴定后,以293T细胞瞬时表达检测两基因的表达水平.结果:构建成功以pIRES、pJW4303为载体的4种HBcAg和FL胞外段的双表达核酸疫苗,体外表达证实HBcAg和FL胞外段均能高效表达,基因位于IRES上游时表达水平较高.结论:用IRES元件实现了HBcAg和FL胞外段双表达核酸疫苗的构建,pJW4303为载体的核酸疫苗两基因表达水平优于pIRES为载体的核酸疫苗.
关键词： 乙型肝炎病毒核心抗原 Flt3配体 双表达载体 核酸疫苗 -
严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白核酸疫苗的构建及免疫原性研究
目的:构建SFTSV的核蛋白核酸疫苗并探讨其免疫原性.方法:采用PCR方法扩增SFTSV核蛋白基因,并用引物引入限制性内切酶酶切位点,克隆入载体pJW4303.经酶切和测序鉴定正确的质粒,用PEI瞬时转染HEK293T细胞,用免疫印迹法鉴定核蛋白的表达.同时以质粒pJW4303作为阴性对照,免疫BALB/c小鼠,酶联免疫法验证其免疫原性.结果:成功构建质粒pJW4303-N,经Western blot证实SFTSV核蛋白能够在HEK293T细胞中表达.ELISA检测免疫后小鼠血清特异性IgG抗体及其亚型发现,IgG抗体及其亚型较免疫前明显升高,亚型中以IgG2a升高为主.结论:SFTSV核蛋白核酸疫苗pJW4303-N具有良好的免疫原性,为进一步研究SFTSV核蛋白奠定了基础.
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乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗对猕猴的体液免疫原性观察
核酸疫苗(DNA疫苗)能够有效地刺激机体的特异性免疫应答已经成为共识.鉴于乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)是机体细胞毒性T细胞(CTL)识别和攻击HBV感染肝细胞的主要靶抗原,我们构建了HBcAg核酸疫苗,并已观察到该核酸疫苗经不同接种方法免疫不同品系小鼠均可引起特异性体液免疫和细胞免疫应答.为进一步观察该核酸疫苗对非人灵长类动物的免疫原性,我们用该核酸疫苗接种猕猴,发现猕猴对该核酸疫苗具有良好的抗体应答反应.
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GRP78核酸疫苗在非小细胞肺癌模型中的抗肿瘤作用研究
目的:研究GRP78核酸疫苗对非小细胞肺癌的预防作用及生存期影响.方法:将携带GRP78基因的真核表达载体肌肉内注射免疫C57BL/6小鼠,完成3次免疫后,接种小鼠非小细胞肺癌细胞(Tc-1),以此来观察该疫苗对非小细胞肺癌的预防作用及生存期影响.结果:免疫后的治疗组肿瘤生长体积小于对照组,平均生存期比对照组延长了25天,免疫细胞分泌细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)的水平和对靶细胞的杀伤率明显高于对照组.结论:GRP78核酸疫苗能够提高机体免疫细胞对非小细胞肺癌的杀伤能力,延缓肿瘤生长,延长生存期.
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甲型H1N1流感病毒单克隆抗体的制备及其功能研究
目的 获得分泌特异性抗H1N1亚型(A/California/04/2009)猪流感病毒单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞并探索其分泌抗体的功能.方法 以表达血凝素蛋白H1(A/California/04/2009)的DNA疫苗为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS1骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过间接ELISA筛选分泌抗H1N1亚型(A/California/04/2009)抗体的杂交瘤细胞,进一步亚克隆筛选单一、稳定分泌其抗体的细胞株.结果 获得能稳定分泌抗流感病毒血凝素H1亚型的单克隆抗体杂交瘤4株,分别命名为41H2、68E5、41E7和26D11.其中68E5、41E7和26D11为IgG1 (K),41H2为IgG2a(K).运用Lenti-pseudovirus方法测试显示,26D11可识别结构性位点,具有H1N1( A/California/04/2009)专一性较强的中和能力,是中和性抗体.Western blot检测显示,41H2和41E7为阳性,识别线性位点.特异性实验表明,26D11只与H1(A/California/04/2009)亚型流感病毒发生特异性反应,而不与其他16个HA亚型流感病毒发生交叉反应,显示出良好的特异性.结论 用单克隆抗体杂交瘤技术成功制备了甲型H1N1流感病毒的单克隆抗体.
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汉滩病毒核酸疫苗滴鼻免疫小鼠表达动力学研究
目的构建汉滩病毒DNA疫苗,考查小鼠鼻内接种DNA疫苗后的基因组织定位及表达动力学,为进一步研究汉滩病毒DNA疫苗粘膜免疫的疗效作前期准备.方法采用PCR法从PJSA1175-S质粒扩增汉滩病毒的S基因片段后装入PcDNA3.1B(-)载体,并以此候选DNA疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠,在不同时间、不同部位取其组织抽提基因组DNA和组织总RNA,用PCR及RT-PCR检测质粒的分布和表达动力学.结果构建了汉滩病毒DNA疫苗PcDNA3.1B-S1.3.免疫接种该疫苗第1天后在小鼠鼻咽、肺、肾、肝、脾、小肠等组织中均有质粒分布;第1周内上述组织中均可检测到特异mRNA,第2周起小肠、肝及肾中特异mRNA消失.结论成功构建了PcDNA3.1B-S1.3DNA疫苗,构建的疫苗滴鼻免疫后在小鼠体内得到广泛的分布及表达.
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新型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的免疫原性研究
目的观察新型乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗的免疫原性.方法以新型人体应用载体质粒Psw3891构建MHBs核酸疫苗(Psw3891/MHBs/adr),对照组和实验组Balb/c小鼠分别基因枪法免疫对照载体质粒(Psw3891)和MHBs核酸疫苗,采用酶联免疫吸附试验检测抗HBs,LDH释放测定法检测小鼠特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤活性.结果 MHBs核酸疫苗可在体外高效表达,免疫小鼠后可产生高滴度抗HBs,血清阳性终点滴度达1∶97 200,小鼠脾细胞HBs特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性达78.81%.结论新型MHBs核酸疫苗在Balb/c小鼠实验中表现出良好的体液和细胞免疫原性.
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基因疫苗的研究进展及临床应用
基因疫苗是近10年来发展起来的新型疫苗.自1990年Woff等发现直接肌肉注射裸DNA质粒,不经任何载体手段即可在肌细胞内获得有效表达蛋白以来,基因疫苗的研究不断深入.1993年Ulmer等率先应用流感病毒基因进行疫苗的研究,之后研究范围不断拓宽.目前基因疫苗的研究已涉及到病毒、衣原体、支原体、螺旋体、细菌、寄生虫以及癌症等诸多领域,一些基因疫苗的研究已处于Ⅰ/Ⅱ期临床研究阶段.
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重组铜绿假单胞菌外毒素A和pcrV基因质粒的构建及真核表达
目的：外毒素A（ toxA基因编码）是铜绿假单胞菌毒力强的因子之一，PcrV（ pcrV基因编码）是铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统的关键调控因子之一。文中旨在构建重组toxA和pcrV基因的铜绿假单胞菌核酸疫苗，并在HEK-293细胞中表达目的蛋白。方法 PCR法从铜绿假单胞菌基因组基因中扩增出 toxA和pcrV基因，点突变法对toxA基因进行减毒优化，随后将突变的toxAm基因和pcrV基因分别插入pIRES真核表达质粒的2个多克隆位点，构建真核双表达重组质粒pIRES-toxAm-pcrV。脂质体法将pIRES-toxAm-pcrV瞬时转染入HEK-293细胞，通过Western blot检测toxAm及pcrV在真核细胞中的表达。结果构建的真核表达质粒pIRES-toxAm-pcrV，经脂质体转染HEK-293细胞后，在其细胞内检测到目的蛋白的表达。结论成功构建pIRES-toxAm-pcrV表达载体并在转染的真核细胞中得以有效的表达，为研究铜绿假单胞菌预防性疫苗奠定了实验基础。
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人癌胚抗原cDNA的克隆与真核表达质粒的构建
[目的]将人癌胚抗原(CEA)cDNA克隆到真核表达载体pIRES中,构建真核表达质粒pIRES-CEA,以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达,并为下一步连接上热休克蛋白基因(HSP70)从而构建CEA-HSP融合核酸疫苗作准备.[方法]从CEA阳性的大肠癌组织中提取总RNA,经RT-PCR方法获取人癌胚抗原cDNA,用内切酶Xba Ⅰ和Not Ⅰ分别酶切质粒pIRES和CEA cDNA,通过T4连接酶将带有黏性末端的CEA-cDNA插入到pIRES质粒的XbaⅠ和NotⅠ酶切位点上.[结果]通过PCR扩增获得了CEA基因,并将CEA-cDNA正向克隆到载体pIRES中.[结论]已经成功构建了真核表达质粒pIRES-CEA,并为下一步连接上热休克蛋白基因(HSP70)从而构建CEA-HSP融合核酸疫苗作准备.
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HBV S基因重组体的构建及免疫小鼠的实验
目的:探讨HBV核酸免疫的可行性.方法:采用PCR技术,扩增得到编码HBV HBsAg的S基因片段,将其插入到真核表达载体pcDNA3,酶切鉴定并测序确证,得到质粒pcDNA3-S,转染至COS-7细胞表达.将所构建的核酸疫苗免疫小鼠,观察其诱导产生的特异性体液免疫和细胞免疫功能.结果:HBV S基因序列与文献报道一致,转染真核细胞后能表达目的蛋白.免疫小鼠后实验组和阳性对照组抗-HBs阳性率分别为70%(7/10)和80%(8/10),抗体水平分别为(32.14±13.79)mIU/ml和(28.50±11.87)mIU/ml,两者比较无显著性差异(P＞0.05).对照组和空白组抗-HBs均为阴性,小于10 mIU/ml.实验组和阳性对照组的特异性CTL杀伤率在效∶靶比为20∶1时分别为(35.40±4.85)%和(38.20±7.69)%,效∶靶比为10∶1时则分别为(23.95±3.98)%和(24.55±3.59)%, 两者比较无显著性差异(P＞0.05).对照组和空白组的CTL杀伤率在效∶靶比为20∶1和10∶1时均小于5%.结论:pcDNA3-S直接经肌肉免疫小鼠可诱导产生特异性体液和细胞免疫反应.
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结核分枝杆菌GroEL基因的克隆及真核表达质粒的构建
目的 克隆结核分枝杆菌基因组携带的两组GroEL基因,即GroEL1和GroEL2,它们分别编码热休克蛋白HSP60(cpn60.1)和HSP65(cpn60.2),并构建真核表达质粒.方法 用带有EcoR I和Xba I酶切位点的特异性引物,从结核杆菌H37Rv株中PCR扩增两组GroEL基因,构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-GroEL1和pCDNA3.1-GroEL2,并进行酶切和测序鉴定.结果 成功克隆了结核分枝杆菌两组GroEL基因,酶切鉴定pCDNA3.1-GroEL1和pCDNA3.1-GroEL2构建成功,经DNA测序证实,载体上插入的序列与GenBank公布的序列一致.结论 获得了结核分枝杆菌GroEL1和GroEL2基因,成功地构建了含GroEL1和GroEL2基因的真核表达质粒,为研究其作为核酸疫苗在免疫学方面作用提供材料.
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核酸疫苗与寄生虫核酸疫苗的研究进展
本文较为详细地叙述了核酸疫苗的优点、作用机理,简略介绍了核酸疫苗在疟疾、血吸虫病、囊虫病和利什曼原虫病的应用与研究进展.
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日本血吸虫P14基因纳米微球-DNA疫苗的免疫保护作用
目的 探讨日本血吸虫碱性调宁蛋白样蛋白P14基因的重组真核表达载体(pcDNA3.1(+)-SjP14)对小鼠血吸虫感染的免疫保护作用.方法 制备无内毒素pcDNA3.1 (+)-SjP14及纳米微球DNA疫苗,将雌性BALB/c小鼠随机分为3组,每组10只,分别为生理盐水对照组、pcDNA3.1(+)-Sj P14组及纳米微球-DNA疫苗组.各组小鼠分别肌肉注射生理盐水和pcDNA3.1(+)-Sj P14、纳米微球DNA疫苗100μg/鼠·次,每2周免疫一次,共3次.末次免疫后2周,尾蚴攻击,6w后处死小鼠,收集成虫,计算减虫率；同时留取肝脏,部分消化后在显微镜下行虫卵计数,计算减卵率.结果 pcDNA3.1(+)-Sj P14p核酸疫苗能明显提高小鼠的抗血吸虫感染能力,减虫率和减卵率分别达到44.6％和61.6％；纳米微球-DNA疫苗免疫能进一步提高小鼠抗血吸虫感染作用,减虫率和减卵率分别提高至56.2％和73.5％.结论 pcDNA3.1(+)-Sj P14核酸疫苗有一定程度的抗血吸虫感染作用,pcDNA3.1(+)-SjP14-纳米微球复合物疫苗免疫能增强小鼠对血吸虫感染的免疫保护作用.
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pCMV-DKK1/IL10双表达核酸疫苗的构建及其免疫保护效果研究
目的:构建双表达人Dickkopf 1(DKK1)表位序列和IL-10功能序列的核酸疫苗载体,检测其对胶原诱导关节炎小鼠的保护作用.方法:选择4段免疫原性较高的片段并与T细胞表位片段连接,将此基因片段与IL-10的功能片段克隆至pCMV6-XL5载体中,得到pCMV-DKK1/IL10双表达核酸疫苗载体;用此质粒DNA转染COS7细胞并肌肉注射BALB/c小鼠,分别检测核酸疫苗在细胞和小鼠体内的表达;用核酸疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内产生的特异性抗体滴度;制备胶原诱导关节炎小鼠模型,评估核酸疫苗对胶原诱导关节炎小鼠的保护作用.结果:成功构建了pCMV-DKK1/IL10双表达核酸疫苗载体,DKK1重组蛋白和IL-10能够在COS7细胞和小鼠肌肉组织中成功表达;免疫后4周即可检测到高滴度的DKK1抗体;核酸疫苗可以减轻胶原诱导关节炎小鼠的炎症症状和骨破坏的程度.结论:pCMV-DKK1/IL10双表达核酸疫苗对胶原诱导关节炎小鼠具有保护作用,该研究结果为类风湿关节炎的治疗提供了新的思路和方向.
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日本血吸虫SJIR-2纳米微球核酸疫苗的免疫保护性研究
目的：研究日本血吸虫胰岛素受体-2( SJIR-2)纳米微球核酸疫苗对小鼠攻击感染的免疫保护效果。方法构建pEGFP-SJIR-2重组质粒,双酶切鉴定并测序,大量提取pEGFP-SJIR-2质粒,用壳聚糖( CHS)修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物( PLGA)微球包裹,用包裹后的SJIR-2纳米微球免疫小鼠。将40只雌性BALB/c小鼠随机分为4组( n=10),分别注射 PBS、空 pEGFP 质粒、CHS-PLGA 微球和 CHS-PL-GA-pEGFP-SJIR-2微球各100μg免疫小鼠,末次免疫2周后,用日本血吸虫尾蚴攻击感染小鼠,每次免疫及感染尾蚴前收集各组小鼠血清,ELISA法检测各组小鼠血清内免疫球蛋白( IgG)水平的变化。小鼠感染尾蚴42 d后全部剖杀,收集成虫和虫卵并计算减虫率和减卵率。结果成功构建了pEGFP-SJIR-2重组质粒,与PBS组比较, CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2组的成虫数和虫卵数差异有统计学意义( P<0．01)。CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2组的减虫率和减卵率分别为37．36%和46．82%,和PBS组相比,CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2组小鼠血清内IgG水平比明显增高( P<0．01),而pEGFP组和CHS-PLGA组成虫数和虫卵数与PBS组比较差异无统计学意义。结论 SJIR-2纳米微球核酸疫苗对感染血吸虫的BALB/c小鼠有一定的免疫保护效果,对其潜在的候选抗原疫苗的价值尚需深入研究。
关键词： 日本血吸虫 SJIR-2基因 核酸疫苗 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 -
日本血吸虫核酸疫苗的研究进展
血吸虫病(schistosomiasis)是呈世界性分布的严重危害人类及家畜的寄生虫病,发病率仅次于疟疾(malaria).全世界至少2亿血吸虫病感染者,流行区约有6亿人受其威胁[1].我国是受日本血吸虫病危害为严重的国家之一,全国血吸虫病流行县(市、区)454个;累计达到血吸虫病传播消灭标准的县(市、区)265个,2009年度,我国实有患者36.6万人.
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幽门螺杆菌ureI核酸疫苗免疫活性的初步研究
目的 观察幽门螺杆菌ureI核酸疫苗诱导C57BL/6小鼠产生体液免疫应答及细胞免疫应答水平.方法 重组质粒pcDNA3.1(+)/ureI、空质粒pcDNA3.1(+)及PBS分别肌注免疫C57BL/6小鼠.ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平以及脾淋巴细胞培养上清中IL-4和IFN-γ含量,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,PCR和免疫荧光组化法检测ureI基因和蛋白表达.结果 pcDNA3.1(+)/ureI能够诱导小鼠产生特异性IgG抗体,该组小鼠脾淋巴细胞经UreI重组蛋白刺激后,其刺激指数和培养上清中IL-4、IFN-γ含量明显升高; ureI基因可在小鼠肌细胞中有效表达.结论 pcDNA3.1(+)/ureI核酸疫苗能刺激C57BL/6小鼠产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答,为进一步研究该疫苗的免疫保护作用奠定了基础.
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日本血吸虫调宁蛋白样蛋白P14基因疫苗对小鼠免疫保护作用研究
目的 研究日本血吸虫调宁蛋白样蛋白P14基因DNA疫苗对小鼠免疫保护作用.方法 制备无内毒素DNA疫苗,用于免疫小鼠.将雌性BALB/e小鼠随机分为4组,每组10只.生理盐水组给予100μL／鼠／次;空质粒组100 μg/鼠／次、pcDNA3.1 (+)-SjP14组、pcDNA3.1(+ )-SjP14+pcDNA3.1(+)-SjGST组分别给予100μg／鼠／次;每2w免疫一次,共3次.末次免疫后2w.经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(30±1)条／鼠.尾蚴攻击6周后解剖小鼠,收集成虫,计算减虫率;同时留取肝脏,部分消化后在显微镜下行虫卵计数,计算减卵率,部分肝脏用于组织病理学分析(HE染色法).观察肝细胞变化及肉芽肿情况.结果 与NS对照组比较,pcDNA3.1(+)-Sj P14p核酸疫苗组减虫率和减卵率分别达到44.6％和61.6％;sjP14核酸疫苗与SjGST核酸疫苗联合免疫组减虫率和减卵率分别提高至56.2％和73.5％.肝组织切片镜下显示,pcD-NA3.1(+)-SjP14组肝脏病变较生理盐水组和空质粒组明显减轻,pcDNA3.1(+)-SjP14+pcDNA3.1(+)-SjGST组肝脏损伤程度轻,虫卵肉芽肿周围炎症反应轻,肉芽肿面积较小.结论 pcDNA3.1(+)-Sj P14核酸疫苗有一定程度的抗血吸虫感染作用,pcDNA3.1(+)-SjP14与pcDNA3.1 (+)-SjGST疫苗联合免疫能增强小鼠对血吸虫感染的保护.
