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约氏疟原虫Pys48核酸疫苗免疫效应的观察
目的 探讨约氏疟原虫(P.yoelii17XL)Pys48核酸疫苗免疫BALB/c小鼠后免疫功能特点.方法 将Pys48核酸疫苗肌肉内注射免疫BALB/c小鼠,并以空质粒注射组和正常小鼠作为对照,3次免疫后4w,处死小鼠;采用ELISA分别对疫苗免疫组和对照组小鼠脾细胞上清的IFN-γ、IL-4进行检测;流式细胞术检测脾中树突状细胞(Dendritic cells,DCs)亚群数量,表达TLR9的DCs的百分含量,以及分泌IgG抗体的B细胞百分含量.结果 核酸疫苗免疫组IL-4水平较空质粒对照组和正常对照组均明显升高(P<0.05),IFN-γ水平与其它两组相比差异无统计学意义;脾中髓样DCs(mDCs)的数量在3组间无明显差异,浆细胞样DCs(pDCs)的数量在核酸疫苗免疫组出现有意义地升高,且表达TLR9的DCs的百分含量及分泌IgG抗体的B细胞百分含量均明显高于空质粒对照组和正常对照组(P<0.05).结论 Pys48核酸疫苗具有良好的免疫原性,免疫小鼠后,通过增强特异性体液免疫发挥疫苗效应.
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弓形虫pcDNA3-p30-ROP2-HSP70复合核酸疫苗免疫保护性的研究
目的 研究pcDNA3-p30-ROP2- HSP70复合核酸疫苗的免疫保护作用.方法 150只BALB/c小鼠随机分为5组,其中3实验组,每鼠分别肌肉注射pcDNA3-p30-ROP2-HSP70、pcDNA3-p30-ROP2、pcDNA3-ROP2各50 μg;2对照组每鼠分别注射pcDNA3空质粒50 μg、PBS 50 μL.共免疫3次,每次间隔2 w,末次量加倍.末次免疫后2w,各组分别取6只小鼠的血清和脾组织,检测CD+4、CD+8及各细胞因子.各组其余小鼠腹腔注射RH株弓形虫速殖子500个/每鼠,观察其存活时间等.结果 pcDNA3-p30-ROP2-HSP70复合核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应.小鼠血清抗体滴度高并能识别重组ROP2蛋白抗原；免疫接种后CD+4和CD+8均增殖明显,组间有显著性差异(F=45.00,P＜0.01;F=15.01,P＜0.01),实验组CD+4/CD+8比值增加明显,各组间有显著性差异(F=9.17,P＜0.01)；其脾、淋巴结细胞培养液及血清中白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-12、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)均有不同程度的升高,尤其是血清中升高为显著.弓形虫攻击感染后,实验组与对照组比较,实验组小鼠存活时间明显延长.结论 该复合核酸疫苗具有较强的免疫原性,能产生良好的免疫保护作用.
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汉滩病毒核酸疫苗滴鼻及皮肤划痕免疫小鼠的比较研究
目的 观察汉滩病毒的DNA疫苗滴鼻及皮肤划痕免疫诱导机体产生的免疫应答,探索汉滩病毒DNA疫苗新的免疫途径.方法 采用不同剂量50 μg、10μg、1μg的裸露质粒pcDNA3.1B-S1,3分别进行滴鼻及皮肤划痕免疫小鼠,采用ELISA方法分别检测血清及粪便中特异性抗体变化,观察其诱导的系统和黏膜免疫反应的差异.结果 用汉滩病毒核酸疫苗免疫小鼠,通过表皮划痕方式其诱导体液免疫在50μg剂量时与滴鼻途径相当,在10 μg及1 μg低剂量时优于滴鼻途径,但在黏膜免疫方面,其明显不如滴鼻途径.结论 滴鼻免疫对特异的黏膜免疫激发作用明显优于皮肤划痕,疫苗的滴鼻免疫途径较皮肤划痕有着明显的优势.
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多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗诱生免疫应答的实验研究
目的观察多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗免疫BALB/c小鼠引起的体液和细胞免疫应答.方法30只BALB/c小鼠随机分成3组:Ⅰ组,肌注空质粒(pcDNA3.1)100μg/鼠;Ⅱ组,肌注多房棘球绦虫elp基因真核表达重组质粒(pcD-ELP)100μg/鼠;NS组,肌注等体积生理盐水.每2周免疫1次,共3次.ELISA方法检测免疫后不同时间产生的特异性IgG1,IgG2a和IgG 2 b水平.双抗体夹心ELISA法检测免疫鼠脾脏单个核细胞(PMNC)在受到特异抗原刺激后,产生IL-4、IL-12和IFN-γ的能力,3H-TdR掺入法检测脾淋巴细胞的增值能力.结果首次免疫后4周,Ⅱ组小鼠血清可检测到特异性IgG1、IgG2a和IgG2b抗体,随免疫时间和免疫次数的增加3种特异性抗体的OD值逐渐增高,实验结束时(首次免疫后7周)3种特异性抗体OD值均高.Ⅰ组和Ⅱ组小鼠脾PMNC培养上清中IFN-γ浓度分别为50 pg/ml和55pg/ml,受特异抗原刺激后分别为44 Pg/ml和101.5 Pg/ml.NS组IFN-γ及各组IL-4和IL-12均未检出.Ⅰ组和Ⅱ组小鼠脾淋巴细胞增殖能力增高,其淋巴细胞CPM值分别为NS组的85倍和123倍,受到特异抗原或刀豆素刺激其淋巴细胞增殖更明显.结论多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗可刺激BALB/c小鼠同时产生很强的细胞免疫和体液免疫应答.
关键词： 多房棘球绦虫elp基因 核酸疫苗 免疫应答BALB/c小鼠 -
肺炎嗜衣原体MOMP和人IL-2融合基因DNA疫苗的免疫原性研究
目的 构建肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)主要外膜蛋白(MOMP)单基因及momp和人IL-2融合基因的真核表达载体并比较其免疫反应性,为研制Cpn核酸疫苗提供理论和实验依据. 方法 扩增Cpn momp及人IL-2基因并将二者融合,将momp和momp-IL-2分别克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体;制备纳米粒DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,免疫荧光组化法检测重组质粒在小鼠组织内的稳定表达;ELISA法检测小鼠血清中的特异性抗体和小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ水平;MTT法测定脾淋巴细胞特异性增殖反应. 结果 成功制备了pcDNA3.1(+)-momp和pcDNA3.1(+)-momp-IL-2的纳米核酸疫苗;Cpn momp单基因和momp-IL-2融合基因核酸疫苗均能刺激小鼠产生特异性抗体,且pcDNA3.1(+)-momp-IL-2能诱导小鼠产生更高效价的特异性抗体(P<0.05);pcDNA3.1(+)-momp-IL-2诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ的量及对特异抗原的刺激指数明显高于pcDNA3.1(+)-momp.结论 Cpn momp单基因核酸疫苗和momp-IL-2融合基因核酸疫苗均能刺激小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答;pcDNA3.1(+)-momp-IL-2的免疫效果强于pcDNA3.1(+)-momp.
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幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI的真核载体构建、表达及抗原性研究
目的 构建含人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(UreI)的真核表达的重组载体,并在COS-7细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础.方法 以原核表达质粒pET32a(+)/UreI为模板,扩增UreI编码基因片段,将目的 基因与同样进行酶切、纯化的载体pEGFP-N1进行连接,而后转化并筛选含有目的 基因的重组载体pEGFP-N1/UreI,并在COS-7细胞中表达,以荧光蛋白和Western blot法检测其表达产物.结果 经酶切、测序证实插入的基因片段为H.pylori UreI蛋白编码基因;荧光显微镜下和Western blot法等检测显示,该重组质粒能够在COS-7细胞中表达目的 蛋白,同时能够被H.pylori阳性患者血清所识别.结论 成功地构建了真核重组载体pEGFP-N1/ UreI,并在COS-7细胞中表达.
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Ag85B核酸疫苗的免疫原性和保护性研究
扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体pJW4304,转染COS-7细胞后,Western blot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达.用该质粒免疫C57BL/6小鼠,免疫三次后,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体,抗体滴度达到1:102400,(γ-干扰素测定表明,免疫动物的干扰素含量达到11603±104 pg /ml.实验结果说明Ag85B核酸疫苗在实验动物体内引起了较强的免疫应答.三次免疫后经静脉强毒攻击,免疫组小鼠肺脏和脾脏的细菌数比对照空载体组分别减少了1.5和15倍以上.本研究表明,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率.
关键词： 结核分枝杆菌病 Ag85B分泌蛋白抗原 核酸疫苗 免疫原性 保护效率 -
日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区cDNA核酸疫苗的研究
目的为研究血吸虫性别特异性表达基因的核酸免疫特性.方法本研究将所克隆的编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因保守区cDNA片段克隆到真核表达载体pcDNA3中,得到的重组质粒直接免疫昆明系小鼠,感染血吸虫尾蚴,7周后剖杀小鼠冲虫,进行成虫和虫卵计数.结果其减虫率为32.4%,肝脏减卵率为46.9%,与对照组比较差异显著.结论初步显示血吸虫抱雌沟蛋白基因DNA疫苗具有一定的核酸免疫保护功能.
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日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗血清抗体与抗生殖免疫关系的初步研究
目的探讨日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗(Sj31B1N)抗生殖免疫的可能机理.方法用Sj31B1N免疫小鼠,每2周1次,每次免疫前均尾静脉采血1次,作血清抗体动态变化分析,免疫4次后尾蚴攻击感染.感染后45天,计数成虫负荷和肝、肠组织内虫卵数.结果用Sj31B1N免疫小鼠后第2周部分小鼠血清中出现了抗体,随时间延长,出现抗体阳性组小鼠数量增多,抗体滴度增加.抗体阳性组小鼠与阴性组小鼠对比,成虫减少率为40.6%,肝组织减卵率为48.0%,肠组织减卵率为45.4%.结论核酸疫苗Sj31B1N可有效地诱导小鼠产生抗体,并且具有免疫保护作用.核酸疫苗Sj31B1N所诱导的体液免疫可能是抗日本血吸虫生殖免疫的机理之一.
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日本血吸虫(中国大陆株)22.6kDa抗原编码基因的核酸疫苗研究
为探索日本血吸虫(中国大陆株)22.6kDa抗原(Sj22.6)编码基因用作核酸疫苗的可行性,将pCMV/Sj22.6基因重组质粒经肌肉注射免疫了一批BALB/c小鼠并进行攻击感染试验,结果表明此重组质粒能在小鼠体内持续存在、稳定表达并诱导小鼠产生特异性的抗Sj22.6抗体,但未能诱导有效的保护力.
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日本血吸虫(中国大陆株)22.6kDa抗原编码基因在C2C12细胞内的表达
目的为探索日本血吸虫(中国大陆株)22.6kDa抗原(Sj22.6)编码基因用作核酸疫苗的可行性.方法以PCR法对此编码基因改造后将其亚克隆入真核表达载体质粒pCMV-β并转化入大肠杆菌JM109进行大量扩增.将提纯的pCMV/Sj22.6基因重组质粒在体外转化C2C12真核细胞.结果免疫组化试验证明,该重组质粒能够在体外培养的C2C12细胞中表达Sj22.6抗原.结论表明该重组质粒有用作真核疫苗的可能性.
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编码恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段的核酸疫苗诱导小鼠体液免疫反应的研究
目的初步研究编码恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1)的17区片段的核酸疫苗(VR1012/MSP1-17)诱导小鼠的体液免疫反应.方法 BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠分别经每次每只200μg/100μl和100μg/100μl的VR1012/MSP1-17三闪肌注免疫后,用ELISA间接法检测免疫鼠血清中抗MSP1 17区的抗体.结果两种小鼠均产生明显的抗MSP1 17区的抗体,BALB/c小鼠较C57BL/6小鼠产生的抗体略高,但总体抗体水平不是很高.结论该核酸疫苗具有一定的免疫原性,其保护性仍需进一步研究.
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抗弓形虫核酸疫苗的研究进展
弓形虫是一种呈世界性分布的机会性致病原虫,能感染包括人体在内的190多种哺乳动物和鸟类.据估计,全世界成年人中,弓形虫感染者约占33%.尽管绝大多数弓形虫感染者为隐性,不表现临床症状,但往往是免疫功能低下人群的重要并发症,有时甚至是致死病因.
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弓形虫病核酸疫苗研究进展
弓形虫病是一种由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的人兽共患机会性寄生虫病,对人类健康和畜牧业生产造成威胁.疫苗是防治弓形虫病有效手段之一,弓形虫病疫苗研制经历了下列发展阶段:1.全虫疫苗,包括死疫苗、弱毒活疫苗和减毒活疫苗;2.虫体特异组分疫苗;3.基因工程疫苗;4.核酸疫苗.
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汉坦病毒核酸疫苗研究进展
汉坦病毒引起的疾病是一种人兽共患性疾病,它在世界上有着广泛的流行区域.目前发现汉坦病毒有二十余种血清/基因型,引起人类肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)主要是汉滩病毒(Hantaan Virus, HTNV)、汉城病毒(Seoul Virus, SEOV)、普马拉病毒(Puumala Virus, PUUV)和Dobrava病毒(DOBV),疫源地在亚洲与欧洲.而引起人类汉坦病毒肺综合征(hantavirus pulmonary syndrom, HPS)除辛诺柏病毒(Sin Nombre Virus, SN)外,还发现有纽约病毒(New York Virus, NYV),长沼病毒(Bayou Virus), 黑渠港病毒(Black Creek Canal Virus, BCCV)等,主要在美洲流行.近年来随着分子生物学技术的发展及对汉坦病毒基因结构的深入研究,其流行病学和致病机制正逐步被阐明,汉坦病毒疫苗的研制也有了显著发展.其中核酸疫苗是近年来发展起来的一项新生物技术,具有广阔的应用前景,本文主要就这方面进行简要综述.
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减毒沙门氏菌——真核质粒的导入载体
减毒沙门氏菌可侵入到宿主的Peyer氏集结、肠淋巴结、肝、脾等组织细胞，表达异源抗原，不仅激发出宿主针对伤寒杆菌本身的免疫反应，而且激发出针对其所携带抗原的各种免疫反应，包括局部体液免疫、全身体液免疫和细胞免疫反应，尤其是CTL作用。减毒菌本身可起免疫佐剂作用。由于已减毒，终被宿主清除〔1，2〕。减毒沙门氏菌可通过口服或鼻黏膜〔3〕进行接种，因此，接种方式简单，易于大规模的免疫接种。此外，以减毒沙门氏菌为载体的疫苗制备简单、易于储存和运输、抗原不需提纯，所以可显著降低疫苗的制作成本。因此，减毒沙门氏菌是异源抗原免疫的优良载体。但这方面大量的工作都是将异源抗原基因克隆在原核表达载体上，在减毒沙门氏菌原核环境中进行表达。近年来有实验表明，减毒沙门氏菌可将克隆有异源抗原基因的真核表达质粒携带释放入宿主深部淋巴细胞，使异源抗原基因在淋巴细胞的真核环境中进行表达。因此，减毒沙门氏菌有望成为真核质粒的导入载体，成为核酸疫苗的第三种接种方式，且在本质上不同于核酸疫苗的其他两种接种方式，在核酸疫苗研制中具有新的应用前景。
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核酸疫苗及其免疫机制研究
从20世纪以来，疫苗免疫接种经历了两次重大变革。第一次是由Pasteur等研制开发的减毒或灭活的疫苗(LiveVaccine)，第二次是使用完整生物体的天然成分即亚单位疫苗(Subunit Vaccine)。虽然在一定程度上提高了免疫效应，但安全性不够，尤其是免疫功能低下患者，风险较大。基因工程疫苗不能真实地反映抗原蛋白的高级空间结构，故仅能诱导体液免疫应答，而对预防某些微生物感染有重要意义的细胞免疫应答，则难以诱导。因此人们继续在努力探索和开发新型疫苗，核酸疫苗在基因治疗和转基因技术发展的基础上应运而生〔1〕。
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日本血吸虫噬菌体肽疫苗诱导小鼠免疫保护作用的初步研究
日本血吸虫病是我国五大寄生虫病之一,严重危害人民健康[1],作为预防和控制血吸虫病的一种手段,疫苗的研究具有非常重要的意义.目前,国内外研究的侯选疫苗有照射致弱尾蚴疫苗,可溶性虫卵抗原疫苗,核酸疫苗,基因工程重组疫苗及血吸虫多抗原肽疫苗等.
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Sjcb2 DNA疫苗在血吸虫感染小鼠中的保护性作用研究
目的：研究 S jcb2 DNA疫苗在日本血吸虫病小鼠模型中的保护性作用和机制，为血吸虫疫苗的研究提供有效的候选抗原分子。方法构建pcDNA3．1（＋）/S jcb2核酸疫苗，将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为pcDNA3．1（＋）/S jcb2核酸疫苗组、pcDNA3．1（＋）空质粒组及生理盐水组，每组35只，采用后腿股四头肌注射方法，每次免疫质粒DNA 100μg ，每2周免疫1次，共免疫3次，用日本血吸虫尾蚴攻击感染各组小鼠。PCR及免疫组化法检测 S jcb2基因在小鼠体内的稳定性及表达情况；M T T法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖反应；ELISA法检测小鼠血清中 S jcb2抗体水平及攻击感染前后脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的水平；计数小鼠荷成虫对数和肝脏荷虫卵数。结果疫苗组小鼠均可在小鼠肌细胞中检测到 Sjcb2基因及其抗原的表达；DNA疫苗组T细胞增殖显著增高（P ＜0．05）；ELISA 结果显示疫苗组IFN-γ水平显著增高（P ＜0．05），血吸虫尾蚴攻击感染后各组小鼠IL-4水平显著升高（P ＜0．05）。DNA疫苗组小鼠荷成虫对数及肝脏荷虫卵数与其它组比较显著性减少（P ＜0．05），其减虫率为36．32％，减卵率为60．61％。结论 S jcb2 DNA疫苗接种小鼠后能在小鼠肌细胞中稳定存在和表达；S jcb2可能通过提高IFN-γ和降低IL-4水平调节 T h1细胞亚群产生抗血吸虫感染的保护性作用。
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结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在Vero E6细胞中的表达
构建结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的真核表达质粒,并研究其在Vero E6细胞中的表达情况.采用PCR方法自结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增esat-6基因片段,定向亚克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-esat-6重组质粒;利用脂质体介导的转染技术,将其导入Vero E6细胞,RT-PCR法检测mRNA表达情况,Western-blot法鉴定表达产物.从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出esat-6基因片段,成功构建重组表达质粒pVAC-esat-6;转染esat-6基因的Vero E6细胞,RT-PCR检测可见一条约288bp的目的条带,表达产物经Western-blot鉴定,其相对分子质量约为6000,能被结核病人血清所识别.构建的真核表达质粒pVAC-esat-6能在Vero E6细胞中表达,为结核病核酸疫苗的进一步研究打下基础.
