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血吸虫疫苗的研究进展
人畜共患的血吸虫病的危害是人所共知的.长期以来,人们一直在寻找能够控制与消灭血吸虫病的有效途径.血吸虫疫苗的研究,给人类带来了新的曙光,疫苗的研究仍然是当前的研究热点与难点.湘雅医学院血吸虫病研研室在疫苗的研究方面取得了可喜的成绩,30多个新基因的发现,及对部分新的基因的进一步研究,为血吸虫疫苗的研制提供了大量的科学依据.下面主要从核酸疫苗、表位疫苗和蛋白质疫苗三方面来阐述该研究室血吸虫疫苗的研究进展.
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核酸疫苗--未来的疫苗
随着分子免疫学与基因治疗的进一步开展,新一代疫苗也随之涌现.这包括:合成肽疫苗,重组病毒疫苗及核酸疫苗,其中核酸疫苗为引人注目.核酸疫苗是指由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体质粒构成的重组质粒,直接导入动物细胞内,从而通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,达到免疫的目的.本文对核酸疫苗的构建、作用机制及应用前景作一简要的概述.
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弓形虫棒状体蛋白7真核表达载体的构建及其免疫保护作用
目的：构建弓形虫棒状体蛋白7（ROP7）基因的真核重组表达载体，观察其对小鼠的免疫保护作用。方法根据 GenBank 发表的弓形虫 ROP7序列设计合成一对引物，通过 PCR 扩增 ROP7基因，将其插入真核表达载体pEGFP-C1中构建重组质粒 pEGFP-C1／ROP7（pROP7）。用重组质粒转染 HEK293T 细胞并验证其在细胞内的表达。将36只雌性 BALB ／c 小鼠随机分为3组：磷酸缓冲盐溶液（PBS）对照组、pEGFP-C1对照组和 pROP7实验组。然后用 PBS、pEGFP-C1和 pROP7分别免疫相应组别的小鼠。采用 ELISA 检测小鼠血清特异 IgG 水平，观察弓形虫感染小鼠后的存活时间并评价其免疫保护力。结果PCR 扩增出1728 bp 的目的基因片段，真核表达载体构建成功，且能在 HEK293T 细胞中表达。目的基因的相应蛋白可被羊抗弓形虫多克隆抗体识别。重组质粒免疫的小鼠产生了较高水平的血清抗体。虫体攻击试验中，pROP7实验组小鼠的生存时间较对照组小鼠延长（P ＜0．05）。结论本研究构建的真核表达质粒在对抗弓形虫感染时具有一定的免疫保护作用，为弓形虫基因疫苗的研制提供了参考。
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核酸疫苗研究进展
20世纪初以来,众多疫苗相继出现,为全世界挽救了无数的生命[1].但是,一些传染病和新发的传染病,如流感、丙型肝炎、艾滋病和疯牛病等还没有十分有效的疫苗.这些都证明了传统疫苗能力有限或显得无能为力[2].1990年Wolff[3]等人将DNA重组表达载体注入小鼠的骨骼肌中,结果意外发现载体上的基因在局部肌细胞内表达,且产生了抗体,这一偶然发现导致核酸疫苗的诞生.
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核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV的构建及其免疫活性观察
目的 构建pEGFPN 1-MLAA34-B7 H4IgV核酸疫苗,并检测其免疫活性,探讨核酸疫苗抗白血病效应.方法 采用重叠延伸PCR技术扩增急性白血病相关抗原基因MLAA34和负性共刺激分子B7H4的融合基因(MLAA34-B7 H4IgV),并构建核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV.将28只BALB/c小鼠随机分为P、M、B、MB组各7只,分别在小鼠两侧股四头肌内侧肌内注射磷酸盐缓冲液pEGFPN1、pEGFPN1-MLAA34、pEGFPN1-B7H4IgV、pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV质粒100μg,在0、2、4周各行1次同剂量加强免疫;分别于0、4、8周眼球取血,8周取血后处死小鼠并摘取脾脏.ELISA法检测免疫8周血清中抗体IgG1、IgG2a以及免疫0、4、8周血清细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ,MMT法检测小鼠脾淋巴细胞对单核巨噬细胞THP-1的增殖抑制作用.结果 MLAA34-B7H4IgV融合基因PCR产物电泳检测约为2000 bp,与理论值(1 922 bp)相符;pEGFPN1-MLAA34-B7 H4IgV酶切后电泳检测为5 000～7 500 bp,与理论值(6 655 bp)相符.与同组免疫0周时、同时点P组比较,免疫4、8周时M、B、MB组血清细胞因子IL-2、IL-4水平升高而IFN-γ水平降低(P均＜0.05或＜0.01).与同时点M、B组比较,MB组血清细胞因子IL-2、IL-4水平升高而IFN-γ水平降低(P均＜0.05);M、B组同时点比较,差异无统计学意义.免疫8周,MB组血清IgG1水平高于其他各组(P均＜0.05),其他各组间差异均无统计学意义(P均＞0.05);各组血清IgG2a水平差异均无统计学意义(P均＞0.05).MB组THP-1细胞增殖抑制率高于同效靶比其他各组(P均＜0.05或＜0.01);效靶比为50∶1和25∶1时,M组和B组THP-1细胞增殖抑制率高于高于P组(P均＜0.05),两组之间无差异;效靶比为12.5∶1时,B组THP-1细胞增殖抑制率高于M组、P组(P均＜0.05).结论 成功构建了核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7 H4IgV,该疫苗激活了小鼠体内的细胞免疫和体液免疫,具有明显的抗白血病效应.
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核酸疫苗对慢性乙型肝炎病毒感染的治疗作用
慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是严重危害人类健康的疾病,目前尚无理想的治疗药物.核酸疫苗(基因疫苗)是有希望的治疗措施之一.
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生物材料在核酸疫苗中的应用
核酸疫苗具有很多传统疫苗不能比拟的优势,是现代疫苗研发的新热点.然而,与传统疫苗相比,裸露的核酸疫苗大的缺陷是不能引发足够强的免疫应答.因此,科学家们利用生物材料作为核酸疫苗的载体,以颗粒或非颗粒的形式帮助它克服各种人体障碍进入细胞,并保护其活性,从而提高核酸疫苗的免疫应答强度和效率.设计高效、低毒的疫苗载体有众多因素需要考虑,如疫苗的制备方法和配方比例、生物材料与疫苗之间的相互作用、生物材料的化学和物理性能、材料的微观和宏观形态等.本文就以上因素进行概括总结,以使读者了解生物材料在核酸疫苗方面的研究现状.
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SDF-1基因对HIV-1核酸疫苗诱导的免疫应答
研究SDF-1基因对HIV-1核酸疫苗诱导免疫应答的影响,以探求治疗性HIV-1核酸疫苗的新策略. 将pCI-neoGAG联合SDF-1基因或者pCI-neoGAG单独免疫Balb/c小鼠,采用ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ水平,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖,用乳酸脱氢酶(LDH)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答.研究结果提示: 与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合SDF-1基因免疫组小鼠血清的抗HIV-1p24抗体滴度降低,有显著性差异(p<0.01);而与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合SDF-1基因免疫组小鼠血清的IFN-γ升高,差异显著(p<0.01);pCI-neoGAG联合SDF-1基因免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高于pCI-neoGAG免疫组,有显著性差异(p<0.01).因此,SDF-1基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠,可能增强特异性Th1细胞和CTL反应,SDF-1基因对体液免疫有抑制作用.SDF-1基因对于治疗性HIV-1核酸疫苗是具有较好应用前景的免疫佐剂.
关键词： HIV-1 核酸疫苗 免疫 基质细胞来源的因子1 -
增加CpG基元的汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫作用
以往的研究表明非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为基元构成的特定结构是一种很有希望的候选疫苗佐剂.为了研究增加CpG基元的汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫作用,在本实验中,将重组真核表达质粒pcDNA3.1+S(ISS)直接肌注免疫BALB/c小鼠,分别用ELISA法检测血清特异性抗体的变化,MTT法检测T细胞增殖反应,以及用ELISA kt检测免疫鼠脾细胞上清液中细胞因子IL-4和IFN-γ的动态变化,从而了解免疫鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应.结果显示pcDNA3.1+S(ISS)接种组的小鼠血清抗体水平、T细胞增殖反应以及细胞因子IFN-γ的产生水平较对照组pcDNA3.1+S和空载体pcDNA3.1+接种组的要高.而细胞因子IL-4较对照组却无明显变化.由此可见,增加CpG基元的质粒能够增强其所诱导的免疫反应,可用于那些需要借助强有力细胞免疫来清除病原体的疫苗研制中.
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IL-12基因对HIV-1核酸疫苗诱导的免疫应答的影响
研究白细胞介素-12(IL 12)基因对HIV-1核酸疫苗诱导免疫应答的影响,以探求治疗性HIV-1核酸疫苗的新策略.将pCI-neoGAG联合白细胞介素-12基因或者pCI-neoGAG单独免疫Balb/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ,通过MTT实验检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖实验,通过乳酸脱氢酶(LDH)实验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合白细胞介素-12基因免疫组小鼠血清的抗HIV-1p24抗体滴度降低,有显著性差异(P＜0.01);而与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合白细胞介素-12基因免疫组小鼠血清的IFN-γ升高,有显著性差异(P＜0.01);pCI-neoGAG联合白细胞介素-12基因免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高于pCI-neoGAG免疫组,有显著性差异(P＜0.01).因此,白细胞介素-12基因基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠,可能增强特异性Th1细胞和CTL反应,白细胞介素-12基因对体液免疫有抑制作用.
关键词： 人免疫缺陷病毒(HIV) 核酸疫苗 白细胞介-12 免疫 -
IL-18 DNA免疫对HIV-1核酸疫苗诱导的免疫应答的影响
为了研究白细胞介素-18(IL-18)基因对人免疫缺陷病毒(HIV-1)核酸疫苗诱导免疫应答的影响,将人IL-18基因插入到真核表达载体pVAX1中,构建了真核表达载体pVAX1-IL-18;将pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18或者pCI-neoGAG单独免疫Balb/c小鼠,检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ,同时观察免疫小鼠脾淋巴细胞增殖和小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.酶切及测序结果表明成功地构建了人IL-18基因真核表达载体;与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的抗HIV-1p24抗体滴度降低(P<0.01);而与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的IFN-γ升高(P<0.01);pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高于pCI-neoGAG免疫组(P<0.01).IL-18基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠,可能增强特异性Th1细胞和CTL反应,白细胞介素-18基因对体液免疫有抑制作用.
关键词： HIV-1 核酸疫苗 白细胞介素-18(IL-18) 免疫 -
重组人乳头瘤病毒核酸疫苗诱导特异性淋巴细胞增殖
采用分子克隆技术,将人乳头瘤病毒16型E7(HPV 16 E7)基因重组于真核表达载体上,构建了HPV 16 E7核酸疫苗.将该疫苗通过皮内注射方式免疫Balb/c纯系小鼠.基因免疫后制备小鼠脾淋巴细胞悬液,经体外E7蛋白再次刺激后用MTT比色法检测出了特异性淋巴细胞增殖反应.由于特异性淋巴细胞增殖是反映细胞免疫功能的简便有效方法,所以本实验表明HPV 16 E7核酸疫苗构建正确,并能够诱导机体产生特异性细胞免疫应答.
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preS2S/adw真核表达质粒构建及其表达的初步研究
目的:针对我国乙型肝炎(乙肝)病毒流行的血清型,采用美国药品及食物鉴定委员会承认的应用于疫苗临床使用的载体pVAX1,构建乙肝病毒adw血清型核酸疫苗preS2S的真核表达质粒,对其在真核细胞中的表达进行初步研究.方法:采用PCR法扩增preS2S片段, 插入pVAX1载体中,测定DNA序列后,转染SP2/0细胞.抽提转染后SP2/0细胞的总RNA,再用RT-PCR法扩增其中的preS2 S片段,以检测其表达的基础.结果:测序证实了该片段为乙肝病毒adw型preS2 S基因.PCR扩增法检测出的转染细胞中存在preS2S基因.结论:获得了adw血清型乙肝病毒preS2S的真核表达质粒,提示其能够在真核细胞中表达目的基因蛋白.
关键词： 乙型肝炎 核酸疫苗 真核表达载体pVAX1 -
胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗的构建和体外转染
目的探索胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗的构建,以进一步研究对胰腺癌的治疗作用.方法首先对VNTR编码基因进行了重组设计,氨基端插入人单核细胞趋化蛋白Ⅰ信号肽基因序列,起始码前插入KOZAK促真核翻译序列.将人工合成的重组人VNTR基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Myc-his(+) A质粒的MCS中.将通过测序鉴定的含有准确插入序列的pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+) A重组质粒转染COS7细胞,进行体外转染实验和Western blot检测VNTR在细胞内外的表达.结果自转化平板筛选的阳性克隆通过测序鉴定,pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+) A重组质粒含有完整的阅读框架和目的基因.重组质粒可在COS7细胞内外表达VNTR,以胞内为主.所表达的VNTR分子量比人工合成的VNTR多肽大.结论自行构建的胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗序列准确,可在哺乳动物细胞中表达VNTR.
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免疫增强型胰腺癌MUC1-VNTR-C144 DNA疫苗的构建
目的 构建免疫增强型胰腺癌MUC1-VNTR-C144 DNA疫苗.方法 在PeDNA 3.1-VNTR/Myc-his(+)A质粒靶基因之后插入乙型肝炎病毒核心抗原C144基因,构建MUC1-VNTR-C144 DNA疫苗.45只C57BL/6小鼠随机分3组,VC组接种PeDNA 3.1-VNTR-C144/Myc-his(+)A质粒,V组单纯接种PeDNA 3.1-VNTR/Myc-his(+)A质粒,C组单纯接种pcDNA3.1-C144/Myc-his(+)A质粒.4周后加强免疫1次.结果 VC组小鼠脾细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的特异性杀伤率(46.7±8.2)%显著高于V组(34.8±3.1)%和C组(12.9±1.2)%(E/T=80/1,P<0.01).而CTL对未经VNTR合成肽孵育的靶细胞EIA-VNTR杀伤率较低(P<0.01),VU 3C6可抑制CTL对经VNTR合成肽孵育的靶细胞EIA-VNTR+的杀伤活性(P<0.01),表明具有VC组诱生的CTL应答依然保持VNTR特异性.VC组小鼠血清抗VNTR抗体等效浓度(2810.2±308.3)mg/L高于V组(2323.5±238.3)mg/L和C组(2130.9±138.5)mg/L,差异有统计学意义(P<0.01).结论 增强型胰腺癌MUC1-VNTR-C144 DNA疫苗所诱生的VNTR特异的CTL应答和抗体应答显著增强.
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联合应用VP3和IL-18及HN基因对喉癌细胞抑制效应的研究
目的:探讨核酸疫苗pVVP3IL-18HN对Hep-2肿瘤细胞的杀伤机制和对荷瘤动物模型肿瘤的抑制效应.方法:采用脂质体介导法将核酸疫苗pVVP3IL-18HN体外转染Hep-2细胞,运用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色从细胞形态学角度观察肿瘤细胞的死亡方式,并进一步运用流式细胞仪(FCM)检测肿瘤细胞线粒体跨膜电位、活性氧水平和主要组织相容性复合体I类分子(MHC-I)表达情况.在C57BL/6小鼠右后肢皮下接种H22肿瘤细胞2×105个,荷瘤第7、14和21天,瘤内注射pVVP3IL-18HN,同时设pVVP3、pVIL-18、PVHN和空白对照组,计算抑瘤率,并检测细胞毒T淋巴细胞活性.结果:pVVP3IL-18HN转染可使Hep-2肿瘤细胞皱缩被AO/EB浓染,并上调肿瘤细胞活性氧水平和MHC-I分子表达,下调线粒体跨膜电位;对荷瘤小鼠模型肿瘤的抑瘤率为60.5%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论:pVVP3IL-18HN主要通过诱导细胞凋亡杀伤喉癌细胞,并对实体肿瘤有显著的抑制作用.
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汉坦病毒核酸疫苗的研究进展
汉坦病毒引起肾综合征出血热,是我国重点防治疾病之一.针对汉坦病毒M和S片段的核酸疫苗对预防肾综合征出血热具有显著效果,具有广阔的应用前景.
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核酸疫苗的研究进展
核酸疫苗是利用病原的保护性抗原构建真核表达质粒,再将质粒DNA导入机体细胞,使外源基因借助于机体内源性表达系统表达并提呈给宿主免疫系统,诱导产生特异性的免疫应答反应的新型基因工程疫苗.1.3.1 Kodi血凝素lli等文中构建了编码H5N1人流感分离株A/HK/156/97血凝素的核酸疫苗,动物实验表明该疫苗诱导小鼠产生了抗H5N1感染的免疫反应,对在血凝素第154位没有糖基化位点的人A/HK/156/97(H5N1)病毒和在血凝素第154位具有糖基化位点的鸡A/Ck/HK/156/97(HSN1)病毒均具有抗性[11].DNA免疫还具有高度安全稳定,不受宿主种属特性及免疫状态限制和不干扰血清学调查的特点,而且DNA疫苗接种还被认为是消灭和控制流感大流行的一种快速、有效的方法[12].
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帕金森病的免疫治疗研究进展
帕金森病的发病机制尚不完全清楚,目前还没有根本有效的药物治疗.近年来免疫治疗在帕金森疾病的治疗方面显示出良好的前景.免疫治疗主要通过三个方面:一是α-突触核蛋白抗体的被动免疫治疗；二是依赖T淋巴细胞的疫苗免疫治疗；三是核酸疫苗主动免疫治疗.
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日本血吸虫pcDNA3.1(+)/MLP核酸疫苗诱导家兔免疫应答的初步检测
目的初步检测日本血吸虫pcDNA3.1(+)/MLP(SJP)核酸疫苗是否诱导家兔免疫应答的产生.方法将24只新西兰家兔随机分为2组,每组12只;实验组每只家兔SJP的免疫剂量为500 μg/次,后腿肌肉注射,对照组注射空质粒pcDNA3.1(+),隔周免疫1次,共4次;于0周、8周、16周采血2 mL,制备血清,做环卵沉淀反应,并做血清抗体及细胞因子分析.结果实验组环卵沉淀反应0周结果阴性,第8、16周结果阳性,对照组家兔环卵沉淀反应结果阴性,实验组可诱导IgA、IgG1变化,诱生INF-γ应答.结论 SJP核酸疫苗免疫家兔可产生体液免疫及细胞免疫.
关键词： 日本血吸虫 核酸疫苗 免疫应答 家兔 pcDNA3.1(+)/MLP(SJP)
