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登革病毒核酸疫苗
由登革病毒(Dengue Virus,DEN)感染引起登革热是一种重要的虫媒病毒病,近年来从范围上和程度上都有扩大的趋势.目前世界上还没有有效的治疗药物和有效的抗四个血清型DEN病毒的四价疫苗,但随着分子生物学技术的发展和对登革病毒基因组结构、功能的了解日趋深入,使得核酸疫苗成为一个新的选择.
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猪endoglin胞外段真核表达载体的构建及其诱导抗小鼠自身endoglin抗体的实验研究
目的分别扩增猪和小鼠endoglin胞外段cDNA,构建真核表达载体作为DNA疫苗,了解猪endoglin DNA疫苗是否能够在小鼠体内诱导产生抗小鼠endoglin的自身抗体.方法利用RT-PCR技术,从猪和小鼠胚肝中分别扩增出猪和小鼠的endoglin胞外段,用内切酶消化后分别将其插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后,体外转染真核细胞COS-1,用RT-PCR和免疫印迹鉴定是否能正确表达.然后大量扩增和提取相应质粒,将这些质粒作为DNA疫苗,肌注免疫小鼠,通过ELISA、免疫印迹和ELISPOT测定抗自身endoglin的抗体和脾脏中分泌特异性抗endoglin抗体的B淋巴细胞.结果琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定证实RT-PCR扩增的cDNA及构建的重组真核表达质粒正确,重组的真核表达质粒能在COS-1细胞中正确表达,猪endoglin胞外段真核质粒DNA疫苗免疫小鼠可以诱导产生抗小鼠endoglin的自身抗体.结论重组猪endoglin胞外段真核表达载体可作为DNA疫苗用于抗肿瘤血管生成的基因治疗.
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SARS S603-620表位核酸疫苗诱导BLAB/c小鼠产生特异性体液免疫应答
目的 构建SARSS抗原的B细胞表位核酸疫苗并观察其免疫效果.方法 将已经鉴定的SARS S抗原的B细胞表位S603-620的编码DNA序列插入真核表达载体PCI中,构建核酸疫苗(PCI-S603-620).使用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切,电泳及DNA测序鉴定.使用脂质体将PCI-S603-620转入293A细胞,使用ELISA检测其在真核细胞中的表达.使用PCI-S60-620免疫小鼠,ELISA检测其诱导的抗体情况.结果 对PCI-S603-620进行酶切鉴定,电泳结果表明目的基因片段分子量为100 bp左右.PCI-S603-620的DNA测序结果表明其序列与设计序列吻合.PCI-S603-620能在转染的293A细胞中表达.PCI-S603-620免疫小鼠可以诱导特异性抗体产生,效价为1∶400.该抗体可以特异性识别SARS S抗原.结论 成功构建SARS S抗原的B细胞表位核酸疫苗(PCI-S603-620).
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恙虫病东方体Karp株核酸疫苗的构建及其免疫功能初步研究
目的 构建恙虫病东方体Karp株Sta56抗原候选核酸疫苗并初步探讨其可能诱导的免疫功能.方法 从连有恙虫病东方体Karp株编码56000 u表膜蛋白基因开放读码框全长的T载体质粒pMD18/Sta56中双酶切出目的基因,定向亚克隆构建核酸疫苗质粒载体pVAX1-Sta56,转染Hela细胞,Western Blot分析Sta56蛋白的表达及其免疫原性,转染L929细胞,接种恙虫病东方体,Giemsa染色细胞内恙虫病东方体数目比较,初步探讨pVAX1-Sta56可能诱导的细胞免疫现象.结果 pVAX1-Sta56连有正确读码框架的Sta56全长基因.转染有pVAX1-Sta56的Hela细胞培养上清可检测到被兔抗恙虫病东方体Karp株抗血清识别的特异条带.转染有pVAX1-Sta56的L929细胞内恙虫病东方体数目显著少于转染pVAX1的L929细胞(P＜0.01).结论 成功构建能够表达Sta56表膜蛋白抗原的核酸疫苗载体pVAX1-Sta56,并能诱导产生细胞免疫功能.
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核酸疫苗的研究和开发进展
从基因治疗领域发展起来的核酸疫苗,能将编码抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内,通过宿主表达系并诱导对该抗原的免疫应答.相对于传统疫苗,核酸疫苗具有许多优越性.它类似于天然感染过程,诱导机体产生全面的免疫应答,尤其是能诱导特异的CTL活性,有利于清除病毒等胞内感染、变性的肿瘤细胞等,用作治疗性疫苗其优越性更显突出.核酸疫苗具有便于改进,易于制备,价格低廉,保存方便等优点.
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血管内皮生长因子2型受体胞外1～3区核酸疫苗的构建及对H22肿瘤生长的抑制作用
背景与目的:大多数实体肿瘤的生长转移都需要新生血管的支持,血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF)在肿瘤的血管生成中居中心地位,而 flk1(fetal liver kinase 1)是 VEGF发挥作用的关键.阻断 VEGF同 flk1的结合可望达到抑制肿瘤生长的目的.我们构建了小鼠 flk1胞外 1～ 3区核酸疫苗,并检验疫苗对肝癌细胞 H22小鼠移植瘤生长的抑制作用.方法: RT-PCR法克隆 flk1胞外 1～ 3区基因片段,将片段插入质粒 pcDNA3.1(+ ),构建核酸疫苗 pcDNA3.1(+ ) flk1-Domain1-3;脂质体转染 COS7细胞, Western blot法检测 flk1-Domain1-3的真核表达;采用标准 4 h 51Cr释放实验检验疫苗免疫小鼠特异性 CTL. 30只小鼠分为疫苗接种组 ,pcDNA3.1(+ )接种组和生理盐水接种组.股四头肌肌肉丰厚处接种 10天后再皮下接种 H22细胞,记录肿瘤的生长情况、体积、湿重、微血管密度、小鼠死亡时间,观察疫苗对小鼠 H22皮下移植瘤生长的抑制作用.结果: PCR扩增出 1 252 bp大小的基因片段,测序证明所获基因序列阅读框架与 GenBank所公布的 flk1胞外 1～ 3区一致. Western blot显示转染疫苗的细胞中有分子量约为 44 kDa的蛋白表达,与 flk1胞外 1～ 3区蛋白大小一致; 51Cr释放实验提示 ,疫苗可引起针对内皮细胞的特异性 CTL反应.疫苗对肿瘤的预防作用实验发现,肿瘤出现时间疫苗组为( 5.2± 0.9)天,空质粒组为( 4.0± 0.7)天,生理盐水组为( 3.8± 0.6)天;小鼠生存时间疫苗组为( 24.5± 3.2)天,空质粒组为( 14.7± 2.6)天,生理盐水组为( 14.3± 2.0)天;微血管密度疫苗组为 10.1± 1.7,空质粒组为 27.3± 3.3,生理盐水组为 25.3± 4.6;肿瘤湿重疫苗组为( 1.4± 0.1) g,空质粒组为( 1.8± 0.2) g,生理盐水组为( 1.8± 0.2) g;疫苗组各项指标与空质粒组和生理盐水组比较差异具有显著性( P< 0.05);空质粒组和生理盐水组各项指标比较差异无显著性( P >0.05).结论: pcDNA3.1(+ )-flk1-Domain1-3可以引起针对内皮细胞的特异性 CTL反应,通过杀伤内皮细胞,抑制血管生成对 H22细胞小鼠移植瘤的生长产生较强的延缓作用.
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pVAX1-IL4/SYN-B核酸疫苗对鱼藤酮慢性帕金森病小鼠的治疗作用
目的 探讨优化人α-突触核蛋白(human α-synuclein,hα-syn)核酸疫苗pvAX1-IL4/SYN-B对鱼藤酮慢性帕金森病小鼠的治疗效果.方法 采用鱼藤酮1 mg/kg给予背部皮下注射,1次/d,连续注射40 d,建立慢性帕金森病小鼠模型.建模后小鼠随机分为3组:核酸疫苗组、空质粒组、PBS组(n=8).于小鼠双侧后肢胫前肌部位,分别注射pVAX1-ILA/SYN-B核酸疫苗,空质粒pVAX1-PBS各100μL,共免疫3次,每次间隔3周.末次免疫后2周,观察小鼠行为学变化;免疫组化方法检测小鼠脑黑质致密部α-syn表达和酪氨酸羟化酶阳性细胞数目变化:RT-PCR检测α-syn mRNA表达情况.结果 行为学观察各组小鼠自由活动实验显示,核酸疫苗组与空质粒组及PBS组小鼠移动格子数和下肢站立次数均有明显改善(P<0.05).免疫组化检测发现核酸疫苗组小鼠与空质粒组、PBS组相比,TH阳性细胞数增加51.43%、59.00%(P<0.05),α-syn表达减少45.64%、43.28%,(P<0.05).RT-PCR检测发现核酸疫苗组α-syn mRNA表达水平(0.37±0.17)较空质粒组(0.80±0.01)及PBS组(0.74±0.05)明显减少(P<0.05).结论 hα-syn核酸疫苗有较强改善帕金森病小鼠行为学的作用;能有效改善鱼藤酮神经毒素对黑质多巴胺能神经元的损害,能对帕金森病小鼠产生较好的免疫治疗作用.
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葎草花粉变应原核酸疫苗通过诱导Foxp3+Treg细胞分化介导对哮喘模型小鼠的免疫保护作用
目的：构建葎草花粉变应原核酸疫苗pcDNA3.1-Hum，并探讨其是否通过诱导Foxp3+Treg细胞分化介导对哮喘模型小鼠的免疫保护作用。方法双酶切pTripIEx2-Hum质粒以获取目的基因，定向插入pcDNA3.1(-)载体以构建pcDNA3.1-Hum核酸疫苗并测序鉴定，转染至COS-7细胞以证实其表达。采用表达的目的蛋白刺激CD4+CD25-T细胞，验证其能否诱导Foxp3+Treg细胞分化。使用pcDNA3.1-Hum免疫正常小鼠，检测特异性IgE、IgG2a水平以探讨其免疫原性、变应原性；免疫哮喘模型小鼠以验证其免疫保护作用。结果测序证实该构建成功并可在真核细胞内表达；证实表达的目的蛋白可诱导CD4+CD25-T细胞向Foxp3+Treg细胞分化。动物实验提示pcDNA3.1-Hum可诱导特异性IgG2a，不能诱导特异性IgE；可明显降低哮喘模型小鼠气道炎症反应、气道高反应性；升高脾脏Foxp3+Treg细胞百分比；降低IL-4、升高IFN-γ水平。结论成功构建了pcDNA3.1-Hum核酸疫苗，表达的目的蛋白可介导Foxp3+Treg细胞分化。动物实验证实该疫苗具有免疫原性及免疫保护作用，并提示其通过诱导Foxp3+Treg细胞分化介导Th1倾向的免疫保护作用。
关键词： 变应性哮喘 葎草花粉变应原 核酸疫苗 免疫原性 Foxp3+Treg细胞 -
不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因真核质粒的保护性研究
目的:探讨不可分型流感嗜血杆茵(nontypeable Haemophilus influenzae,NTHi)外膜蛋白P6(outer membrane protein P6,P6)真核质粒的免疫保护性及其可能的保护机制.方法:构建pcDNA3.1/HisA-P6核酸疫苗,转染HeLa细胞;将P6质粒免疫BALB/c小鼠后,ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞IFN-γ和IL-4产生水平:CCK-8法分析脾淋巴细胞增殖情况,并建立小鼠NTHi感染模型,检测小鼠鼻咽部灌洗液NTHi数目变化:HE染色法分析鼻黏膜病理变化.结果:pcDNA3.1/HisA-P6在HeLa细胞中有目的蛋白的表达,免疫后pcDNA3.1/HisA-P6组小鼠脾淋巴细胞产生的IFN-γ及刺激指数均高于pcDNA3.1/HisA、PBS对照组(P<0.05).而IL-4的表达无差异;P6组鼻咽部NTHi清除率也显著高于对照组(P<0.01);病理显示P6组小鼠鼻黏膜组织结构基本正常,而时照组鼻黏膜紊乱、脱落.讨论:P6核酸疫苗可诱导小鼠产生明显的抗NTHi保护效应,其可能的保护机制包括细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫.
关键词： 不可分型流感嗜血杆菌 外膜蛋白P6 核酸疫苗 保护性免疫 -
结核杆菌HSP65与汉坦病毒H8205株G2基因的构建
目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65和汉坦病毒G2重组融合基因为基础的核酸疫苗.方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中,扩增出HSP65的编码基因,从T-H8205G2质粒扩增出G2蛋白的编码基因,经相应限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1/His,并将此重组质粒通过酶切、SDS-PAGE分别测定表达产物的相对分子量.结果 获得正向插入的pcDNA3.1/His-HSP65-G2重组表达质粒,与理论预期大小一致.结论 以编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功,为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定了基础.
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抗弓形虫感染ROP2核酸疫苗的研究
目的研究弓形虫核酸疫苗,以用于弓形虫病的防治. 方法根据ROP2基因序列,设计合成能表达ROP2完整蛋白基因的扩增引物,扩增ROP2靶基因并克隆于PUCm-T载体,然后再亚克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,制备弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗;应用裸pc-DNA3-ROP2免疫小鼠,通过免疫学指标的检测,评价小鼠的免疫应答反应,后应用弓形虫RH株攻击实验,评价出该疫苗的有效保护率、安全性和在人类及畜类的应用价值. 结果以ROP2基因为模板,PCR扩增出1.7kb DNA条带,与预想结果一致;将扩增DNA回收并成功的克隆了ROP2(PUCm-T-ROP2),然后亚克隆并构建了pc-DNA-ROP2重组体,通过酶切、PCR扩增和基因测序证明亚克隆的重组子正确,ROP2扩增基因包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列;在应用疫苗免疫接种小鼠结果显示,疫苗接种能使小鼠产生强烈的细胞、体液免疫反应;攻击实验结果显示,实验组小鼠的存活时间明显延长,并且开始死亡时间明显延迟(P＜0.001),实验组9只小鼠中有1只长期存活;在实验的整个过程中,没有发现小鼠对免疫接种的毒性和异常反应.结论该疫苗免疫原作用强,具有很好的开发应用价值,目前可在动物群体中试验应用.
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日本血吸虫Sj31核酸疫苗联合IFN-γ重组质粒诱导小鼠保护性免疫的研究
目的探讨干扰素-γ重组质粒对日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗在小鼠抗血吸虫作用的影响.方法将小鼠干扰素-γ基因PCR扩增片段克隆入真核表达载体pCDNA3.1以构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-IFN-γ,并与日本血吸虫组织蛋白酶B真核表达质粒VR1012-Sj31一同免疫小鼠.小鼠分为4组,其中实验组每鼠同时肌注VR1012-Sj31及pCDNA3.1-IFN-γ各100μg,3个对照组分别为VR1012-Sj31肌注100g,pCDNA3.1-IFN-γ肌注100μg和载体VRI012及pCHAN3.1肌注各100μg.共免疫3次,每次间隔2周.于末次免疫后两周免疫组化检测表达质粒在小鼠肌细胞的表达,于末次免疫后3周经小鼠皮肤攻击感染40±1条日本血吸虫尾蚴.45d后杀小鼠计算减虫率. 结果VR 1012-Sj31及pCDNA3.1-IFN-γ均在小鼠肌细胞表达,日本血吸虫Sj31核酸疫苗联合IFN-γ重组质粒免疫可诱导小鼠产生27.37%的减虫率,与日本血吸虫Sj31核酸疫苗单独免疫组比较减虫率显著(P＜0.05). 结论IFN-γ表达质粒能增强日本血吸虫组织蛋白酸B核酸疫苗的抗日本血吸虫的作用.
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日本血吸虫核酸疫苗pcDNA3.1/SjMf1粘膜免疫小鼠的保护力研究
目的探讨日本血吸虫核酸疫苗pcDNA3.1/SjMf1粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染的保护力. 方法按常规方法构建pcDNA3.1/SjMfl.粘膜免疫采用滴鼻方法.供试小鼠随机分为5组,每组12只,包括MPL、pcDNA3.1、pcDNA3.1+MPL、pcDNA3.1/SjMfl和pcDNA3.1/SjMfl+MPL组.第3次免疫后2周,每只经腹部感染(40±1)条尾蚴.45d宰杀小鼠,以观察减虫率和减卵率.在初次免疫前和攻击感染前尾静脉采血的收集粪便,ELISA检测血清内特异性IgA和IgG及粪内sIgA水平. 结果pcDNA3.1/SjMfl滴鼻免疫可诱导小鼠血清内特异性IgA和IgG及粪内sIgA水平.poDNA3.1/SjMfl和pcDNA3.1/SjMfl加MPL滴鼻免疫诱导小鼠产生的减虫率分别为27.97%和34.75%,减卵率分别为38.64%和43.37%.二者的减虫率和减卵率差异无显著性(P＞0.05). 结论pcDNA3.1/SjMfl滴鼻免疫可诱导小鼠产生全身和粘膜免疫应答及部分抗击感染的保护力.
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我国弓形虫病核酸疫苗研究概况
刚地弓形虫(简称弓形虫)呈世界性分布,哺乳动物及鸟类普遍易感.人类对弓形虫有较强的自然免疫力,感染后绝大多数无明显症状表现,或只出现亚急性弓形虫病.但在孕妇及免疫功能低下者(如ADIS病、器官或组织移植后接受免疫抑制剂治疗的病人等)感染弓形虫后引起的危害严重.人体弓形虫感染日益受到关注,弓形虫病疫苗成为当前研究的热点.动物实验发现,弓形虫全虫疫苗,弓形虫特异抗原组分疫苗有预防弓形虫感染或降低感染度作用,但前者可能会引起再感染,后者的免疫保护效果较差.弓形虫病核酸疫苗克服了上述疫苗存在的不足,具有良好的开发应用前景.我国从上世纪90年代后期开始了弓形虫病核酸疫苗的研制,通过对表达保护性抗原蛋白基因进行重组,先后研制出弓形虫基因单价疫苗、复合疫苗和混合疫苗.动物实验证明部分疫苗具有良好的免疫预防效果.
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乙型肝炎核酸疫苗研究进展
全世界大约有3.5亿的慢性HBV携带者[1],慢性乙型肝炎的防治研究一直是肝病研究的重大课题.干扰素能使部分患者有持续性反应[2],拉米呋啶能迅速抑制病毒复制,但是停药易反跳,用药后导致变异株的产生[3],两种药物治疗均使病毒进入低复制状态.因此,为了治愈乙型肝炎,需要探索其他的治疗途径.近年来,由于基因重组技术的发展与应用,使得利用核酸疫苗来治疗慢性HBV感染成为研究的热点[4].本文对目前乙肝核酸疫苗研究情况作一综述.
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白细胞介素-15重组体对HBsAg核酸疫苗的免疫佐剂作用
白细胞介素-15(IL-15)属螺旋结构细胞因子家族,它能促进T细胞、自然杀伤(NK)细胞和B细胞增殖及分化;具有诱导淋巴细胞产生γ干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子α的作用.lL-15 与疫苗共同免疫时可刺激抗体产物增加,细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性加强.将IL-15表达质粒与HBsAg DNA疫苗共同免疫小鼠,以观察其对小鼠免疫应答的影响.
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新型乙型肝炎病毒核心区核酸疫苗的免疫原性研究
目的观察新型乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)核酸疫苗的免疫原性.方法应用新型人体应用载体质粒pSW3891构建HBcAg核酸疫苗(pSW3891/HBc),对照组和实验组Balb/c小鼠分别以基因枪法免疫对照载体质粒(pSW 3 8 91)和HBcAg核酸疫苗,采用酶联免疫吸附试验检测抗-HBc,乳酸脱氢酶(LDH)释放测定法检测小鼠HBcAg特异性CTL杀伤活性.结果 HBcAg核酸疫苗可在体外293T细胞中高效表达,免疫小鼠后可产生高滴度抗-HBc(1:97200),免疫鼠脾细胞HB c特异性CTL杀伤活性达7 3.2 5%,结论新型HBcAg核酸疫苗在Balb/c小鼠实验中表现出良好的体液和细胞免疫原性.乙型`免疫原性.
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丙型肝炎病毒核酸疫苗NV-HC/NS3的免疫预防和治疗效应研究
目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核酸疫苗NV-HC/NS3接种BALB/c小鼠后，对相应靶抗原攻击的特异性免疫预防和治疗效应。方法以HCV核酸疫苗NV-HC/NS3接种BALB/c小鼠，分别在疫苗接种前后种植能表达靶抗原的BALB/c小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，观察疫苗接种对肿瘤生长及小鼠寿命的影响。结果种植肿瘤前先接种NV-HC/NS3的小鼠，荷瘤阻抑率达40％；长出肿瘤的小鼠与未接种疫苗的对照组小鼠相比，生存时间延长，生存率提高。先荷瘤后免疫的小鼠，核酸疫苗的接种则能提高小鼠的生存率。结论 NV-HC/NS3能诱导小鼠产生针对靶抗原的特异性免疫应答，发挥预防甚至治疗效应。
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血吸虫病疫苗的研究进展
目的:为血吸虫病疫苗的研发提供参考.方法:根据文献,综述了蛋白质疫苗、核酸疫苗和混合疫苗共3类血吸虫病疫苗的研究现状.结果:蛋白质疫苗候选抗原分子主要包括副肌球蛋白、谷胱甘肽转移酶、钙离子激活蛋白激酶、磷酸丙酮异构酶等,核酸疫苗包括脱氧核糖核酸(DNA)疫苗和核糖核酸(RNA)疫苗,混合疫苗包括蛋白(重组蛋白和表位肽)的混合疫苗、DNA的混合疫苗、蛋白与DNA的混合疫苗.结论:寻找新的有效的候选疫苗抗原基因或通过优化组合新杭原分子以提高免疫保护效果,是当前血吸虫病研究的一个重点.基因组学与蛋白组学研究的快速发展及其在血吸虫领域研究的广泛应用,将使血吸虫病疫苗研究呈现更大的发展空间.
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pVAX1-IL-4/SYN-B核酸疫苗对帕金森病模型小鼠纹状体神经营养因子表达的影响
目的 探索预防注射pVAX1-IL-4/SYN-B核酸疫苗对1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的慢性帕金森病模型小鼠纹状体神经营养因子表达的影响,进一步探讨核酸疫苗神经保护作用的具体机制.方法 48只C57BL/6雄性小鼠完全随机分为4组:正常对照组、空质粒组、PBS组和核酸疫苗组,每组12只;分别肌注PBS、空质粒、PBS和pVAX1-IL-4/SYN-B核酸疫苗,然后给予后3组小鼠注射MPTP建立慢性帕金森病模型.采用自由活动实验观察小鼠行为学变化;Westem blot、免疫组化检测纹状体区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表达;Western blot检测小鼠纹状体胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)表达.结果 与PBS组和空质粒组比较,核酸疫苗组小鼠运动迟缓症状明显改善(P＜0.05),纹状体区GDNF、BDNF表达升高(P＜0.05),TH丢失明显减少(P＜0.05).结论 pVAX1-IL-4/SYN-B核酸疫苗预防免疫可增加慢性MPTP帕金森病模型小鼠纹状体区神经营养因子表达,具有一定的神经保护作用.
