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血清cccDNA在阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎中的临床意义
目的 探讨血清cccDNA在阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎(CHB)中的临床意义. 方法 选取81例CHB确诊患者,对所有病例的血清cccDNA进行检测,根据检测结果分为cccDNA阳性组和cccDNA阴性组,所有患者给予阿德福韦酯治疗口服(10mg/d),每24周随访一次,连续随访4次,治疗前及随访时检测HBV DNA、HBeAg及ALT等指标. 结果 cccDNA阳性与阴性两组患者的年龄及性别比较,差异无统计学意义(P＞0.05).两组在接受阿德福韦酯治疗的过程中,HBV DNA的中位数随着治疗时间的延长而下降,阴性组下降较阳性组明显.HBeAg变化,24周时两组与各自基线及两组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05),于48、72及96周,两组HBeAg与各自基线及两组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05);ALT变化,两组间在基线、24和48周时比较差异无统计学意义(P＞0.05),72及96周比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 随着阿德福韦酯治疗时间的延长,cccDNA阴性组的HBV DNA载量、HBeAg滴度及ALT下降较阳性组快,即阴性组应答高于阳性组,因而说明血清cccDNA能够预测阿德福韦酯的远期疗效.
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HBV cccDNA的检测及其意义
乙型肝炎病毒cccDNA在感染者肝内长期存在,并作为HBV复制的模板,成为根治乙型肝炎病毒感染的困难所在.因此,准确地检测肝内和/或血清HBV cccDNA的量对病情判断、疗效评估和预后均有重要的意义.本文就近年发展的检测HBV cccDNA的方法学作一介绍.
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乙型肝炎患者血清HBV cccDNA检测的临床意义
目的 观察乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccD-NA)在血清中的分布特点及与HBV感染状态的联系,探讨HBV cccDNA与患者病情的轻重、HBV的复制指标(HBeAg、HBV DNA)的关系. 方法 分别采用PCR荧光分子信标、荧光定量PCR、酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测162例乙型肝炎患者外周血清中HBV cccDNA定量、HBV DNA定量和乙型肝炎病毒标志物. 结果 162例乙型肝炎患者,血清HBV cccDNA阳性率为48.15%(78/62).HBV cccDNA阳性率在HBV DNA阳性患者中为60.94%(78/128),显著高于HBV DNA阴性者[0(0/34)](P<0.01);HBeAg阳性患者HBV cccDNA检出率为61.70%(58/94),显著高于HBeAg阴性者29.04%(20/68)(P<0.01);中、重度慢性乙肝患者HBV cccDNA检出率为58.97%,高于轻度慢性乙型肝炎患者(45.45%)(P<0.05).重型肝炎患者HBV cccDNA阳性者存活率(37.5%)明显低于HBV cccDNA阴性者(78.26%)(P<0.05). 结论 HBV cccDNA仅存在于血清HBV DNA阳性乙型肝炎患者外周血清中;HBV cccDNA检出率与外周血HBV复制指标(HBeAg、HBV DNA)有显著的相关性,并与肝细胞炎症相关,是乙型肝炎病毒在患者体内大量复制及肝细胞损伤的血清标志.
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乙肝患者血清中HBV cccDNA荧光定量检测方法的优化
目的:通过实验验证并建立一种用荧光定量PCR技术准确检测血清中HBV cccDNA的方法,同时能够消除HBV rcDNA非特异性扩增的干扰.方法:用两步法提取20例乙肝患者血清中的total HBV DNA,分别用荧光PCR试剂盒定量检测HBV DNA和cccDNA.然后通过质粒保护型的DNA酶对提取的DNA模板进行消化处理,使rcDNA得到一定程度的降解后,再分别进行HBV DNA和cccDNA的定量检测.结果:未经过酶消化处理直接定量cccDNA时存在一定的非特异性扩增.这种非特异性扩增在HBV DNA含量>106 copies/ml时比较明显,消化前后cccDNA定量值的对数平均相差1.94.经过酶消化后的定量cccDNA值基本消除了rcDNA非特异性扩增的干扰.结论:通过质粒保护型的DNA酶降解rcDNA后再进行cccDNA检测是一个方便可行的解决cccDNA准确定量问题的方法,非特异性干扰几乎可以完全消除.血清cccDNA与HBeAg及HBV-DNA有关,提示它可能也是HBV复制的血清标志.乙肝患者血清中cccDNA的含量与total HBV DNA含量成正相关.
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乙型肝炎病毒cccDNA的临床检测研究进展
我国有约3 000万慢性乙型肝炎患者,每年需要近1 000亿元的治疗费用.虽然近年来乙型肝炎抗病毒治疗取得了一定进展,但治疗的疗程、停药后的复发等一系列问题,一直是困扰临床的难题.
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乙型肝炎病毒cccDNA研究动态
乙型肝炎病毒(HBV)生命周期中关键的一步是共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的形成.HBV cccDNA给病毒复制和前基因组mRNA的合成提供模板,与HBV在肝细胞中的持续感染及抗病毒治疗的复发有重要关系[1].本文就有关HBV cccDNA的研究现状作如下综述.
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荧光定量检测HBV cccDNA在慢性乙型肝炎患者中的应用
目的:研究慢性乙型肝炎患者HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)在外周血的分布、肝组织中含量及探讨抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者血清HBV cccDNA的影响.方法:随机选取HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者、肝硬化患者、重型肝炎患者共125例.使用实时荧光定量PCR法检测血清中cccDNA.选取36例慢性乙型肝炎患者肝组织和外周血样本,酶切后进行荧光定量PCR检测.60例慢性乙型肝炎患者,按1:1随机分配接受拉米夫定或干扰素治疗,所有患者均治疗24周以上;应用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测慢性乙型肝炎患者0周、8周、12周、24周、HBV cccDNA及HBV DNA含量.结果:125例患者中cccDNA阳性率为71.2%,以肝硬化患者阳性率低.肝硬化患者HBV cccDNA检出阳性率与慢性乙型肝炎患者及重型肝炎患者比较,差异有显著性意义(P＜0.05).肝组织中HBV cccDNA与肝组织总HBV DNA及血清HBV DNA存在相关性(P＜0.05),HBeAg阳性组与阴性组患者比较差异有显著性意义(P＜0.05).患者接受抗病毒治疗后血清HBV DNA及HBV cccDNA下降.结论:乙型肝炎肝硬化患者外周血HBV cccDNA阳性率低,慢性乙型肝炎患者中HBeAg(+)组病毒复制较HBeAg(-)组活跃.抗病毒治疗对血清HBV cccDNA有抑制作用;血清HBV cccDNA可作为抗病毒治疗的重要监测指标.
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乙型肝炎病毒cccDNA检测与血清学及病理诊断关系
目的 建立和应用聚合酶链反应法(PCR),检测慢性乙型肝炎患者肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA),探讨慢性乙型肝炎肝组织HBV cccDNA与乙型肝炎的血清学及病理关系.方法 分别采用PCR法检测慢性乙型肝炎惠者肝组织HBV cccDNA,同时用免疫组化法检测肝细胞中HBcAgPres1;荧光定量PCR法检测慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA载量;电发光化学方法检测慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒标志物.分析肝组织HBV cccDNA与血清HBV DNA载量、HBeAg、HBeAb,以及肝细胞内HBcAg、Pres1的关系.结果 ①127例慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA与血清HBV DNA载量呈正相关(P<0.01).②127例慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA阳性组与HBV cccDNA阴性组血清HBV DNA载量及肝细胞内HBcAg、Pres1无显著性差异(P>0.05).③HBV cccDNA阳性组的HBeAg检出率明显高于HBV cccDNA阴性组.HBV cccDNA阴性组的HBeAb检出率明显高于HBV cccDNA阳性组.结论 测定肝组织中HBV cccDNA,对于了解乙肝患者病情和传染性强弱以及评价肝脏炎症活动度有重要意义.
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慢性乙型肝炎免疫功能缺陷与抗病毒治疗现状
乙型肝炎病毒(HBV)感染人体后,特异性细胞免疫是发病的关键环节,细胞免疫应答低下是HBV持续感染的关键因素.目前抗病毒治疗存在持续应答率低、疗程长、病毒变异等一系列问题,主要原因是抗病毒药物只能抑制HBV复制,都不能彻底清除共价闭合环状DNA(cccDNA),也与患者免疫缺陷不能得到充分恢复有一定的关系.因此,抗病毒治疗过程中,如何发挥现有药物各自优点,同时提高患者的特异性细胞免疫功能,加强免疫介导的病毒清除,从而达到彻底清除HBVcccDNA 的目的 ,应成为关注的重点.
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慢性乙型病毒性肝炎抗病毒治疗方案的新探索
慢性乙型病毒性肝炎(CHB)是难治性疾病,由于乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)存在于受感染的肝细胞核中,目前两大类抗病毒药物:核苷(酸)类药物、干扰素,任何一类都不能完全清除乙型肝炎病毒,达到根治乙肝的目的,而仅能阻止疾病向肝硬化、失代偿性肝硬化、终末期肝病、肝癌、死亡进展,提高患者生活质量,延长生存期[1].因此,如何在现有药物的基础上积极探索有效的治疗方案成为目前研究的热点.基于联合治疗优于单药治疗已在HCV及HIV感染中得到证实,近年来许多专家学者提出了序贯/联合治疗的策略[2],本文对此作一综述.
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核苷(酸)类似物治疗慢性乙型肝炎患者发生耐药的研究进展及应对策略
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染作为全球严重的卫生问题,每年有近100万人死于乙型肝炎相关性疾病,如肝炎、肝硬化、肝癌等,目前认为对乙型肝炎患者有效的治疗是抗病毒治疗.抗病毒药物分为两大类:干扰素类和核苷(酸)类似物类,因为干扰素较为昂贵且不良反应较多,核苷(酸)类药物在临床上被更为广泛的应用.由于,HBV DNA感染人体后在肝细胞核内形成共价闭合环状DNA(cccDNA)并以其为模板不断进行复制,再加上cccDNA半衰期长,很难从体内彻底清除,因此为预防抗病毒治疗停药后病毒复制反弹需要延长治疗时间,而治疗时间的延长,随之而来的是对核苷类抗病毒药物耐药突变的发生,且用药时间越长耐药发生率越高.
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HBV cccDNA 检测的研究进展
自1965年Blumberg发现澳大利亚抗原(HBsAg)以来,病毒性乙型肝炎(viral hepatitis B)有了划时代的研究进展.病毒性乙型肝炎主要流行于亚洲、非洲、南部欧洲和拉丁美洲.全世界约20亿人有既往或持续感染HBV,慢性HBV感染者达3～3.5亿,其中15%～25%终死于肝衰竭、肝硬化或肝癌,年病死人数约100万;男女性病人的病死率分别约50%和15%.
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乙型肝炎病毒cccDNA检测的方法与临床意义
细胞外乙型肝炎病毒(HBV)DNA是一种松弛环状的双链DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)分子,其两条链均不是闭合的,其中负链较长,约3200个碱基,含有HBV基因组的全长基因,在其5′起始端与3′末端之间有一数个碱基的"缺刻"；正链较短,有较大的"缺口",其3′末端不固定,故长度是可变的,约为负链长度的50%～100%.在HBV的复制过程中,病毒DNA进入宿主细胞核,在DNA聚合酶的作用下,两条链的缺口均被补齐,形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子(covalently closed circular DNA,cccDNA).
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乙型肝炎病毒RNA病毒样颗粒的发现及其对抗病毒治疗临床实践的潜在影响
在感染肝细胞中的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA (cccDNA)是引起停药后病毒学反弹的主要因素.cccDNA的半衰期仅为33 ～ 50 d,故新合成的部分双链、松弛环状DNA (rcDNA)进入细胞核转换为cccDNA是维持cccDNA池的关键.虽然不直接靶向cccDNA,但通过阻断rcDNA的合成,现有的核苷(酸)类似物(NAs)存在使cccDNA池耗竭的可能性.确实,慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者在抗病毒治疗达到HBeAg血清转换,HBV DNA消失后,再巩固治疗半年以上,20％ ～ 30％的患者可以安全停药.我国一些课题组近已经证实血清中的HBV RNA来自感染肝细胞内cccDNA的活性转录,特别是在接受NAs治疗的慢乙肝患者,DNA合成被阻断后,其血清中的HBV RNA能反映肝细胞内cccDNA的状态.故此建议应将传统的基于病毒DNA检测的病毒学应答重新定义为血清HBV DNA和RNA的共同持续消失(低于检测下限),并以此作为安全停药的病毒学指标.血清HBV RNA是反映肝细胞内cccDNA活性的理想指标,因而,对接受长期NAs治疗后HBsAg水平＜1 500 IU/ml的慢乙肝患者,应依据血清HBV RNA的检测结果,换用或加用聚乙二醇干扰素(peg-IFN)治疗.如果血清HBV RNA阳性,则加用peg-IFN治疗;如果血清HBV RNA消失,应停止NAs治疗,并转为peg-IFN治疗.有理由相信,以血清HBVRNA指导的治疗策略,会进一步优化慢乙肝的功能性治愈(血清HBsAg消失甚至出现抗-HBs转换)路线图.
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HBx基因缺失突变对HBV复制和转录的影响
目的 构建HBx基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,研究HBx缺失对HBV复制和转录的影响.方法 以包含HBV全长基因组的野生型质粒pUC-HBV1.0为模板,用定点突变技术构建HBx基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,并酶切和DNA测序鉴定.用Sap Ⅰ单酶切这两种质粒,获得线性的野生型和HBx缺失突变型HBV基因组,经转染试剂PolyJetTM Reagent介导分别瞬时转染到HepG2细胞中.在转染后各时间点Western blot检测HBx蛋白的表达,Southern blot 和Real-time PCR同时检测细胞质DNA复制和细胞核cccDNA的合成,Real-time PCR分析定量HBV前基因组RNA(pgRNA)的转录.结果 在野生组中可检测到HBx蛋白的表达,而在HBx突变组中HBx蛋白的表达低于Western blot的检测范围.两组中各时间点合成的cccDNA水平无统计学差异(P＞0.05).而在转染后96 hHBx突变组中细胞质DNA的复制和pgRNA的转录都分别比野生组减少50％～70％ (P＜0.05).结论 HBx缺失虽然不影响细胞核HBV cccDNA的合成,但是它能下调细胞质HBV DNA的复制和pgRNA的转录.
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乙型肝炎共价闭合环状DNA的形成机制和影响因素
乙肝病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)是HBV持续存在的来源,研究cccDNA的形成机制以及影响因素对乙型肝炎的治疗十分重要.cccDNA的形成途径大致有三种:①部分双链的松弛环状DNA (rcDNA)在细胞质中去除负链上的DNA聚合酶蛋白从而形成DP-rcDNA,DP-rcDNA在核转运蛋白的介导下进入细胞核,在核内利用宿主的酶系统完成了cccD-NA的终形成,DNA聚合酶K(POLK)以及DNA连接酶参与其中.②细胞质中的线性双链DNA(dsl-DNA)去除负链上DNA聚合酶后形成DP-dslDNA,转运入细胞核内以后通过分子内的非同源重组合成cccDNA,Ku80参与其中.③细胞核内DP-rcD-NA形成一种末端重复的线性双链DNA(TR-dslDNA),TR-dslDNA经非同源重组形成cccDNA.
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对乙型肝炎病毒cccDNA的新认识
cccDNA(共价闭合环状脱氧核糖核酸)是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始合成模板,是乙肝病毒持续感染的关键因素.与外周血HBV(乙肝病毒)复制指标(HBeAg、HBVDNA)有显著的相关性,并与肝细胞炎症相关,检测HBVcccDNA可在一定程度上了解患者病情进展,确定治疗终点,对抗病毒药物疗效的判断.现今在美国已有7种药物被允许用于成人慢性乙肝的治疗,但均不能有效抑制HBV,目前以cccDNA为靶点的抗病毒药是我们的迫切需求.
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鸭肝组织中DHBV cccDNA的实时荧光定量PCR方法的建立
目的 建立基于DHBV病毒正、负链缺口区设计引物、沉淀蛋白结合的DNA、酶切消化残留线性DNA的DHBVcccDNA荧光定量PCR方法.方法 根据DHBV cccDNA和rcDNA结构的不同,将引物设计在DHBV DNA负链缺口的两侧.采用十二烷基硫酸钾蛋白质沉淀法分离肝组织中cccDNA和rcDNA.并对提取的DNA进行紫外定量,按照每2UPSAD消化500ng cccDNA,计算PSAD的用量,酶切消化残存的线性DNA.以pBR322/2DHBV Core重组质粒为PCR标准品,通过优化反应体系和扩增条件,建立检测DHBV cccDNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,并进行方法学考察和实际应用.结果 优化的PCR扩增产物电泳后可见239 bp的DNA片段,与目标片段长度相同.标准曲线回归方程Y=-4.085 7X+48.805,R2=-0.997 6.方法的灵敏度为103 copies/ml,线性范围可达103～108 copies/ml.方法特异性强,未检出DHV,HBV及E coli DNA.对已感染DHBV的鸭肝组织检测DHBV cccDNA,进行定量,含量从0.36～1733.08 copies/diploid genome.其中分布广的是10～99 copies/dioploid genome.DHBV cccDNA占总DHBV DNA的比例平均仅为3.86％,范围从0.01％～13.3s％.结论 根据DHBV cccDNA与rcDNA的结构和理化性质的差异,设计能够特异性扩增DHBV cccDNA的荧光定量PCR方法,方法灵敏度高、特异度强,可广泛应用于DHBV和HBV抗病毒治疗策略的相关研究中.
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HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA及HBsAg和HBV cccDNA相关性研究
目的 分析乙型肝炎(乙肝)病毒e抗原(HBeAg)阴性慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者血清乙肝病毒DNA (HBV DNA)、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒cccDNA的相关性,探讨CHB患者肝细胞内外与活动性肝炎有关的病毒学转变过程.方法 对南京第二医院64例未经治疗的HBeAg阴性的CHB患者均进行了肝穿刺获取肝组织样本.按照丙氨酸氨基转移酶＞80 U/L,HBV DNA＞100 000拷贝/ml诊断为活动性肝炎,否则为非活动性肝炎的标准分为两组.化学发光法检测血清HB-sAg,Taqman实时PCR法定量检测血清及肝组织中HBV DNA含量,同时检测肝组织中cccDNA.结果 血清HBV DNA和血清cccDNA明显相关(r=0.483,P＜0.01),和lg肝细胞内总cccDNA明显相关(r=0.723,P＜0.01).血清HBsAg和cccDNA及lg肝细胞内HBV DNA均没有明显的相关性.活动性HBeAg阴性的CHB患者的lg cccDNA及1g肝细胞内总HBV DNA,明显高于非活动性HBeAg阴性的CHB患者.活动性HBeAg阴性的CHB患者,乙肝病毒的复制效率(血清HBV DNA和cccDNA的比率)高出非活动性CHB患者20％以上.血清HBsAg水平及HBsAg与cccDNA的比率在两组患者间差异均无统计学意义.结论 HBeAg阴性的CHB患者,血清HBV DNA水平和cccDNA有明显的相关性,血清HBV DNA可以作为肝细胞内cccDNA含量的替代指标,代表着更高效的HBV复制效率.
关键词： HBV DNA cccDNA 乙型肝炎病毒表面抗原 肝穿刺
